通过成像质谱分析 研究 感染期间琼脂和组织中生长的细菌菌落的微生物合作

摘要

展示了一种新型样品制备方法，用于通过基质辅助激光解吸/电离成像质谱 分析 琼脂基细菌大菌落。

摘要

了解感染期间发生的微生物相互作用的代谢后果对生物医学成像领域提出了独特的挑战。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）成像质谱代表了一种无标记的 原位 成像模式，能够生成各种代谢物的空间图。虽然现在通过该技术 常规 分析薄切片组织样品，但由于这些样品的高含水量和不均匀的地形，非传统底物（例如微生物学研究中通常在琼脂上生长的细菌菌落）的成像质谱分析仍然具有挑战性。本文演示了一种样品制备工作流程，以便对这些样品类型进行成像质谱分析。该过程使用两种胃肠道病原体的细菌共培养大菌落来举例说明: 艰难梭菌 和 粪肠球菌。研究这种明确定义的琼脂环境中的微生物相互作用也被证明可以补充组织研究，旨在了解小鼠感染模型中这两种致病生物之间的微生物代谢合作。氨基酸代谢物精氨酸和鸟氨酸的成像质谱分析作为代表性数据呈现。该方法广泛适用于其他分析物、微生物病原体或疾病以及需要细胞或组织生物化学空间测量的组织类型。

引言

人类微生物组是一个高度动态的生态系统，涉及细菌、病毒、古细菌和其他微生物真核生物的分子相互作用。虽然近年来对微生物关系进行了深入研究，但在^{化学水平上}对微生物过程仍有许多了解1^，2。这部分是由于没有能够准确测量复杂微生物环境的工具。过去十年来，成像质谱（IMS）领域的进展使生物底物中的许多代谢物，脂质和蛋白质的原位和无标记空间映射成为可能3^，4。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）已成为成像质谱中最常用的电离技术，涉及使用紫外激光从薄组织切片表面烧蚀材料，以通过质谱法4进行^测量。通过将化学基质均匀地应用于样品表面，可以在整个样品表面上以光栅模式进行连续测量，从而促进了这一过程。然后在数据采集后生成分析物离子强度的热图。电离源和采样技术的最新进展使得能够分析非传统底物，例如在营养琼脂上生长的细菌⁵和哺乳动物^6，7，8细胞标本。IMS提供的分子空间信息^{可以为感染过程中}微生物-微生物和宿主-微生物相互作用的生化通讯提供独特的见解9，^10，11，¹²，^13，14。

艰难梭菌感染 （CDI） 后，艰难梭菌暴露于胃肠道中快速变化的微生物环境中，其中多种微生物相互作用可能会影响感染结果^15，16。令人惊讶的是，人们对感染期间艰难梭菌和常驻微生物群之间相互作用的分子机制知之甚少。例如，肠球菌是肠道微生物组中的一类机会性共生病原体，与 CDI¹⁷、^18、19、20 的易感性和严重程度增加有关。然而，对这些病原体之间相互作用的分子机制知之甚少。为了可视化肠道微生物组这些成员之间的小分子通讯，本文在琼脂上生长细菌大菌落以模拟受控环境中的微生物-微生物相互作用和细菌生物膜形成。然而，由于细菌培养标本的高含水量和不均匀的表面形貌，通过MALDI成像质谱分析获得具有代表性的代谢分布具有挑战性。这主要是由琼脂的高度亲水性和去除水分过程中琼脂表面反应不均匀引起的。

琼脂的高含水量也使得获得均匀的MALDI基质包衣变得具有挑战性，并可能干扰随后在真空中进行的MALDI分析²¹。例如，许多MALDI源在0.1-10托的压力下运行，这是一个足够的真空，可以从琼脂中去除水分，并可能导致样品变形。真空环境引起的琼脂中的这些形态变化导致干燥琼脂材料起泡和开裂。这些伪影会降低琼脂对载玻片的粘附，并可能导致样品拆卸或剥落到仪器真空系统中。琼脂样品的厚度可能与载玻片相距5 mm，这会导致仪器内部离子光学元件的间隙不足，从而导致仪器离子光学元件受到污染和/或损坏。这些累积效应可以导致反映表面形貌的离子信号减少，而不是潜在的微生物生化相互作用。琼脂样品必须均匀干燥，并在真空分析之前牢固地粘附在显微镜载玻片上。

本文展示了一种用于控制在琼脂培养基上生长的细菌培养物大菌落干燥的样品制备工作流程。这种多步骤、较慢的干燥过程（相对于先前报道的过程）可确保琼脂均匀脱水，同时最大限度地减少安装在显微镜载玻片上的琼脂样品冒泡或开裂的影响。通过使用这种逐渐干燥的方法，样品牢固地粘附在显微镜载玻片上，并适合随后的基质应用和MALDI分析。这使用在琼脂和鼠组织模型上生长的 艰难梭菌 模型来举例说明，这些模型具有和不存在共生和机会性病原体粪肠球菌。细菌和组织模型的MALDI成像质谱分析允许氨基酸代谢物谱的空间映射，为生物能量微生物代谢和通讯提供新的见解。

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研究方案

注意:动物实验已获得费城儿童医院和宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院动物护理和使用委员会的批准（协议IAC 18-001316和806279）。

注意:艰难梭菌（艰难梭菌）和粪肠球菌（ 粪肠球菌）是BSLII病原体，应格外小心处理。必要时使用适当的净化方案。

1. 细菌培养大菌落的生长和隔夜运输的准备

1. 制备 艰难梭菌 和 粪肠杆菌 过夜培养物，并在37°C的厌氧室（85%氮，10%氢气，5%二氧化碳）中在补充有0.5%酵母提取物和0.1%l-半胱氨酸（BHIS）的脑 - 心脏输液中单独培养。对所有铺板样品使用1.5%琼脂。
2. 将细菌培养基标准化为600nm（OD₆₀₀）的光密度。将每个大菌落的5μL板到BHIS + l-半胱氨酸琼脂平板上，并在37°C下厌氧生长7天。 对于混合物种大菌落，在铺板前以1:1的比例混合细菌培养基。
3. 使用欧姆表用导电涂层识别载玻片的侧面，制备氧化铟锡（ITO）涂层的显微镜载玻片。使用金刚石尖端的划线蚀刻并标记显微镜载玻片的ITO涂层侧。
4. 从琼脂生长平板上切除整个培养物，然后安装到ITO包被的显微镜载玻片上，同时确保气泡不会被困在琼脂和载玻片之间。
   注意:琼脂培养基中的水含量应使培养物自然粘附在显微镜载玻片表面上。在Yang等人的补充文档中提供了一段视频来举例说明这一过程²²。
5. 将菌落放在显微镜载玻片盒中进行保护。将载玻片盒存放在 8 英寸 x 8 英寸的生物危害标本运输袋中，并带有少量干燥剂颗粒，并密封过夜运输以进行进一步处理和分析。
   注意:在室温条件下运输细菌培养物时，保持细菌培养物的干燥环境以减缓细菌生长和代谢并保持细菌标本的固定直到分析，这一点很重要。这种运输方法已通过大量实验进行了优化，并且优于运输在干冰中冷冻的菌落。干燥前的主要温度变化往往会导致安装的琼脂样品下方的拆卸和鼓泡。

2. 艰难梭菌+粪肠杆菌大菌落的常温干燥

1. 从包装材料中取出安装在ITO涂层显微镜载玻片上的琼脂糖细菌菌落。将样品放入带有干燥剂的干燥盒中，在室温下48-72小时。
   注意:这是一个温和而缓慢的干燥过程，可最大限度地减少琼脂培养基从显微镜载玻片表面的鼓泡、开裂或分离。
2. 妥善处理所有受污染的包装材料，并使用适当的杀菌/杀孢子消毒剂对工作空间进行净化。
3. 目视检查菌落在琼脂表面的变形（例如，鼓泡、开裂、脱落）。
   注意:琼脂糖表面的高度应明显降低并平放在载玻片上。

3. 艰难梭 菌+ 粪肠杆菌 大菌落的真空和热介导干燥

注意:构建了定制的真空干燥设备（图1），以促进从琼脂样品中去除多余的水分。该设备利用连接到HEPA生物过滤器，冷阱和不锈钢室的旋片真空泵，用于放置细菌样品。可变电压变压器连接到绝缘线丝，允许用户加热腔室以加快干燥过程。

1. 关闭样品室的真空管路，打开 旋片 泵的电源开关，使真空泵预热并达到适当的真空压力。
2. 打开 可变电压变压器 以加热缠绕在腔室周围的电线丝。调整 可变电源 ，直到真空室的内部温度达到~50°C。当泵预热时，将干冰和100%乙醇的浆液放入冷阱的冷凝器中。
   注意: 冷阱可冷凝样品中的任何蒸汽或孢子，并避免污染旋片泵系统和真空泵油。
3. 使用扳手松开 16 mm 双爪法兰夹打开真空室。将琼脂糖样品插入腔室，并用 16 mm 双爪法兰夹紧密封腔室。
4. 打开泵阀以排空腔室。让样品干燥60-120分钟（例如，在~150 mTorr）。
   注意:此干燥时间足以去除小琼脂切片中的大部分水分。根据个体设置和样品的不同，可能需要根据经验确定去除水分和降低琼脂高度的最佳干燥时间。干燥时间的延长会导致干燥的琼脂变脆并容易开裂。
5. 完成后，通过关闭旋片泵上的阀门并将外部阀门打开环境空气，将真空室缓慢排放到环境压力。使用前面提到的方案打开腔室，并从腔室中取出干燥的琼脂糖样品。
6. 将样品储存在带有干燥剂的干燥盒中，直到基质应用。
   注意: 图2 显示了干燥前后琼脂表面的图像。

4. 通过机器人喷涂应用 MALDI基质

注意:在琼脂糖样品彻底干燥并且培养部分的高度明显降低后，使用机器人基质喷雾器均匀地涂覆化学MALDI基质化合物的薄涂层。此过程应在化学通风橱中进行，并配有适当的个人防护设备，包括手套、实验室眼镜和实验室外套。

1. 选择适当的 MALDI 矩阵。要遵循此协议，请使用1，5-二氨基萘（DAN）MALDI基质，因为它在负离子模式下有利于氨基酸的解吸和电离。
2. 在 90/10 （v/v） 乙腈/水中制备 10 mL 的 10 mg/mL DAN MALDI 基质溶液。使用HPLC级溶剂，超声处理30分钟，并在引入机器人喷雾器注射泵之前通过0.2μm尼龙注射器过滤器过滤溶液。此外，准备洗涤溶液，以确保每次使用之间的喷雾器管路清洁。
   注意:选择清洗溶液是为了增加喷雾器管路中基质和其他污染物的溶解度，并便于将其从系统中去除。此处使用的洗涤溶液为90/10（v/v）乙腈/水、50/50（v/v）水/甲醇、99/1（v/v）乙腈/乙酸和95/5（v/v）水/氢氧化铵。
3. 将样品连接到喷雾器托盘，并将制备的溶液装入喷雾器管路（图3）。使用计算机软件指定必要的参数，以使基质化合物的均匀涂层: 30°C喷嘴温度，八次通过，0.1 mL / min流速，CC模式，0 s干燥时间，10 psi。
   注意:人们普遍认为，大多数病原体将通过应用MALDI基质而失活，该基质通常是小的有机酸或碱。
4. 喷洒顺序完成后，从喷雾器托盘中取出样品并储存在干燥柜中直至分析。

5. 制备用于MALDI成像质谱数据采集的细菌大菌落

注意:所有成像质谱分析均使用傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪进行。该仪器配备了Nd:YAG MALDI激光系统（2 kHz，355 nm）。

1. 将基质包被的样品插入MALDI靶板显微镜载玻片适配器中，并使用永久性标记划线至少三个基准标记，这些基准标记包含样品区域（图4）。使用平板扫描仪获取显微镜载玻片的光学图像，包括基准标记。
   注意:基准标记将允许将光学图像配准到仪器中观察到的MALDI相机视图。
2. 定义针对所需质量范围、灵敏度和分辨率进行优化的 MS 仪器方法，包括质量校准、MALDI 激光设置、离子光学参数和 ICR 池条件。对于该方法，选择从m / z 100到200的100 Da质量窗口，使用连续累积选定离子（CASI）方法在负离子模式下富集气相信号，23该方法包含目标代谢物的m / z值。
3. 打开仪器的图像采集软件，使用 设置向导 定义 文件名 和 位置、 MS采集方法、要采样 的感兴趣区域 以及图像的空间 分辨率 。
   注意:100-300μm的空间分辨率通常用于细菌大菌落成像。
4. 定义所有参数后，开始采集序列以连续采集定义感兴趣区域每个像素的质谱。
   注意:图像采集时间取决于仪器设置，但对于包含5，000-10，000像素的图像，通常范围为2至6小时。

6. 成像质谱数据分析与化合物鉴定

1. 图像采集后，使用".mis"文件扩展名保存数据，这是用于成像质谱平台的供应商特定文件格式。在flexImaging 或 SCiLS 软件包中打开数据文件，或导出为非专有数据格式（如 .mzml），并使用供应商中立的软件（例如 Cardinal²⁴ 或 MSIreader^25，26）进行可视化。
   注意:在flexImaging中打开成像数据时显示平均质谱，它表示在采样区域中检测到的所有离子的平均强度。可以根据准确的质量测量暂时确定感兴趣的峰。通常，质量精度优于百万分之5（ppm）足以在FTICR质谱仪上鉴定代谢物。
2. 使用参考的软件，定义目标峰的质量窗口，以生成采样区域中离子分布的假彩色热图。
   1. 在 平均质谱 显示上，放大到感兴趣的峰并选择包含峰图面积的适当质量数窗口。
   2. 右键单击突出显示的质量窗口，然后选择 添加质量过滤器...。使用高分辨率精确质量数测量确定的可疑代谢物的暂定鉴定标记所选m / z 值。
   3. 选择 强度阈值 以调整假色热图显示的分析物图像的动态范围。进一步调整质量数 过滤参数 ，使质量数窗口包含峰分布的面积，然后添加 质量数过滤器。
      注意:可以根据需要执行强度归一化，以改善测量区域的相对定量。本文的实验利用了CASI数据采集（vide infra），这可能使总离子计数（TIC）和均方根（RMS）归一化方法不准确。因此，此处显示的所有离子图像均未归一化。

7.未感染对照和 艰难梭菌 感染小鼠盲肠组织的制备和运输

1. 将4-8周龄C57BL / 6雄性小鼠在饮用水中随意接种抗生素（0.5mg / mL头孢哌酮或0.5mg / mL头孢哌酮+ 1mg / mL万古霉素）5天，然后2天恢复期和随后的感染。
2. 通过CO₂ 窒息对动物实施安乐死，并立即收获小鼠盲肠器官。嵌入蒸馏水中 20% 的最佳切割温度 （OCT） 化合物混合物中。
3. 将样品放在干冰上，然后包装并运输进行分析;储存在-80°C直至分析。

8.未感染对照品艰难梭菌 感染小鼠盲肠组织的冷冻切片

1. 用100%乙醇冲洗清洁所有冷冻切割设备，并在将样品放入低温恒温器室之前使其干燥。使用欧姆表准备ITO涂层的显微镜载玻片，以识别带有导电涂层的载玻片的侧面。使用金刚石尖端的划线蚀刻并标记显微镜载玻片的ITO涂层侧。
   注意:应穿戴适当的个人防护设备，包括手套、实验室眼镜、实验室外套和低温恒温器套筒。
2. 对研究冷冻切片机进行冷冻切片。将OCT包埋的小鼠ceca组织从-80°C冰箱转移到干冰上的冷冻切片机室（30°C室温度，-28°C物体温度）。将要使用成像质谱法比较的组织样品（例如，未感染的对照与 艰难梭菌感染的对照）安装在同一显微镜载玻片上，以确保两种组织类型的样品制备相同，并能够进行准确的代谢物比较。
3. 在冷冻切片机室内，使用额外的OCT溶液将OCT包埋的组织安装在样品卡盘上。OCT溶液凝固后，将卡盘固定在试样头上。以10-50μm的增量开始冷冻切片，以达到器官的所需组织深度/平面。
4. 一旦达到组织的最佳横截面，就开始收集12μm厚度的切片。使用艺术家画笔轻轻操作切片，然后将其放在特氟龙涂层的显微镜载玻片上。
5. 将ITO涂层的显微镜载玻片滚动到组织切片的顶部，以从特氟龙涂层的载玻片中拾取组织。通过将手掌压在ITO涂层载玻片的背面，将组织切片安装到显微镜载玻片上。继续解冻安装，直到组织切片从半透明过渡到不透明/哑光纹理。
6. 将干冰上的组织安装显微镜载玻片转移到带有干燥剂的干燥盒中，以便储存在同一天进行分析，或储存在-80°C以进行长期储存。

9. 非感染对照与 艰难梭菌 感染小鼠盲肠组织的制备，用于基质应用和MALDI成像质谱

1. 使用 步骤4 中描述的相同方案（30°C喷嘴温度，八次通过，0.1mL / min流速，CC模式，0 s干燥时间，10 psi）执行MALDI基质应用。
2. 使用 步骤 5 和 6 中描述的相同协议执行 MALDI 成像质谱分析。
3. 分析来自多个生物学重复的离子图像，并使用上面引用的SCiLS统计软件通过强度箱图比较 来 比较结果的显着性。
   注意:适当的统计测试和比较将取决于应用，并且可以包括空间分割、分类模型和比较分析，以确定判别性和相关的光谱特征。比较分析可以包括为显著特征分配 p 值、生成用于组织比较的主成分分析以及可视化箱形图以识别变化。在成像质谱法之后，使用通过苏木精和伊红（H&E） 染色 的组织切片的明场显微镜可视化组织也是有用的。这样可以清楚地识别组织中的形态特征，并且可以与训练有素的病理学家协商进行分析。

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结果

我们对模型细菌菌落和与 粪肠杆菌 和 艰难梭菌 共定植的小鼠进行了代谢物MALDI成像质谱分析，以研究氨基酸在微生物 - 微生物相互作用中的作用。在琼脂上生长的细菌大菌落可作为分析细菌生物膜形成中不同生化变化的明确定义模型。重要的是要确保在琼脂培养基上生长的细菌培养大菌落的受控干燥过程，以最大限度地减少琼脂表面的变形和开裂。这是通过两步过程 实现 ?...

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讨论

在MALDI成像质谱分析过程中，重要的是具有平坦的样品表面，以使样品基板上入射MALDI激光的焦距一致。样品高度的偏差会导致 MALDI 激光束移出焦点，从而导致光束直径和强度的变化，从而影响 MALDI 电离效率。电离效率的这些变化可能导致整个组织表面的分析物强度差异，这些差异不反映底层组织生物化学，而是反映表面形貌。此外，大多数MALDI电离源在低于大气压下运行，水合琼脂样品在 真...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Titan3 nylon syringe filters	Thermo Scientific	42225-NN
1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix	Sigma Aldrich	2243-62-1
20 mL Henke Ject luer lock syringes	Henke Sass Wolf	4200.000V0
275i series convection vacuum gauge	Kurt J. Lesker company	KJL275807LL
7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Acetic acid solution, suitable for HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis	Sigma Aldrich	1336-21-6
Autoclavable biohazard bags: 55 gal	Grainger	45TV10
Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.)	Fisher Scientific	01-800-07
Brain heart infusion broth	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 male mice	Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner	Canon
CM 3050S research cryomicrotome	Leica Biosystems
Desiccator cabinet	Sigma Aldrich	Z268135
Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific	50-254-51
Drierite desiccant pellets	Drierite	21005
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2701
flexImaging software	Bruker Daltonics
ftmsControl software	Bruker Daltonics
Glass vacuum trap	Sigma Aldrich	Z549460
HTX M5 TM robotic sprayer	HTX Technologies
Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides	Delta Technologies	CG-81IN-S115
In-line HEPA filter to vacuum pump	LABCONCO	7386500
Methanol, HPLC Grade	Fisher Chemical	67-56-1
MTP slide-adapter II	Bruker Daltonics	235380
Optimal cutting temperature (OCT) compound	Fischer Scientific	23-730-571
Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner	CONTEC	CR85335
PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Rotary vane vacuum pump RV8	Edwards	A65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades	Electron Microscopy Sciences	63068-HP
Transparent vacuum tubing	Cole Palmer	EW-06414-30
Ultragrade 19 vacuum pump oil	Edwards	H11025011
Variable voltage transformer	Powerstat
Water, suitable for HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Wide-mouth dewar flask	Sigma Aldrich	Z120790