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Um protocolo para quantificação citométrica de fluxo fluorescente de células cancerígenas senescentes induzidas por drogas quimioterápicas em cultura de células ou em modelos de tumores murinos é apresentado. Os procedimentos opcionais incluem co-imunocoloração, fixação de amostras para facilitar a análise de grandes lotes ou pontos de tempo e o enriquecimento de células senescentes viáveis por classificação citométrica de fluxo.
A senescência celular é um estado de parada proliferativa induzido por danos biológicos que normalmente se acumula ao longo de anos em células envelhecidas, mas também pode surgir rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer. A senescência das células tumorais é geralmente considerada indesejável, pois as células senescentes tornam-se resistentes à morte e bloqueiam a remissão do tumor, exacerbando a malignidade do tumor e a resistência ao tratamento. Portanto, a identificação de células tumorais senescentes é de interesse contínuo para a comunidade de pesquisa do câncer. Existem vários ensaios de senescência, muitos baseados na atividade do conhecido marcador de senescência, a beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal).
Normalmente, o ensaio SA-β-Gal é realizado usando um substrato cromogênico (X-Gal) em células fixas, com a enumeração lenta e subjetiva de células senescentes "azuis" por microscopia de luz. Ensaios aprimorados usando substratos SA-β-Gal fluorescentes e permeantes a células, incluindo C12-FDG (verde) e DDAO-Galactoside (DDAOG; vermelho-distante), permitiram a análise de células vivas e permitiram o uso de plataformas de análise fluorescente de alto rendimento, incluindo citômetros de fluxo. C12-FDG é uma sonda bem documentada para SA-β-Gal, mas sua emissão fluorescente verde se sobrepõe à autofluorescência celular intrínseca (FA) que surge durante a senescência devido ao acúmulo de agregados de lipofuscina. Ao utilizar a sonda SA-β-Gal DDAOG de vermelho distante, a autofluorescência celular verde pode ser usada como um parâmetro secundário para confirmar a senescência, adicionando confiabilidade ao ensaio. Os canais de fluorescência restantes podem ser usados para coloração de viabilidade celular ou imunomarcação fluorescente opcional.
Usando citometria de fluxo, demonstramos o uso de DDAOG e autofluorescência de lipofuscina como um ensaio de duplo parâmetro para a identificação de células tumorais senescentes. A quantificação da porcentagem de células senescentes viáveis é realizada. Se desejado, uma etapa opcional de imunomarcação pode ser incluída para avaliar antígenos de superfície celular de interesse. As células senescentes identificadas também podem ser classificadas citometricamente e coletadas para análise a jusante. As células senescentes coletadas podem ser imediatamente lisadas (por exemplo, para imunoensaios ou análise ômica) ou cultivadas posteriormente.
As células senescentes normalmente se acumulam em organismos ao longo de anos durante o envelhecimento biológico normal, mas também podem se desenvolver rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer, incluindo radiação e quimioterapia. Embora não proliferem mais, as células tumorais senescentes induzidas pela terapia (TIS) podem contribuir para a resistência ao tratamento e impulsionar a recorrência 1,2,3. Fatores secretados pelas células TIS podem exacerbar a malignidade tumoral, promovendo evasão imune ou metástase
Todo o trabalho com animais descrito foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.
1. Preparação e armazenagem de soluções-mãe
NOTA: Se as células forem classificadas por fluxo, todas as soluções devem ser preparadas usando técnicas estéreis e filtradas através de um dispositivo de filtro de 0,22 μm.
Vários experimentos foram realizados para demonstrar a comparabilidade do DDAOG com X-Gal e C12-FDG para a detecção de senescência por SA-β-Gal. Primeiramente, o X-Gal foi utilizado para corar células senescentes de melanoma B16-F10 induzidas por ETO (Figura 2A). Uma cor azul intensa se desenvolveu em um subconjunto de células tratadas com ETO, enquanto outras células exibiram coloração azul menos intensa. A morfologia foi aumentada na maioria das células tratadas com E.......
Na última década, a citometria de fluxo tornou-se uma plataforma de ensaio mais comum na pesquisa do câncer devido à popularidade emergente da imunologia tumoral, ao desenvolvimento de citômetros de fluxo de baixo custo e à melhoria das instalações de instrumentação compartilhadas em instituições acadêmicas. Ensaios multicoloridos são agora padrão, já que a maioria dos instrumentos mais recentes são equipados com matrizes ópticas violeta, azul-verde e vermelho a vermelho-distante. Assim, é provável qu.......
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar para este estudo.
Agradecemos ao Cytometry and Antibody Core Facility da Universidade de Chicago pelo apoio na instrumentação da citometria de fluxo. O Centro de Pesquisa Animal da Universidade de Chicago forneceu alojamento para animais.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bafilomycin A1 | Research Products International | B40500 | |
Bleomycin sulfate | Cayman | 13877 | |
Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A1380 | |
Calcein Violet 450 AM viability dye | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
DPP4 antibody, PE conjugate | Biolegend | 137803 | Clone H194-112 |
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma | American Type Culture Collection | CCL-185 | |
Cell line: B16-F10 mouse melanoma | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
Cell scraper | Corning | 3008 | |
Cell strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | |
DDAO-Galactoside | Life Technologies | D6488 | |
DMEM medium 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
DMSO | Sigma | D2438 | |
DNAse I | Sigma | DN25 | |
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
EDTA 0.5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
Etoposide | Cayman | 12092 | |
FBS | Omega | FB-11 | |
Fc receptor blocking reagent | Biolegend | 101320 | Anti-mouse CD16/32 |
Flow cytometer (cell analyzer) | Becton Dickinson (BD) | Various | LSRFortessa |
Flow cytometer (cell sorter) | Becton Dickinson (BD) | Various | FACSAria |
GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin/Streptomycin 100x | Life Technologies | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Corning | MT21031CV | Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium) |
Rainbow calibration particles, ultra kit | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 µm, 2E6/mL |
RPMI-1640 medium 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
Sodium chloride 0.9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Contact BD for license |
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" | TreeStar | n/a | Contact TreeStar for license |
Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
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