Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo

Resumo

Um protocolo para quantificação citométrica de fluxo fluorescente de células cancerígenas senescentes induzidas por drogas quimioterápicas em cultura de células ou em modelos de tumores murinos é apresentado. Os procedimentos opcionais incluem co-imunocoloração, fixação de amostras para facilitar a análise de grandes lotes ou pontos de tempo e o enriquecimento de células senescentes viáveis por classificação citométrica de fluxo.

Resumo

A senescência celular é um estado de parada proliferativa induzido por danos biológicos que normalmente se acumula ao longo de anos em células envelhecidas, mas também pode surgir rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer. A senescência das células tumorais é geralmente considerada indesejável, pois as células senescentes tornam-se resistentes à morte e bloqueiam a remissão do tumor, exacerbando a malignidade do tumor e a resistência ao tratamento. Portanto, a identificação de células tumorais senescentes é de interesse contínuo para a comunidade de pesquisa do câncer. Existem vários ensaios de senescência, muitos baseados na atividade do conhecido marcador de senescência, a beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal).

Normalmente, o ensaio SA-β-Gal é realizado usando um substrato cromogênico (X-Gal) em células fixas, com a enumeração lenta e subjetiva de células senescentes "azuis" por microscopia de luz. Ensaios aprimorados usando substratos SA-β-Gal fluorescentes e permeantes a células, incluindo C_12-FDG (verde) e DDAO-Galactoside (DDAOG; vermelho-distante), permitiram a análise de células vivas e permitiram o uso de plataformas de análise fluorescente de alto rendimento, incluindo citômetros de fluxo. C_12-FDG é uma sonda bem documentada para SA-β-Gal, mas sua emissão fluorescente verde se sobrepõe à autofluorescência celular intrínseca (FA) que surge durante a senescência devido ao acúmulo de agregados de lipofuscina. Ao utilizar a sonda SA-β-Gal DDAOG de vermelho distante, a autofluorescência celular verde pode ser usada como um parâmetro secundário para confirmar a senescência, adicionando confiabilidade ao ensaio. Os canais de fluorescência restantes podem ser usados para coloração de viabilidade celular ou imunomarcação fluorescente opcional.

Usando citometria de fluxo, demonstramos o uso de DDAOG e autofluorescência de lipofuscina como um ensaio de duplo parâmetro para a identificação de células tumorais senescentes. A quantificação da porcentagem de células senescentes viáveis é realizada. Se desejado, uma etapa opcional de imunomarcação pode ser incluída para avaliar antígenos de superfície celular de interesse. As células senescentes identificadas também podem ser classificadas citometricamente e coletadas para análise a jusante. As células senescentes coletadas podem ser imediatamente lisadas (por exemplo, para imunoensaios ou análise ômica) ou cultivadas posteriormente.

Introdução

As células senescentes normalmente se acumulam em organismos ao longo de anos durante o envelhecimento biológico normal, mas também podem se desenvolver rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer, incluindo radiação e quimioterapia. Embora não proliferem mais, as células tumorais senescentes induzidas pela terapia (TIS) podem contribuir para a resistência ao tratamento e impulsionar a recorrência ^1,2,3. Fatores secretados pelas células TIS podem exacerbar a malignidade tumoral, promovendo evasão imune ou metástase

Protocolo

Todo o trabalho com animais descrito foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.

1. Preparação e armazenagem de soluções-mãe

NOTA: Se as células forem classificadas por fluxo, todas as soluções devem ser preparadas usando técnicas estéreis e filtradas através de um dispositivo de filtro de 0,22 μm.

1. Preparar uma solução-mãe de DDAO-Galactoside a 5 mg/ml em DMSO. Alíquota a 50 μL por tubo (ou volume desejado). Conservar a -20 °C no escuro até 1 ano.
2. Preparar uma solução-mãe de Bafilomicina A1 a 1 mM em DMSO. Alíquota a 50 μL po....

Resultados

Vários experimentos foram realizados para demonstrar a comparabilidade do DDAOG com X-Gal e C_12-FDG para a detecção de senescência por SA-β-Gal. Primeiramente, o X-Gal foi utilizado para corar células senescentes de melanoma B16-F10 induzidas por ETO (Figura 2A). Uma cor azul intensa se desenvolveu em um subconjunto de células tratadas com ETO, enquanto outras células exibiram coloração azul menos intensa. A morfologia foi aumentada na maioria das células tratadas com E.......

Discussão

Na última década, a citometria de fluxo tornou-se uma plataforma de ensaio mais comum na pesquisa do câncer devido à popularidade emergente da imunologia tumoral, ao desenvolvimento de citômetros de fluxo de baixo custo e à melhoria das instalações de instrumentação compartilhadas em instituições acadêmicas. Ensaios multicoloridos são agora padrão, já que a maioria dos instrumentos mais recentes são equipados com matrizes ópticas violeta, azul-verde e vermelho a vermelho-distante. Assim, é provável qu.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bafilomycin A1	Research Products International	B40500
Bleomycin sulfate	Cayman	13877
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate	Biolegend	137803	Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma	American Type Culture Collection	CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma	American Type Culture Collection	CRL-6475
Cell scraper	Corning	3008
Cell strainers, 100 µm	Falcon	352360
DDAO-Galactoside	Life Technologies	D6488
DMEM medium 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNAse I	Sigma	DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
Etoposide	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc receptor blocking reagent	Biolegend	101320	Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer)	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter)	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin/Streptomycin 100x	Life Technologies	15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x	Life Technologies	11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo"	TreeStar	n/a	Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114