Enfeksiyon Sırasında Agar ve Dokuda Yetişen Bakteri Kolonilerinin Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi Yoluyla Mikrobiyal İşbirliğinin İncelenmesi

Özet

Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi ile agara bazlı, bakteriyel makrokolonilerin analizi için yeni bir numune hazırlama yöntemi gösterilmiştir.

Özet

Enfeksiyon sırasında ortaya çıkan mikrobiyal etkileşimlerin metabolik sonuçlarını anlamak, biyomedikal görüntüleme alanına benzersiz bir meydan okuma sunmaktadır. Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) görüntüleme kütle spektrometrisi, çok çeşitli metabolitler için uzamsal haritalar üretebilen, etiketsiz, yerinde bir görüntüleme yöntemini temsil eder. İnce kesitli doku örnekleri artık bu teknoloji ile rutin olarak analiz edilirken, mikrobiyoloji araştırmalarında yaygın olarak agar üzerinde yetiştirilen bakteri kolonileri gibi geleneksel olmayan substratların görüntüleme kütle spektrometresi analizleri, bu örneklerin yüksek su içeriği ve düzensiz topografyası nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu yazıda, bu numune türlerinin kütle spektrometrisi analizlerinin görüntülenmesine olanak tanıyan bir numune hazırlama iş akışı gösterilmektedir. Bu süreç, iki gastrointestinal patojenin bakteriyel ko-kültür makrokolonileri kullanılarak örneklendirilmiştir: Clostridioides difficile ve Enterococcus faecalis. Bu iyi tanımlanmış agar ortamında mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesinin, fare enfeksiyon modellerinde bu iki patojenik organizma arasındaki mikrobiyal metabolik işbirliğini anlamayı amaçlayan doku çalışmalarını tamamladığı da gösterilmiştir. Arjinin ve ornitin amino asit metabolitlerinin görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri temsili veri olarak sunulmuştur. Bu yöntem, diğer analitlere, mikrobiyal patojenlere veya hastalıklara ve hücresel veya doku biyokimyasının mekansal bir ölçüsünün istendiği doku tiplerine geniş ölçüde uygulanabilir.

Giriş

İnsan mikrobiyomu, bakterilerin, virüslerin, arkelerin ve diğer mikrobiyal ökaryotların moleküler etkileşimlerini içeren oldukça dinamik bir ekosistemdir. Mikrobiyal ilişkiler son yıllarda yoğun bir şekilde incelenmiş olsa da, kimyasal düzeyde ^1,2 mikrobiyal süreçler hakkında anlaşılması gereken çok şey vardır. Bu kısmen, karmaşık mikrobiyal ortamları doğru bir şekilde ölçebilen araçların bulunamamasından kaynaklanmaktadır. Son on yılda görüntüleme kütle spektrometresi (IMS) alanındaki ilerlemeler, biyolojik substratlardaki birçok metabolitin, lipitin ve proteinin in situ ve etiketsiz uzamsal haritalanmasını sağlamıştır ^3,4. Matris yardımlı lazer desorpsiyonu / iyonizasyonu (MALDI), kütle spektrometrisi ile ölçüm için ince bir doku kesitinin yüzeyinden malzemeyi ablate etmek için bir UV lazerinin kullanılmasını içeren, kütle spektrometrisinin görüntülenmesinde kullanılan en yaygın iyonizasyon tekniği olarak ortaya çıkmıştır⁴. Bu işlem, numunenin yüzeyine homojen olarak uygulanan kimyasal bir matrisin uygulanmasıyla kolaylaştırılır ve numune yüzeyi boyunca sıralı ölçümlerin raster deseninde yapılmasına izin verir. Analit iyon yoğunluklarının ısı haritaları daha sonra veri toplamayı takiben oluşturulur. İyonizasyon kaynakları ve örnekleme tekniklerindeki son gelişmeler, besin agar üzerinde yetiştirilen bakteriyel⁵ ve memeli ^6,7,8 hücresel örnekleri gibi geleneksel olmayan substratların analizini sağlamıştır. IMS tarafından sağlanan moleküler mekansal bilgi, enfeksiyon 9,10,11,12,13,14 sırasında mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerinin biyokimyasal iletişimi hakkında benzersiz bir fikir verebilir.

Clostridioides difficile enfeksiyonu (CDI) üzerine, C. difficile gastrointestinal sistemde hızla değişen bir mikrobiyal ortama maruz kalır ve polimikrobiyal etkileşimlerin enfeksiyon sonuçlarını etkilemesi muhtemeldir^15,16. Şaşırtıcı bir şekilde, enfeksiyon sırasında C. difficile ve yerleşik mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin moleküler mekanizmaları hakkında çok az şey bilinmektedir. Örneğin, enterokoklar, bağırsak-mikrobiyomdaki fırsatçı kommensal patojenlerin bir sınıfıdır ve CDI^{17,18,19,20'ye} duyarlılığının ve şiddetinin artmasıyla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, bu patojenler arasındaki etkileşimlerin moleküler mekanizmaları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bağırsak mikrobiyomunun bu üyeleri arasındaki küçük moleküllü iletişimi görselleştirmek için, kontrollü bir ortamda mikrop-mikrop etkileşimlerini ve bakteriyel biyofilm oluşumunu simüle etmek için burada agar üzerinde bakteriyel makrokoloniler yetiştirildi. Bununla birlikte, bakteri kültürü örneklerinin MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi analizi üzerine temsili metabolik dağılımların elde edilmesi, bu örneklerin yüksek su içeriği ve düzensiz yüzey topografyası nedeniyle zordur. Bu, büyük ölçüde agarın yüksek hidrofilik doğasından ve nem giderme sırasında düzgün olmayan agar yüzey tepkisinden kaynaklanır.

Agarın yüksek su içeriği ayrıca homojen MALDI matris kaplaması elde etmeyi zorlaştırabilir ve vakum^21'de gerçekleştirilen sonraki MALDI analizine müdahale edebilir. Örneğin, birçok MALDI kaynağı, agardaki nemi gidermek için yeterli bir vakum olan ve numunenin deformasyonuna neden olabilen 0.1-10 Torr basınçlarında çalışır. Vakum ortamının neden olduğu agardaki bu morfolojik değişiklikler, kurutulmuş agar materyalinde köpürme ve çatlamaya neden olur. Bu artefaktlar, agarın slayta yapışmasını azaltır ve numunenin alet vakum sistemine sökülmesine veya dökülmesine neden olabilir. Agar numunelerinin kalınlığı kızaktan 5 mm'ye kadar çıkabilir, bu da cihazın içindeki iyon optiklerinden yetersiz boşluk oluşturarak kontaminasyona ve/veya cihaz iyon optiklerinde hasara neden olabilir. Bu kümülatif etkiler, altta yatan mikrobiyal biyokimyasal etkileşimlerden ziyade, yüzey topografyasını yansıtan iyon sinyalinin azalmasına neden olabilir. Agar numuneleri homojen olarak kurutulmalı ve vakumda analizden önce mikroskop kaydırağına kuvvetlice yapıştırılmalıdır.

Bu yazıda, agar ortamında yetiştirilen bakteri kültürü makrokolonilerinin kontrollü kurutulması için bir numune hazırlama iş akışı gösterilmektedir. Bu çok adımlı, daha yavaş kurutma işlemi (daha önce bildirilenlere göre), mikroskop slaytlarına monte edilmiş agar numunelerinin köpürmesi veya çatlaması etkilerini en aza indirirken, agarın eşit şekilde dehidrate olmasını sağlar. Bu kademeli kurutma yöntemi kullanılarak, numuneler mikroskop sürgüsüne kuvvetlice yapıştırılır ve sonraki matris uygulaması ve MALDI analizi için uygun hale getirilir. Bu, kommensal ve fırsatçı patojen Enterococcus faecalis'in varlığı olan ve olmayan CDI'yi barındıran agar ve murin doku modellerinde yetiştirilen C. difficile modeli bakteri kolonileri kullanılarak örneklendirilmiştir. Hem bakteri hem de doku modellerinin MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri, amino asit metabolit profillerinin mekansal haritalandırılmasına izin vererek, biyoenerjetik mikrobiyal metabolizma ve iletişim hakkında yeni bilgiler sağlar.

Protokol

NOT: Hayvan deneyleri, Philadelphia Çocuk Hastanesi ve Pennsylvania Üniversitesi Perelman Tıp Fakültesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmıştır (protokoller IAC 18-001316 ve 806279).

DİKKAT: Clostridium difficile (C. difficile) ve Enterococcus faecalis (E. faecalis) BSLII patojenleridir ve çok dikkatli kullanılmalıdır. Gerektiğinde uygun dekontaminasyon protokollerini kullanın.

1. Bakteri kültürü makrokolonilerinin büyümesi ve gece sevkiyatına hazırlık

1. C. difficile ve E. faecalis gece kültürlerini hazırlayın ve bunları 37 ° C'de anaerobik bir odada (% 85 azot,% 10 hidrojen,% 5 karbondioksit) beyin-kalp-infüzyon suyunda% 0.5 maya ekstresi ve% 0.1 l-sistein (BHIS) ile desteklenmiş ayrı ayrı büyütün. Tüm kaplanmış numuneler için% 1,5 agar kullanın.
2. Bakteri kültürü ortamını 600 nm'de (OD₆₀₀) optik yoğunluğa normalleştirin. Her makrokoloninin 5 μL'sini BHIS + l-sistein agar plakalarına yerleştirin ve 37 ° C'de 7 gün boyunca anaerobik olarak büyür. Karışık tür makrokolonileri için, kaplamadan önce bakteri kültürü ortamını 1: 1 oranında karıştırın.
3. İndiyum kalay oksit (ITO) kaplı mikroskop slaytlarını, slaytın kenarını iletken kaplama ile tanımlamak için bir ohmmetre kullanarak hazırlayın. Mikroskop slaytının İTO kaplı tarafını kazımak ve etiketlemek için elmas uçlu bir kağıt kullanın.
4. Tüm kültürü agar büyüme plakasından çıkarın ve daha sonra hava kabarcıklarının agar ve slayt arasında sıkışmamasını sağlarken İTO kaplı bir mikroskop sürgüsüne monte edin.
   NOT: Agar ortamındaki su içeriği, kültürün mikroskop slayt yüzeyine doğal olarak yapışmasına izin vermelidir. Bu süreci örnekleyen bir video, Yang ve ^ark.22'nin ek belgelerinde verilmiştir.
5. Kolonileri korumak için mikroskop slayt kutularına yerleştirin. Sürgü kutularını 8 inç x 8 boyutlarında, biyolojik tehlike numunesi taşıma torbalarında bir avuç kurutucu pelet ile saklayın ve daha fazla işleme ve analiz için gece boyunca nakliye için mühürleyin.
   NOT: Bakteriyel büyüme ve metabolizmayı yavaşlatmak ve analize kadar bakteri örneklerinin sabitlenmesini sağlamak için ortam koşulları altında sevk edildiğinde bakteri kültürleri için kuru bir ortam sağlamak önemlidir. Bu nakliye yöntemi kapsamlı deneylerle optimize edilmiştir ve kuru buzda dondurulmuş kolonilerin nakliyesine göre tercih edilmektedir. Kurumadan önceki büyük sıcaklık değişimleri, monte edilmiş agar numunesinin altında sökülmeye ve köpürmeye neden olma eğilimindedir.

2. C. difficile + E. faecalis bakteriyel makrokolonilerinin ortam kurutulması

1. İTO kaplı mikroskop kızaklarına monte edilen agaroz bakteri kolonilerini ambalaj malzemesinden çıkarın. Numuneleri oda sıcaklığında 48-72 saat kurutuculu kuru bir kutuya koyun.
   NOT: Bu, agar ortamının mikroskop slayt yüzeyinden köpürmesini, çatlamasını veya ayrılmasını en aza indiren hafif ve yavaş kuruyan bir işlemdir.
2. Kirlenmiş tüm ambalaj malzemelerini uygun şekilde atın ve çalışma alanını uygun bir bakteri öldürücü/sporisidal dezenfektan ile dekontamine edin.
3. Kolonileri agar yüzeyindeki deformasyonlar açısından görsel olarak inceleyin (örneğin, köpürme, çatlama, sökme).
   NOT: Agaroz yüzeyinin yüksekliği gözle görülür şekilde azalmalı ve slayt boyunca düz durmalıdır.

3. C. difficile + E. faecalis bakteriyel makrokolonilerinin vakumlu ve ısı aracılı kurutulması

NOT: Agar numunelerinden fazla nemin uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için özel yapım bir vakumlu kurutma aparatı (Şekil 1) üretilmiştir. Bu aparat, bir HEPA biyofiltresine paralel olarak bağlanmış bir döner kanatlı vakum pompası, bir soğuk tuzak ve bakteri numunelerinin yerleştirildiği paslanmaz çelik bir oda kullanır. Değişken voltajlı bir transformatör, kullanıcının kurutma işlemini hızlandırmak için odayı ısıtmasını sağlayan yalıtımlı bir tel filamentine bağlanır.

1. Vakum hattını numune odasına kapatın ve vakum pompasının ısınmasına ve uygun vakum basıncına ulaşmasına izin vermek için güç anahtarını döner kanatlı pompaya açın.
2. Odanın etrafına sarılmış tel filamentini ısıtmak için değişken voltajlı transformatörü açın. Vakum odasının iç sıcaklığı ~ 50 ° C'ye ulaşana kadar değişken güç kaynağını ayarlayın. Pompa ısınırken, soğuk tuzağın kondenserine bir bulamaç kuru buz ve% 100 etanol yerleştirin.
   NOT: Soğuk tuzak, numunedeki buharları veya sporları yoğunlaştırır ve döner kanatlı pompa sisteminin ve vakum pompası yağının kirlenmesini önler.
3. 16 mm çift pençeli flanş kelepçelerini gevşetmek için bir anahtar kullanarak vakum odasını açın. Agaroz numunelerini hazneye yerleştirin ve odacığı 16 mm çift pençeli flanş kelepçeleriyle sıkıca kapatın.
4. Odayı boşaltmak için pompa valfini açın. Numunelerin 60-120 dakika kurumasını bekleyin (örneğin, ~ 150 mTorr'da).
   NOT: Bu kuruma süresi, küçük agar kesitlerindeki nemin çoğunu gidermek için yeterlidir. Nem giderimi için optimum kuruma süresinin ampirik olarak belirlenmesi ve agar yüksekliğinin azaltılması, bireysel kuruluma ve numunelere bağlı olarak gerekli olabilir. Önemli ölçüde daha uzun kuruma süreleri, kurutulmuş agarın kırılgan hale gelmesine ve çatlamaya eğilimli olmasına neden olabilir.
5. Tamamlandığında, döner kanatlı pompadaki valfi kapatarak ve harici vanayı ortam havasına açarak vakum odasını yavaşça ortam basıncına boşaltın. Daha önce bahsedilen protokolü kullanarak odayı açın ve kurutulmuş agaroz örneğini odadan çıkarın.
6. Numuneyi matris uygulamasına kadar kurutuculu kuru bir kutuda saklayın.
   NOT: Şekil 2 , agar yüzeyinin kurumadan önceki ve sonraki görüntülerini göstermektedir.

4. Robotik püskürtme ile MALDI matris uygulaması

NOT: Agaroz numuneleri iyice kurutulduktan ve kültür kesitlerinin yüksekliği gözle görülür şekilde azaldıktan sonra, kimyasal bir MALDI matris bileşiğinin ince bir kaplamasını homojen bir şekilde uygulamak için robotik bir matris püskürtücü kullanın. Bu prosedür kimyasal bir duman başlığında ve eldivenler, laboratuvar gözlükleri ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla yapılmalıdır.

1. Uygun MALDI matrisini seçin. Bu protokolü takip etmek için, negatif iyon modunda amino asitlerin olumlu desorpsiyonu ve iyonizasyonu için 1,5-diaminonaftalin (DAN) MALDI matrisini kullanın.
2. 90/10 (v/v) asetonitril/su içinde 10 mL/mL DAN MALDI matris çözeltisinin 10 mL'sini hazırlayın. HPLC sınıfı çözücüler kullanın, 30 dakika boyunca sonikat yapın ve robotik püskürtücü şırınga pompasına girmeden önce çözeltiyi 0,2 μm naylon şırınga filtrelerinden filtreleyin. Ek olarak, püskürtücü hattının her kullanım arasında temiz olmasını sağlamak için yıkama çözeltileri hazırlayın.
   NOT: Yıkama çözeltileri, matrisin ve diğer kirleticilerin püskürtücü hattındaki çözünürlüğünü arttırmak ve sistemden uzaklaştırılmalarını kolaylaştırmak için seçilir. Burada kullanılan yıkama çözeltileri 90/10 (v/v) asetonitril/su, 50/50 (v/v) su/metanol, 99/1 (v/v) asetonitril/asetik asit ve 95/5 (v/v) su/amonyum hidroksittir.
3. Numuneyi püskürtücü tepsisine takın ve hazırlanan çözeltileri püskürtücü hattına yükleyin (Şekil 3). Bilgisayar yazılımını kullanarak, matris bileşiğinin düzgün bir şekilde kaplanmasına izin vermek için gerekli parametreleri belirtin: 30 °C nozul sıcaklığı, sekiz geçiş, 0,1 mL / dak akış hızı, CC deseni, 0 s kuruma süresi, 10 psi.
   NOT: Genel olarak, çoğu patojenin, tipik olarak küçük bir organik asit veya baz olan MALDI matrisinin uygulanmasıyla inaktive edileceği kabul edilmektedir.
4. Püskürtme sırası bittikten sonra, numuneyi püskürtücü tepsisinden çıkarın ve analize kadar bir kurutma kabininde saklayın.

5. MALDI görüntüleme kütle spektrometresi veri toplama için bakteriyel makrokolonilerin hazırlanması

NOT: Tüm görüntüleme kütle spektrometrisi analizleri bir Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans (FTICR) kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu cihaz bir Nd: YAG MALDI lazer sistemi (2 kHz, 355 nm) ile donatılmıştır.

1. Matris kaplı numuneyi MALDI hedef plakası mikroskop slayt adaptörüne yerleştirin ve kalıcı belirteçler kullanarak numune alanını kapsayan en az üç referans işaretleyici yazın (Şekil 4). Referans işaretleyicileri de dahil olmak üzere mikroskop slaytının optik görüntüsünü elde etmek için düz yataklı bir tarayıcı kullanın.
   NOT: Referans işaretleyicileri, optik görüntünün cihazda gözlemlenen MALDI kamera görünümüne kaydedilmesine izin verecektir.
2. Kütle kalibrasyonu, MALDI lazer ayarları, iyon optik parametreleri ve ICR hücre koşullarını içeren, istenen kütle aralığı, hassasiyet ve çözünürlük için optimize edilmiş bir MS cihaz yöntemi tanımlayın. Bu yöntem için, seçilen iyonların sürekli birikimi (CASI) yaklaşımını23 kullanarak negatif iyon modunda gaz fazı sinyal zenginleştirmesi için m/z 100 ila ²⁰⁰ arasında bir 100 Da kütle penceresi seçin, bu da ilgili metabolitlerin m/z değerlerini kapsar.
3. Cihazın görüntü alma yazılımını açın ve dosya adını ve konumunu, MS alma yöntemini, örneklenecek ilgi alanlarını ve görüntünün uzamsal çözünürlüğünü tanımlamak için kurulum sihirbazını kullanın.
   NOT: 100-300 μm'lik uzamsal çözünürlükler tipik olarak bakteriyel makrokoloni görüntülemesi için kullanılır.
4. Tüm parametreler tanımlandıktan sonra, tanımlanan ilgili bölge (ler) deki her pikselde seri olarak bir kütle spektrumu elde etmek için edinme dizisini başlatın.
   NOT: Görüntü alma süresi cihaz ayarlarına bağlıdır, ancak genellikle 5.000-10.000 piksel içeren görüntüler için 2 ila 6 saat arasında değişir.

6. Görüntüleme kütle spektrometresi veri analizi ve bileşik tanımlama

1. Görüntü alımını takiben, verileri kütle spektrometresi platformlarını görüntülemek için satıcıya özgü bir dosya biçimi olan ".mis" dosya uzantısıyla kaydedin. Veri dosyasını flexImaging veya SCiLS yazılım paketlerinde açın veya .mzml gibi tescilli olmayan bir veri biçimine dışa aktarın ve satıcıdan bağımsız yazılımı (örneğin, Cardinal²⁴ veya MSIreader^25,26) kullanarak görselleştirin.
   NOT: FlexImaging'de görüntüleme verileri açıldığında ortalama bir kütle spektrumu görüntülenir ve bu da örneklenen bölgelerde tespit edilen tüm iyonların ortalama yoğunluklarını temsil eder. İlgilenilen zirveler, doğru kütle ölçümlerine dayanarak geçici olarak tanımlanabilir. Tipik olarak, milyonda 5 parçadan (ppm) daha iyi kütle doğrulukları, FTICR kütle spektrometrelerinde metabolit tanımlaması için yeterlidir.
2. Başvurulan yazılımı kullanarak, örneklenen bölgeler arasındaki iyon dağılımlarının yanlış renkli ısı haritalarını oluşturmak için ilgi çekici zirveler için kütle pencereleri tanımlayın.
   1. Ortalama kütle spektrumu ekranında, ilgi çekici zirveye yakınlaştırın ve tepe profilinin alanını kapsayan uygun bir kütle penceresi seçin.
   2. Vurgulanan kütle penceresine sağ tıklayın ve Kütle Filtresi Ekle'yi seçin. Seçilen m/z değerini, yüksek çözünürlüklü doğru kütle ölçümü ile belirlenen şüpheli metabolit için geçici tanımlamayı kullanarak etiketleyin.
   3. Yanlış renkli ısı haritası tarafından görüntülenen analit görüntüsünün dinamik aralığını ayarlamak için yoğunluk eşiğini seçin. Kütle filtreleme parametrelerini , kütle penceresi tepe profilinin alanını kapsayacak şekilde ayarlayın ve ardından kütle filtresini ekleyin.
      NOT: Yoğunluk normalleştirmesi, ölçülen bölgeler arasında göreceli nicelemeyi iyileştirmek için uygun şekilde gerçekleştirilebilir. Buradaki deneylerde, toplam iyon sayımı (TIC) ve kök ortalama kare (RMS) normalleştirme yöntemlerini yanlış hale getirebilecek CASI veri toplama (vide infra) kullanılmıştır. Bu nedenle, burada gösterilen tüm iyon görüntüleri normalleştirme olmadan görüntülenir.

7. Enfekte olmayan kontrol ve C. difficile ile enfekte fare çekal dokularının hazırlanması ve gönderilmesi

1. Antibiyotiklerle (0.5 mg / mL sefoperazon veya 0.5 mg / mL sefoperazon + 1 mg / mL vankomisin) 4-8 haftalık C57BL / 6 erkek fareleri 5 gün boyunca içme suyu ad libitumunda innoküle edin, ardından 2 günlük bir iyileşme süresi ve ardından enfeksiyon.
2. CO₂ asfiksasyonu ile hayvanları ötenazi yapın ve fare çekum organını hemen hasat edin. Damıtılmış suya %20'lik bir optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği karışımı yerleştirin.
3. Numuneleri kuru buz üzerine yerleştirin ve ardından analiz için paketleyip gönderin; analize kadar -80 °C'de saklayın.

8. Enfekte olmayan kontrol verus C. difficile ile enfekte fare çekal dokularının kriyoseksiyonu

1. Tüm kriyoseksiyon ekipmanlarını %100 etanol ile durulayarak temizleyin ve numuneleri kriyostat odasına yerleştirmeden önce kurumaya bırakın. İletken kaplama ile slaytın kenarını tanımlamak için bir ohmmetre kullanarak İTO kaplı mikroskop slaytları hazırlayın. Mikroskop slaytının İTO kaplı tarafını kazımak ve etiketlemek için elmas uçlu bir kağıt kullanın.
   NOT: Eldivenler, laboratuvar gözlükleri, laboratuvar önlüğü ve kriyostat kılıflar dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.
2. Bir araştırma kriyomikrotomunda kriyoseksiyon yapın. OCT'ye gömülü fare ceca dokularını -80 °C dondurucudan kuru buz üzerindeki kriyomikrotom odasına (30 °C oda sıcaklığı, -28 °C nesne sıcaklığı) aktarın. Her iki doku tipinin aynı numune hazırlanmasını sağlamak ve doğru metabolit karşılaştırmalarını sağlamak için görüntüleme kütle spektrometresi (örneğin, enfekte olmayan kontrol ve C. difficile ile enfekte edilmiş) kullanılarak karşılaştırılacak doku örneklerini aynı mikroskop slaytına monte edin.
3. Kriyomikrotom odasının içine, OCT gömülü dokuyu ek OCT çözeltisi kullanarak bir numune mandren üzerine monte edin. OCT çözeltisi katılaştıktan sonra, aynayı numune kafasına sabitleyin. Organın istenen doku derinliğine / düzlemine ulaşmak için kriyoseksiyona 10-50 μm artışlarla başlayın.
4. Dokunun optimal bir kesitine ulaşıldığında, 12 μm kalınlığında kesitler toplamaya başlayın. Sanatçı boya fırçalarını kullanarak dilimi nazikçe manipüle edin ve Teflon kaplı mikroskop slaydına yerleştirin.
5. Teflon kaplı slayttan dokuyu almak için ICO kaplı mikroskop slaytını doku bölümünün üzerine yuvarlayın. Çöz, avuç içini ICO kaplı slaydın arkasına bastırarak doku bölümünü mikroskop slaytına monte edin. Doku kesiti yarı saydamdan opak/mat bir dokuya geçene kadar montajı eritmeye devam edin.
6. Dokuya monte mikroskop slaytlarını kuru buz üzerinde aynı gün analiz için depolamak üzere kurutuculu kuru bir kutuya aktarın veya daha uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın.

9. Matriks uygulaması ve MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi için C. difficile ile enfekte fare çekal dokularına karşı enfekte olmayan kontrolün hazırlanması

1. Adım 4'te açıklanan aynı protokolü kullanarak MALDI matris uygulamasını gerçekleştirin (30 ° C nozul sıcaklığı, sekiz geçiş, 0,1 mL / dak debi, CC modeli, 0 s kuruma süresi, 10 psi).
2. Adım 5 ve 6'da açıklanan protokolleri kullanarak MALDI görüntüleme kütle spektrometresini gerçekleştirin.
3. Birden fazla biyolojik replikasyondan iyon görüntülerini analiz edin ve yukarıda belirtilen SCiLS istatistiksel yazılımını kullanarak yoğunluk kutusu grafiği karşılaştırmaları yoluyla anlamlılık sonuçlarını karşılaştırın.
   NOT: Uygun istatistiksel testler ve karşılaştırmalar uygulamaya bağlı olacaktır ve ayrımcı ve ilişkili spektral özelliklerin belirlenmesi için uzamsal segmentasyon, sınıflandırma modelleri ve karşılaştırmalı analiz içerebilir. Karşılaştırmalı analizler, önemli özelliklere p değerleri atamayı, doku karşılaştırmaları için ana bileşen analizleri oluşturmayı ve varyasyonları tanımlamak için kutu grafiklerini görselleştirmeyi içerebilir. Görüntüleme kütle spektrometrisini takiben hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyanan doku kesitinin parlak alan mikroskopisi kullanılarak dokunun görselleştirilmesi de yararlıdır. Bu, dokudaki morfolojik özelliklerin net bir şekilde tanımlanmasını sağlar ve eğitimli bir patologa danışılarak analiz edilebilir.

Sonuçlar

Mikrop-mikrop etkileşimlerinde amino asitlerin rolünü incelemek için model bakteri kolonilerinin ve E. faecalis ve C. difficile ile birlikte kolonileştirilen farelerin metabolit MALDI görüntüleme kütle spektrometrisini gerçekleştirdik. Agar üzerinde yetiştirilen bakteriyel makrokoloniler, bakteriyel biyofilm oluşumundaki farklı biyokimyasal değişiklikleri analiz etmek için iyi tanımlanmış bir model olarak hizmet eder. Agar yüzeyinde deformasyonları ve çatlamaları en aza indirmek...

Tartışmalar

MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi sırasında, numune substratı üzerindeki olay MALDI lazerinin tutarlı bir odak çapını sağlamak için düz bir numune yüzeyine sahip olmak önemlidir. Numune yüksekliğindeki sapmalar, MALDI lazer ışınının odak dışına kaymasına neden olarak ışın çapı ve yoğunluğunda değişikliklere neden olabilir ve bu da MALDI iyonizasyon verimliliğini etkileyebilir. İyonizasyon verimliliğindeki bu değişiklikler, doku yüzeyi boyunca altta yatan doku biyokimyasın?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Titan3 nylon syringe filters	Thermo Scientific	42225-NN
1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix	Sigma Aldrich	2243-62-1
20 mL Henke Ject luer lock syringes	Henke Sass Wolf	4200.000V0
275i series convection vacuum gauge	Kurt J. Lesker company	KJL275807LL
7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Acetic acid solution, suitable for HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis	Sigma Aldrich	1336-21-6
Autoclavable biohazard bags: 55 gal	Grainger	45TV10
Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.)	Fisher Scientific	01-800-07
Brain heart infusion broth	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 male mice	Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner	Canon
CM 3050S research cryomicrotome	Leica Biosystems
Desiccator cabinet	Sigma Aldrich	Z268135
Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific	50-254-51
Drierite desiccant pellets	Drierite	21005
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2701
flexImaging software	Bruker Daltonics
ftmsControl software	Bruker Daltonics
Glass vacuum trap	Sigma Aldrich	Z549460
HTX M5 TM robotic sprayer	HTX Technologies
Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides	Delta Technologies	CG-81IN-S115
In-line HEPA filter to vacuum pump	LABCONCO	7386500
Methanol, HPLC Grade	Fisher Chemical	67-56-1
MTP slide-adapter II	Bruker Daltonics	235380
Optimal cutting temperature (OCT) compound	Fischer Scientific	23-730-571
Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner	CONTEC	CR85335
PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Rotary vane vacuum pump RV8	Edwards	A65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades	Electron Microscopy Sciences	63068-HP
Transparent vacuum tubing	Cole Palmer	EW-06414-30
Ultragrade 19 vacuum pump oil	Edwards	H11025011
Variable voltage transformer	Powerstat
Water, suitable for HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Wide-mouth dewar flask	Sigma Aldrich	Z120790