JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטת הכנת דגימות חדשנית מודגמת לניתוח של מקרוקולוניות חיידקים מבוססות אגר באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית ספיחה / יינון בלייזר בסיוע מטריצה.

Abstract

הבנת ההשלכות המטבוליות של אינטראקציות מיקרוביאליות המתרחשות במהלך זיהום מציבה אתגר ייחודי לתחום הדימות הביו-רפואי. ספקטרומטריית מסות הדמיה בסיוע לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) מייצגת שיטת הדמיה באתרה נטולת תוויות המסוגלת ליצור מפות מרחביות עבור מגוון רחב של מטבוליטים. בעוד שדגימות רקמה בחתך דק מנותחות כיום באופן שגרתי באמצעות טכנולוגיה זו, ניתוחי ספקטרומטריית מסות הדמיה של מצעים לא מסורתיים, כגון מושבות חיידקים הגדלות בדרך כלל על אגר במחקר מיקרוביולוגי, נותרו מאתגרים בשל תכולת המים הגבוהה והטופוגרפיה הלא אחידה של דגימות אלה. מאמר זה מדגים זרימת עבודה להכנת דגימות כדי לאפשר ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של סוגי דגימות אלה. תהליך זה מודגם באמצעות מושבות מקרו-מושבות של תרבית חיידקית משותפת של שני פתוגנים במערכת העיכול: Clostridioides difficile ו- Enterococcus faecalis. חקר אינטראקציות מיקרוביאליות בסביבת אגר מוגדרת היטב זו הוכח גם כמשלים מחקרי רקמות שמטרתם להבין שיתוף פעולה מטבולי מיקרוביאלי בין שני אורגניזמים פתוגניים אלה במודלים של זיהום בעכברים. ניתוחי ספקטרומטריית מסה של המטבוליטים של חומצות האמינו ארגינין ואורניתין מוצגים כנתונים מייצגים. שיטה זו ישימה באופן נרחב לאנליטים אחרים, פתוגנים מיקרוביאליים או מחלות, וסוגי רקמות שבהם נדרשת מידה מרחבית של ביוכימיה תאית או רקמתית.

Introduction

המיקרוביום האנושי הוא מערכת אקולוגית דינמית ביותר הכוללת אינטראקציות מולקולריות של חיידקים, נגיפים, ארכאה ואיקריוטים מיקרוביאליים אחרים. בעוד שיחסים מיקרוביאליים נחקרו באינטנסיביות בשנים האחרונות, עדיין ניתן להבין הרבה על תהליכים מיקרוביאליים ברמה הכימית 1,2. זה נובע בחלקו מחוסר הזמינות של כלים המסוגלים למדוד במדויק סביבות מיקרוביאליות מורכבות. ההתקדמות בתחום ספקטרומטריית מסות הדמיה (IMS) בעשור האחרון אפשרה מיפוי מרחבי באתרו וללא תוויות של מטבוליטים, שומנים וחלבונים רבים במצעים ביולוגיים 3,4. ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) התפתחה כטכניקת היינון הנפוצה ביותר המשמשת בספקטרומטריית מסות הדמיה, הכוללת שימוש בלייזר UV כדי לעבד חומר מפני השטח של קטע רקמה דק למדידה על ידי ספקטרומטריית מסה4. תהליך זה מתאפשר על ידי יישום מטריצה כימית המיושמת באופן הומוגני על פני השטח של הדגימה, ומאפשרת לבצע מדידות רציפות בתבנית רסטר על פני שטח הדגימה. מפות חום של עוצמות יונים אנליטיות נוצרות לאחר מכן לאחר איסוף נתונים. ההתקדמות האחרונה במקורות יינון וטכניקות דגימה אפשרה ניתוח של מצעים לא מסורתיים כגון חיידקים5 ויונקים 6,7,8 דגימות תאיות שגדלו על אגר מזין. המידע המולקולרי המרחבי המסופק על ידי IMS יכול לספק תובנה ייחודית לגבי התקשורת הביוכימית של אינטראקציות מיקרוב-מיקרוב ומיקרובים מארחים במהלך זיהום 9,10,11,12,13,14.

עם זיהום Clostridioides difficile (CDI), C. difficile נחשף לסביבה מיקרוביאלית המשתנה במהירות במערכת העיכול, שבה אינטראקציות מיקרוביאליות צפויות להשפיע על תוצאות זיהום15,16. באופן מפתיע, מעט ידוע על המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות בין C. difficile לבין מיקרוביוטה תושב במהלך זיהום. לדוגמה, אנטרוקוקים הם קבוצה של פתוגנים אופורטוניסטיים במיקרוביום המעי ונקשרו לרגישות מוגברת ולחומרה של CDI17,18,19,20. עם זאת, מעט ידוע על המנגנונים המולקולריים של האינטראקציות בין פתוגנים אלה. כדי להמחיש תקשורת של מולקולות קטנות בין החברים האלה במיקרוביום המעי, מקרו-מושבות חיידקים גודלו כאן על אגר כדי לדמות אינטראקציות מיקרואורגניזם והיווצרות ביופילם חיידקי בסביבה מבוקרת. עם זאת, השגת התפלגות מטבולית מייצגת בניתוח ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI של דגימות תרבית חיידקים היא מאתגרת בשל תכולת המים הגבוהה וטופוגרפיית פני השטח הלא אחידה של דגימות אלה. זה נגרם בעיקר על ידי האופי ההידרופילי מאוד של אגר ואת התגובה משטח אגר לא אחיד במהלך הסרת לחות.

תכולת המים הגבוהה של אגר יכולה גם להקשות על השגת ציפוי מטריצת MALDI הומוגני ויכולה להפריע לניתוח MALDI הבא שבוצע ב- vacuo21. לדוגמה, מקורות MALDI רבים פועלים בלחצים של 0.1-10 Torr, שהוא ואקום מספיק כדי להסיר לחות מהאגר ויכול לגרום לעיוות של הדגימה. שינויים מורפולוגיים אלה באגר הנגרמים על ידי סביבת הוואקום גורמים לבעבוע וסדקים בחומר האגר המיובש. ממצאים אלה מפחיתים את ההיצמדות של האגר למגלשה ויכולים לגרום לפירוק או התקלפות של הדגימה לתוך מערכת ואקום המכשיר. עובי דגימות האגר יכול להיות עד 5 מ"מ מהמגלשה, מה שעלול ליצור מרווח לא מספיק מאופטיקת היונים בתוך המכשיר, ולגרום לזיהום ו/או נזק לאופטיקה של יונים במכשיר. השפעות מצטברות אלה יכולות לגרום להפחתה של אות היונים המשקף את טופוגרפיית פני השטח, במקום את האינטראקציות הביוכימיות המיקרוביאליות הבסיסיות. דגימות אגר חייבות להיות מיובשות בצורה הומוגנית ולהיות מודבקות בחוזקה לשקופית מיקרוסקופ לפני ניתוח בחלל ריק.

מאמר זה מדגים תהליך הכנה לדוגמה לייבוש מבוקר של מושבות מאקרו בתרבית חיידקים הגדלות על מצע אגר. תהליך ייבוש רב שלבי ואיטי זה (יחסית לאלה שדווחו בעבר) מבטיח כי האגר יתייבש באופן אחיד תוך מזעור ההשפעות של בעבוע או פיצוח של דגימות אגר המותקנות על שקופיות מיקרוסקופ. על ידי שימוש בשיטת ייבוש הדרגתית זו, הדגימות נצמדות מאוד לשקופית המיקרוסקופ וניתנות ליישום מטריצה עוקב ולניתוח MALDI. הדבר מודגם באמצעות מושבות חיידקים מודל של C. difficile הגדלות על מודלים של רקמת אגר ומורין המכילות CDI עם וללא נוכחות של פתוגן קומנסלי ואופורטוניסטי, Enterococcus faecalis. ניתוח ספקטרומטריית מסה של MALDI של מודלים חיידקיים ורקמתיים מאפשר מיפוי מרחבי של פרופילי מטבוליטים של חומצות אמינו, ומספק תובנה חדשה לגבי מטבוליזם מיקרוביאלי ביו-אנרגטי ותקשורת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של בית החולים לילדים בפילדלפיה ובית הספר לרפואה פרלמן באוניברסיטת פנסילבניה (פרוטוקולים IAC 18-001316 ו- 806279).

זהירות: Clostridium difficile (C. difficile) ו - Enterococcus faecalis (E. faecalis) הם פתוגנים BSLII ויש לטפל בהם בזהירות רבה. השתמש בפרוטוקולי טיהור מתאימים בעת הצורך.

1. גידול מושבות מאקרו של תרביות חיידקים והכנה למשלוח בן לילה

  1. הכינו תרביות לילה של C. difficile ו-E. faecalis וגדלו אותן בנפרד בטמפרטורה של 37°C בתא אנאירובי (85% חנקן, 10% מימן, 5% פחמן דו-חמצני) בציר עירוי מוח-לב בתוספת תמצית שמרים 0.5% ו-0.1% L-ציסטאין (BHIS). יש להשתמש באגר 1.5% עבור כל הדגימות המצופות.
  2. נרמלו את מדיית תרבית החיידקים לצפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD600). צלחת 5 μL של כל macrocolony על BHIS + L-ציסטאין צלחות אגר ולגדול אנאירובית במשך 7 ימים ב 37 ° C. עבור מקרו-מושבות של מינים מעורבים, ערבבו את תרבית החיידקים ביחס של 1:1 לפני הציפוי.
  3. הכינו שקופיות מיקרוסקופ מצופות תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) באמצעות אומטר כדי לזהות את צד השקופית עם הציפוי המוליך. השתמש בסופר משובץ יהלומים כדי לחרוט ולתייג את הצד המצופה ITO של שקופית המיקרוסקופ.
  4. הוציאו את כל התרבית מצלחת הגידול של האגר ולאחר מכן הרכיבו אותה על מגלשת מיקרוסקופ מצופה ITO תוך הבטחה שבועות אוויר אינן כלואות בין האגר למגלשה.
    הערה: תכולת המים במצע האגר צריכה לאפשר לתרבית להיצמד באופן טבעי למשטח המגלשה במיקרוסקופ. סרטון המדגים תהליך זה מובא בתיעוד המשלים של Yang et al.22.
  5. מקמו את המושבות בקופסאות שקופיות במיקרוסקופ להגנה. אחסן את קופסאות השקופיות בגודל 8 אינץ' x 8 בשקיות הובלת דגימות מסוכנות ביולוגית עם חופן כדורי ייבוש ואטם למשלוח בן לילה להמשך עיבוד וניתוח.
    הערה: חשוב לשמור על סביבה יבשה עבור תרביות החיידקים כאשר הם נשלחים בתנאי סביבה כדי להאט את צמיחת החיידקים ואת חילוף החומרים ולשמור על קיבוע של דגימות החיידקים עד לניתוח. שיטת משלוח זו עברה אופטימיזציה באמצעות ניסויים נרחבים והיא עדיפה על פני משלוח המושבות הקפואות בקרח יבש. שינויי טמפרטורה משמעותיים לפני הייבוש נוטים לגרום לפירוק ולבעבוע מתחת לדגימת האגר הרכובה.

2. ייבוש סביבתי של C. difficile + E. faecalis חיידקי macrocolonies

  1. הסר את מושבות חיידקי האגרוז המותקנות על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ITO מחומר האריזה. מניחים את הדגימות בקופסה יבשה עם חומר ייבוש למשך 48-72 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: זהו תהליך ייבוש עדין ואיטי הממזער בעבוע, סדיקה או ניתוק של מדיית האגר משטח השקופיות של המיקרוסקופ.
  2. יש להשליך כראוי את כל חומרי האריזה המזוהמים ולטהר את סביבת העבודה בחומר חיטוי מתאים.
  3. בדוק חזותית את המושבות עבור עיוותים במשטח אגר (למשל, מבעבע, סדק, פורק).
    הערה: גובה משטח האגרוז אמור לרדת באופן ניכר לעין ולשכב שטוח על פני המגלשה.

3. ואקום וייבוש בתיווך חום של C. difficile + E. faecalis חיידקי macrocolonies

הערה: נבנה מתקן ייבוש ואקום מותאם אישית (איור 1) כדי להקל על הסרת לחות עודפת מדגימות האגר. מכשיר זה משתמש במשאבת ואקום סיבובית המחוברת בקו לביו-פילטר HEPA, מלכודת קור ותא נירוסטה, שבו ממוקמות דגימות החיידקים. שנאי מתח משתנה מחובר לחוט נימה מבודד, המאפשר למשתמש לחמם את התא כדי לזרז את תהליך הייבוש.

  1. סגור את קו הוואקום לתא הדגימה והפעל את מתג ההפעלה למשאבת השדרה הסיבובית כדי לאפשר למשאבת הוואקום להתחמם ולהשיג לחץ ואקום תקין.
  2. הפעל את שנאי המתח המשתנה כדי לחמם את חוט הלהט הכרוך סביב התא. התאם את ספק הכוח המשתנה עד שהטמפרטורה הפנימית של תא הוואקום תגיע ~ 50 ° C. בזמן שהמשאבה מתחממת, הכניסו תרחיף של קרח יבש ו-100% אתנול לתוך המעבה של מלכודת הקור.
    הערה: מלכודת הקור מעבה אדים או נבגים מהדגימה ומונעת זיהום של מערכת משאבת השדרה הסיבובית ושמן משאבת הוואקום.
  3. פתח את תא הוואקום באמצעות מפתח ברגים כדי לשחרר את מהדקי האוגן הכפולים בקוטר 16 מ"מ. הכניסו את דגימות האגרוז לתא ואטמו את התא בחוזקה עם מהדקי אוגן טופר כפולים בקוטר 16 מ"מ.
  4. פתח את שסתום המשאבה כדי לפנות את החדר. הניחו לדגימות להתייבש במשך 60-120 דקות (למשל, ב~150 mTorr).
    הערה: זמן ייבוש זה מספיק כדי להסיר את רוב הלחות בחלקי אגר קטנים. קביעה אמפירית של זמן הייבוש האופטימלי להסרת לחות והקטנת גובה האגר עשויה להיות נחוצה בהתאם להגדרה האישית ולדגימות. זמני ייבוש ארוכים משמעותית עלולים לגרום לאגר המיובש להיות שביר ונוטה להיסדק.
  5. בסיום, אווררו באיטיות את תא הוואקום ללחץ הסביבה על ידי סגירת השסתום במשאבת השדרה הסיבובית ופתיחת השסתום החיצוני לאוויר הסביבה. פתח את התא באמצעות הפרוטוקול שהוזכר לעיל והסר את דגימת האגרוז המיובשת מהחדר.
  6. יש לאחסן את הדגימה בקופסה יבשה עם חומר ייבוש עד ליישום המטריצה.
    הערה: איור 2 מציג תמונות של משטח האגר לפני ואחרי הייבוש.

4. יישום מטריצה MALDI באמצעות ריסוס רובוטי

הערה: לאחר שדגימות האגרוז יובשו היטב וגובה קטעי התרבית ירד במידה ניכרת, השתמש במרסס מטריצה רובוטי כדי להחיל באופן הומוגני ציפוי דק של תרכובת מטריצה כימית MALDI. הליך זה צריך להתבצע במכסה אדים כימי ועם ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, משקפי מעבדה ומעיל מעבדה.

  1. בחר את מטריצת MALDI המתאימה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש במטריצת MALDI 1,5-diaminonaphthalene (DAN) עבור ספיחה חיובית שלה ויינון של חומצות אמינו במצב יונים שליליים.
  2. הכינו 10 מ"ל של תמיסת מטריצה של 10 מ"ג/מ"ל דן מאלדי ב-90/10 (v/v) אצטוניטריל/מים. השתמש בממיסים באיכות HPLC, בצע סוניזציה למשך 30 דקות וסנן את התמיסה דרך מסנני מזרק ניילון 0.2 מיקרומטר לפני הכניסה למשאבת מזרק הריסוס הרובוטית. בנוסף, הכינו תמיסות כביסה כדי להבטיח שקו הריסוס נקי בין כל שימוש.
    הערה: תמיסות שטיפה נבחרות כדי להגביר את מסיסות המטריצה ומזהמים אחרים בקו הריסוס ולהקל על הוצאתם מהמערכת. תמיסות השטיפה המשמשות כאן הן 90/10 (v/v) אצטוניטריל/מים, 50/50 (v/v) מים/מתנול, 99/1 (v/v) אצטוניטריל/חומצה אצטית, ו-95/5 (v/v) מים/אמוניום הידרוקסיד.
  3. חברו את הדגימה למגש הריסוס והעמיסו את התמיסות המוכנות לקו הריסוס (איור 3). באמצעות תוכנת המחשב, ציין את הפרמטרים הדרושים כדי לאפשר ציפוי אחיד של תרכובת המטריצה: טמפרטורת זרבובית 30 °C, שמונה מעברים, קצב זרימה של 0.1 מ"ל / דקה, תבנית CC, זמן ייבוש של 0 שניות, 10 psi.
    הערה: מקובל שרוב הפתוגנים יושבתו על ידי יישום של מטריצת MALDI, שהיא בדרך כלל חומצה אורגנית קטנה או בסיס.
  4. לאחר סיום רצף הריסוס, מוציאים את הדגימה ממגש הריסוס ומאחסנים בארון ייבוש עד לניתוח.

5. הכנת מקרוקולוניות חיידקים לרכישת נתונים בספקטרומטריית מסות של הדמיית MALDI

הערה: כל ניתוחי ספקטרומטריית המסות של הדימות בוצעו באמצעות ספקטרומטר מסות FTICR (Port transform ion cyclotron resonance). מכשיר זה מצויד במערכת לייזר Nd:YAG MALDI (2 קילוהרץ, 355 ננומטר).

  1. הכנס את הדגימה המצופה מטריצה למתאם השקופיות של מיקרוסקופ צלחת המטרה MALDI ורשום לפחות שלושה סמנים פידוקיאליים המקיפים את אזור הדגימה באמצעות סמנים קבועים (איור 4). השתמש בסורק שטוח כדי לקבל תמונה אופטית של שקופית המיקרוסקופ כולל הסמנים הפידוקיאליים.
    הערה: הסמנים הפידוקיאליים יאפשרו את רישום התמונה האופטית לתצוגת המצלמה MALDI שנצפתה במכשיר.
  2. הגדר שיטת מכשיר MS הממוטבת לטווח המסות, הרגישות והרזולוציה הרצויים, הכוללת כיול מסה, הגדרות לייזר MALDI, פרמטרים של אופטיקת יונים ותנאי תאי ICR. בשיטה זו, בחר חלון מסה של 100 Da מ- m/z 100 עד 200 להעשרת אות פאזת גז במצב יון שלילי באמצעות גישת הצטברות רציפה של יונים נבחרים (CASI),23 המקיפה את ערכי m/z של המטבוליטים המעניינים.
  3. פתח את תוכנת רכישת התמונה של המכשיר והשתמש באשף ההתקנה כדי להגדיר את שם הקובץ והמיקום, את שיטת רכישת MS, אזורים מעניינים לדגימה, ואת הרזולוציה המרחבית של התמונה.
    הערה: רזולוציות מרחביות של 100-300 מיקרומטר משמשות בדרך כלל להדמיית מקרוקולוני חיידקים.
  4. לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו, התחל את רצף הרכישה כדי לרכוש באופן סדרתי ספקטרום מסה בכל פיקסל על פני האזורים המוגדרים של עניין.
    הערה: זמן רכישת התמונה תלוי בהגדרות המכשיר, אך בדרך כלל נע בין 2 ל-6 שעות בתמונות המכילות 5,000-10,000 פיקסלים.

6. הדמיה, ספקטרומטריית מסות, ניתוח נתונים וזיהוי תרכובות;

  1. לאחר רכישת תמונה, שמור את הנתונים עם סיומת הקובץ ".mis", שהיא תבנית קובץ ספציפית לספק עבור פלטפורמות ספקטרומטריית מסות הדמיה. פתח את קובץ הנתונים בחבילות תוכנה flexImaging או SCiLS או יצא לתבנית נתונים שאינה קניינית, כגון .mzml, והצג באופן חזותי באמצעות תוכנה ניטרלית של הספק (לדוגמה, Cardinal24 או MSIreader25,26).
    הערה: ספקטרום מסה ממוצע מוצג בעת פתיחת נתוני ההדמיה ב- flexImaging, המייצג את העוצמות הממוצעות של כל היונים שזוהו באזורים שנדגמו. ניתן לזהות פסגות עניין באופן טנטטיבי על סמך מדידות מסה מדויקות. בדרך כלל, דיוקי מסה של יותר מ -5 חלקים למיליון (ppm) מספיקים לזיהוי מטבוליטים בספקטרומטרים של מסות FTICR.
  2. באמצעות התוכנה המוזכרת, הגדר חלונות מסה עבור פסגות עניין כדי ליצור מפות חום בצבע כוזב של התפלגות יונים על פני האזורים שנדגמו.
    1. בתצוגת ספקטרום המסה הממוצעת , התקרבו לשיא העניין ובחרו חלון מסה מתאים המקיף את האזור של פרופיל הפסגה.
    2. לחץ לחיצה ימנית על חלון המסה המסומן ובחר הוסף מסנן מסה.... תייג את ערך m/z שנבחר באמצעות זיהוי טנטטיבי עבור המטבוליט החשוד כפי שנקבע על ידי מדידת המסה המדויקת ברזולוציה גבוהה.
    3. בחרו בסף העוצמה כדי להתאים את הטווח הדינמי של התמונה האנליטית המוצגת במפת החום בצבע כוזב. התאימו עוד יותר את פרמטרי סינון המסה כך שחלון המסה יקיף את האזור של פרופיל הפסגה, ולאחר מכן הוסיפו את מסנן המסה.
      הערה: ניתן לבצע נורמליזציה של עוצמה בהתאם לצורך כדי לשפר את הכימות היחסי בין האזורים הנמדדים. הניסויים כאן השתמשו ברכישת נתוני CASI (vide infra), שעלולה להפוך את שיטות הנורמליזציה של ספירת היונים הכוללת (TIC) וריבוע ממוצע השורש (RMS) ללא מדויקות. לפיכך, כל תמונות היונים המוצגות כאן מוצגות ללא נורמליזציה.

7. הכנה ומשלוח של בקרה לא נגועה ורקמות CECAL נגועות בעכבר C. difficile

  1. יש לטבול עכברים זכרים C57BL/6 בני 4-8 שבועות עם אנטיביוטיקה (0.5 מ"ג / מ"ל cefoperazone או 0.5 מ"ג / מ"ל cefoperazone + 1 מ"ג / מ"ל vancomycin) במי שתייה ad libitum במשך 5 ימים, ולאחר מכן תקופת החלמה של יומיים וזיהום לאחר מכן.
  2. הרדימו את בעלי החיים על ידי חנקCO2 וקצרו את איבר הצקום של העכבר באופן מיידי. יש להטמיע בתערובת של 20% של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) במים מזוקקים.
  3. מניחים את הדגימות על קרח יבש ולאחר מכן לארוז ולשלוח לניתוח; יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח.

8. Cryosectioning של בקרת לא נגוע verus C. difficile -נגוע עכבר רקמות cecal נגוע

  1. נקה את כל ציוד ההקפאה על ידי שטיפה עם 100% אתנול ואפשר להתייבש לפני הכנסת הדגימות לתא ההקפאה. הכן שקופיות מיקרוסקופ מצופות ITO באמצעות אומטר כדי לזהות את הצד של השקופית עם הציפוי המוליך. השתמש בסופר משובץ יהלומים כדי לחרוט ולתייג את הצד המצופה ITO של שקופית המיקרוסקופ.
    הערה: יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, משקפי מעבדה, מעיל מעבדה ושרוולי הקפאה.
  2. בצע cryosectioning על cryomicrotome מחקר. העבר את רקמות ceca העכבר המוטבעות OCT ממקפיא -80 ° C לתא cryomicrotome (טמפרטורת תא 30 ° C, -28 ° טמפרטורת אובייקט צלזיוס) על קרח יבש. הרכיבו את דגימות הרקמה להשוואה באמצעות ספקטרומטריית מסות הדמיה (למשל, בקרה לא נגועה לעומת C. difficile-infected) על אותה שקופית מיקרוסקופ כדי להבטיח הכנת דגימה זהה של שני סוגי הרקמה ולאפשר השוואות מטבוליטים מדויקות.
  3. בתוך תא הקריומיקרוטום, הרכיבו את הרקמה המוטבעת ב-OCT על צ'אק דגימה באמצעות תמיסת OCT נוספת. לאחר שתמיסת OCT התמצקה, קבע את הצ'אק לראש הדגימה. התחל בהקפאה במרווחים של 10-50 מיקרומטר כדי להגיע לעומק/מישור הרקמה הרצוי של האיבר.
  4. לאחר שמגיעים לחתך אופטימלי של הרקמה, מתחילים לאסוף חתכים בעובי 12 מיקרומטר. טפלו בעדינות את הפרוסה בעזרת מברשות צבע אמנותיות והניחו אותה על שקופית מיקרוסקופ מצופה טפלון.
  5. גלגלו את שקופית המיקרוסקופ המצופה ITO על גבי מקטע הרקמה כדי להרים את הרקמה מהמגלשה המצופה טפלון. הפשרה הרכיבו את מקטע הרקמה על מגלשת המיקרוסקופ על ידי לחיצה על כף היד לחלק האחורי של המגלשה המצופה ITO. ממשיכים להפשיר עד שמקטע הרקמה הופך משקוף למרקם אטום/מט.
  6. העבירו את שקופיות המיקרוסקופ המורכב על רקמות על קרח יבש לקופסה יבשה עם חומר מייבש לאחסון לניתוח באותו יום, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך יותר.

9. הכנת בקרה לא נגועה לעומת C. difficile -נגוע רקמות cecal עכבר נגוע עבור יישום מטריצה ו MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

  1. בצע יישום מטריצה MALDI באמצעות אותו פרוטוקול המתואר בשלב 4 (טמפרטורת זרבובית 30 ° C, שמונה מעברים, קצב זרימה של 0.1 מ"ל / דקה, תבנית CC, זמן ייבוש של 0 שניות, 10 psi).
  2. בצע ספקטרומטריית מסה של דימות MALDI באמצעות אותם פרוטוקולים המתוארים בשלבים 5 ו- 6.
  3. נתחו את תמונות היונים משכפלים ביולוגיים מרובים והשוו את התוצאות לקבלת מובהקות באמצעות השוואות תרשים של קופסאות עוצמה באמצעות התוכנה הסטטיסטית SCiLS שהוזכרה לעיל.
    הערה: המבחנים וההשוואות הסטטיסטיים המתאימים יהיו תלויים ביישום ויכולים לכלול פילוח מרחבי, מודלים לסיווג וניתוח השוואתי לקביעת תכונות ספקטרליות מפלות ומתואמות. ניתוחים השוואתיים יכולים לכלול הקצאת ערכי p לתכונות משמעותיות, יצירת ניתוחי רכיבים עיקריים להשוואות רקמות והצגה חזותית של תרשימי תיבות כדי לזהות וריאציות. כדאי גם לדמיין את הרקמה באמצעות מיקרוסקופ brightfield של קטע הרקמה המוכתם באמצעות hematoxylin ו eosin (H&E) לאחר ספקטרומטריית מסה הדמיה. הדבר מאפשר זיהוי ברור של תכונות מורפולוגיות ברקמה וניתן לנתח אותו בהתייעצות עם פתולוג מיומן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ביצענו ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI מטבוליט של מושבות חיידקי מודל ועכברים שעברו קולוניזציה משותפת עם E. faecalis ו-C. difficile כדי לחקור את תפקידן של חומצות אמינו באינטראקציות מיקרואורגניזם-מיקרובים. מקרומושבות חיידקים הגדלות על אגר משמשות כמודל מוגדר היטב לניתוח שינויים ביוכימיים מו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במהלך ספקטרומטריית מסות הדמיית MALDI, חשוב שיהיה משטח דגימה שטוח כדי לספק קוטר מוקד עקבי של לייזר MALDI האירוע על מצע הדגימה. סטיות בגובה הדגימה עלולות לגרום לקרן הלייזר MALDI לצאת מהמיקוד, ולגרום לשינויים בקוטר הקרן ובעוצמה, שיכולים להשפיע על יעילות היינון של MALDI. שינויים אלה ביעילות היינון יכול?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS) תחת הפרס GM138660. J.T.S. נתמך על ידי מלגת הקיץ של משפחת צ'ארלס ומוניקה בורקט מאוניברסיטת פלורידה. J.P.Z. נתמך על ידי מענקי NIH K22AI7220 (NIAID) ו- R35GM138369 (NIGMS). ABS נתמך על ידי מענק הכשרה לביולוגיה תאית ומולקולרית באוניברסיטת פנסילבניה (T32GM07229).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm Titan3 nylon syringe filtersThermo Scientific42225-NN
1,5-diaminonaphthalene MALDI matrixSigma Aldrich2243-62-1
20 mL Henke Ject luer lock syringesHenke Sass Wolf4200.000V0 
275i series convection vacuum gaugeKurt J. Lesker companyKJL275807LL
7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) Bruker Daltonics
Acetic acid solution, suitable for HPLCSigma Aldrich64-19-7
Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%Sigma Aldrich75-05-8
Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basisSigma Aldrich1336-21-6
Autoclavable biohazard bags: 55 galGrainger45TV10
Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.)Fisher Scientific01-800-07
Brain heart infusion brothBD Biosciences90003-040
C57BL/6 male mice Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II photo and document scannerCanon
CM 3050S research cryomicrotomeLeica Biosystems
Desiccator cabinetSigma AldrichZ268135
Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific50-254-51
Drierite desiccant pelletsDrierite21005
Ethanol, 200 ProofDecon Labs2701
flexImaging softwareBruker Daltonics
ftmsControl softwareBruker Daltonics
Glass vacuum trapSigma AldrichZ549460
HTX M5 TM robotic sprayerHTX Technologies
Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slidesDelta TechnologiesCG-81IN-S115
In-line HEPA filter to vacuum pumpLABCONCO7386500
Methanol, HPLC GradeFisher Chemical  67-56-1
MTP slide-adapter IIBruker Daltonics235380
Optimal cutting temperature (OCT) compoundFischer Scientific23-730-571
Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and CleanerCONTECCR85335 
PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy SciencesVWR100488-874
Rotary vane vacuum pump RV8EdwardsA65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome BladesElectron Microscopy Sciences63068-HP
Transparent vacuum tubingCole PalmerEW-06414-30
Ultragrade 19 vacuum pump oilEdwardsH11025011
Variable voltage transformerPowerstat
Water, suitable for HPLCSigma Aldrich7732-18-5
Wide-mouth dewar flaskSigma AldrichZ120790

References

  1. Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
  2. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  3. Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
  4. Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
  5. Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
  6. Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313(2014).
  7. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490(2019).
  8. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  9. Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
  10. Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
  11. Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
  12. Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
  13. Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951(2016).
  14. Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
  15. Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
  16. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  17. Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
  18. Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387(2020).
  19. Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
  20. Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869(2020).
  21. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
  22. Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
  23. Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
  24. Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
  25. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
  26. Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
  27. Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
  28. Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
  29. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  30. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
  31. Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
  32. Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
  33. Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved