Studio della cooperazione microbica mediante spettrometria di massa per immagini Analisi di colonie batteriche cresciute su agar e nei tessuti durante l'infezione

Riepilogo

Viene dimostrato un nuovo metodo di preparazione del campione per l'analisi di macrocolonie batteriche a base di agar mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.

Abstract

Comprendere le conseguenze metaboliche delle interazioni microbiche che si verificano durante l'infezione rappresenta una sfida unica nel campo dell'imaging biomedico. La spettrometria di massa con imaging a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) rappresenta una modalità di imaging in situ senza etichetta in grado di generare mappe spaziali per un'ampia varietà di metaboliti. Mentre i campioni di tessuto sottilmente sezionati vengono ora analizzati di routine tramite questa tecnologia, le analisi di spettrometria di massa di imaging di substrati non tradizionali, come le colonie batteriche comunemente coltivate su agar nella ricerca microbiologica, rimangono impegnative a causa dell'elevato contenuto di acqua e della topografia irregolare di questi campioni. Questo documento illustra un flusso di lavoro di preparazione dei campioni per consentire l'analisi di spettrometria di massa di imaging di questi tipi di campioni. Questo processo è esemplificato utilizzando macrocolonie di co-coltura batterica di due patogeni gastrointestinali: Clostridioides difficile e Enterococcus faecalis. Lo studio delle interazioni microbiche in questo ambiente di agar ben definito ha anche dimostrato di integrare gli studi sui tessuti volti a comprendere la cooperazione metabolica microbica tra questi due organismi patogeni in modelli murini di infezione. Le analisi di spettrometria di massa per immagini dei metaboliti aminoacidici arginina e ornitina sono presentate come dati rappresentativi. Questo metodo è ampiamente applicabile ad altri analiti, patogeni microbici o malattie e tipi di tessuto in cui è richiesta una misura spaziale della biochimica cellulare o tissutale.

Introduzione

Il microbioma umano è un ecosistema altamente dinamico che coinvolge interazioni molecolari di batteri, virus, archea e altri eucarioti microbici. Mentre le relazioni microbiche sono state intensamente studiate negli ultimi anni, molto resta da capire sui processi microbici a livello chimico ^1,2. Ciò è in parte dovuto all'indisponibilità di strumenti in grado di misurare con precisione ambienti microbici complessi. I progressi nel campo della spettrometria di massa per immagini (IMS) nell'ultimo decennio hanno permesso la mappatura spaziale in situ e label-free di molti metaboliti, lipidi e proteine in substrati biologici ^3,4. Il desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI) è emerso come la tecnica di ionizzazione più comune utilizzata nella spettrometria di massa di imaging, che prevede l'uso di un laser UV per ablare materiale dalla superficie di una sezione di tessuto sottile per la misurazione mediante spettrometria di massa⁴. Questo processo è facilitato dall'applicazione di una matrice chimica applicata in modo omogeneo alla superficie del campione, consentendo di effettuare misurazioni sequenziali in uno schema raster sulla superficie del campione. Le mappe termiche delle intensità degli ioni analita vengono quindi generate in seguito all'acquisizione dei dati. I recenti progressi nelle sorgenti di ionizzazione e nelle tecniche di campionamento hanno permesso l'analisi di substrati non tradizionali come campioni cellulari batterici⁵ e ^6,7,8 di mammiferi cresciuti su agar nutriente. Le informazioni spaziali molecolari fornite dall'IMS possono fornire una visione unica della comunicazione biochimica delle interazioni microbo-microbo e ospite-microbo durante l'infezione 9,10,11,12,13,14.

Dopo l'infezione da Clostridioides difficile (CDI), C. difficile è esposto a un ambiente microbico in rapida evoluzione nel tratto gastrointestinale, dove le interazioni polimicrobiche possono avere un impatto sugli esiti dell'infezione^15,16. Sorprendentemente, si sa poco sui meccanismi molecolari delle interazioni tra C. difficile e microbiota residente durante l'infezione. Ad esempio, gli enterococchi sono una classe di patogeni commensali opportunistici nel microbioma intestinale e sono stati associati ad una maggiore suscettibilità e gravità di CDI^17,18,19,20. Tuttavia, si sa poco sui meccanismi molecolari delle interazioni tra questi patogeni. Per visualizzare la comunicazione di piccole molecole tra questi membri del microbioma intestinale, macrocolonie batteriche sono state coltivate qui su agar per simulare le interazioni microbi-microbi e la formazione di biofilm batterico in un ambiente controllato. Tuttavia, ottenere distribuzioni metaboliche rappresentative dopo l'analisi della spettrometria di massa di imaging MALDI di campioni di coltura batterica è difficile a causa dell'elevato contenuto di acqua e della topografia superficiale irregolare di questi campioni. Ciò è in gran parte causato dalla natura altamente idrofila dell'agar e dalla risposta superficiale non uniforme dell'agar durante la rimozione dell'umidità.

L'elevato contenuto di acqua dell'agar può anche rendere difficile ottenere un rivestimento omogeneo della matrice MALDI e può interferire con la successiva analisi MALDI eseguita nel vuoto²¹. Ad esempio, molte sorgenti MALDI operano a pressioni di 0,1-10 Torr, che è un vuoto sufficiente per rimuovere l'umidità dall'agar e può causare la deformazione del campione. Questi cambiamenti morfologici nell'agar indotti dall'ambiente sottovuoto causano gorgogliamento e fessurazioni nel materiale di agar essiccato. Questi artefatti riducono l'aderenza dell'agar al vetrino e possono causare lo smontaggio o lo sfaldamento del campione nel sistema di vuoto dello strumento. Lo spessore dei campioni di agar può arrivare fino a 5 mm dal vetrino, il che può creare un gioco insufficiente dall'ottica ionica all'interno dello strumento, causando contaminazione e/o danni all'ottica ionica dello strumento. Questi effetti cumulativi possono comportare riduzioni del segnale ionico che riflette la topografia superficiale, piuttosto che le interazioni biochimiche microbiche sottostanti. I campioni di agar devono essere essiccati in modo omogeneo e fortemente aderenti a un vetrino da microscopio prima dell'analisi sottovuoto.

Questo documento dimostra un flusso di lavoro di preparazione del campione per l'essiccazione controllata di macrocolonie di coltura batterica coltivate su terreni di agar. Questo processo di essiccazione più lento e in più fasi (rispetto a quelli precedentemente riportati) assicura che l'agar si disidrati uniformemente, riducendo al minimo gli effetti del gorgogliamento o della fessurazione dei campioni di agar montati su vetrini da microscopio. Utilizzando questo metodo di essiccazione graduale, i campioni sono fortemente aderenti al vetrino del microscopio e suscettibili per la successiva applicazione della matrice e l'analisi MALDI. Questo è esemplificato utilizzando colonie batteriche modello di C. difficile coltivate su modelli di tessuto agar e murino che ospitano CDI con e senza la presenza di patogeno commensale e opportunista, Enterococcus faecalis. Le analisi di spettrometria di massa di imaging MALDI di modelli batterici e tissutali consentono la mappatura spaziale dei profili dei metaboliti degli amminoacidi, fornendo nuove informazioni sul metabolismo e sulla comunicazione microbica bioenergetica.

Protocollo

NOTA: Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale pediatrico di Filadelfia e dalla Perelman School of Medicine dell'Università della Pennsylvania (protocolli IAC 18-001316 e 806279).

ATTENZIONE: Clostridium difficile (C. difficile) e Enterococcus faecalis (E. faecalis) sono patogeni BSLII e devono essere maneggiati con estrema cautela. Utilizzare protocolli di decontaminazione adeguati quando necessario.

1. Crescita di macrocolonie di coltura batterica e preparazione per la spedizione durante la notte

1. Preparare colture di C. difficile ed E. faecalis durante la notte e coltivarle singolarmente a 37 °C in camera anaerobica (85% azoto, 10% idrogeno, 5% anidride carbonica) in brodo di infusione cerebrale-cuore integrato con 0,5% di estratto di lievito e 0,1% di l-cisteina (BHIS). Utilizzare l'1,5% di agar per tutti i campioni placcati.
2. Normalizzare il terreno di coltura batterico alla densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀). Piastra 5 μL di ogni macrocolonia su piastre di agar BHIS + l-cisteina e crescere anaerobicamente per 7 giorni a 37 °C. Per le macrocolonie di specie miste, mescolare i terreni di coltura batterica in un rapporto 1: 1 prima della placcatura.
3. Preparare vetrini da microscopio rivestiti di ossido di indio-stagno (ITO) utilizzando un ohmmetro per identificare il lato del vetrino con il rivestimento conduttivo. Utilizzare uno scriba con punta di diamante per incidere ed etichettare il lato rivestito di ITO del vetrino del microscopio.
4. Estrarre l'intera coltura dalla piastra di crescita dell'agar e quindi montarla su un vetrino da microscopio rivestito con ITO, assicurandosi che le bolle d'aria non siano intrappolate tra l'agar e il vetrino.
   NOTA: Il contenuto di acqua nel mezzo di agar dovrebbe consentire alla coltura di aderire naturalmente alla superficie del vetrino del microscopio. Un video che esemplifica questo processo è fornito nella documentazione supplementare di Yang et ^al.22.
5. Posizionare le colonie in scatole di vetrini per microscopio per protezione. Conservare le scatole di scorrimento in 8 in x 8 in sacchetti per il trasporto di campioni a rischio biologico con una manciata di pellet essiccanti e sigillare per la spedizione durante la notte per ulteriori lavorazioni e analisi.
   NOTA: È importante mantenere un ambiente asciutto per le colture batteriche quando vengono spedite in condizioni ambientali per rallentare la crescita batterica e il metabolismo e mantenere la fissazione dei campioni batterici fino all'analisi. Questo metodo di spedizione è stato ottimizzato attraverso ampi esperimenti ed è preferito alla spedizione delle colonie congelate nel ghiaccio secco. I principali cambiamenti di temperatura prima dell'essiccazione tendono a causare lo smontaggio e il gorgogliamento sotto il campione di agar montato.

2. Essiccazione ad ambiente di macrocolonie batteriche di C. difficile + E. faecalis

1. Rimuovere le colonie batteriche di agarosio montate su vetrini da microscopio rivestiti di ITO dal materiale di imballaggio. Porre i campioni in una scatola asciutta con essiccante per 48-72 ore a temperatura ambiente.
   NOTA: Questo è un processo di essiccazione delicato e lento che riduce al minimo il gorgogliamento, la fessurazione o il distacco del mezzo di agar dalla superficie del vetrino del microscopio.
2. Smaltire correttamente tutto il materiale di imballaggio contaminato e decontaminare lo spazio di lavoro con un disinfettante battericida/sporicida appropriato.
3. Ispezionare visivamente le colonie per rilevare eventuali deformazioni nella superficie dell'agar (ad esempio, gorgogliamento, fessurazione, smontaggio).
   NOTA: L'altezza della superficie dell'agarosio dovrebbe diminuire visibilmente e giacere piatta su tutta la diapositiva.

3. Essiccazione sottovuoto e termomediata di macrocolonie batteriche C. difficile + E. faecalis

NOTA: È stato costruito un apparecchio di essiccazione sottovuoto costruito su misura (Figura 1) per facilitare la rimozione dell'umidità in eccesso dai campioni di agar. Questo apparecchio utilizza una pompa per vuoto rotativa a palette collegata in linea a un biofiltro HEPA, una trappola fredda e una camera in acciaio inossidabile, dove vengono posizionati i campioni batterici. Un trasformatore a tensione variabile è collegato a un filamento di filo isolato, che consente all'utente di riscaldare la camera per accelerare il processo di asciugatura.

1. Chiudere la linea del vuoto nella camera di campionamento e accendere l'interruttore di alimentazione della pompa rotativa a palette per consentire alla pompa per vuoto di riscaldarsi e ottenere la corretta pressione del vuoto.
2. Accendere il trasformatore a tensione variabile per riscaldare il filamento di filo avvolto attorno alla camera. Regolare l'alimentazione variabile fino a quando la temperatura interna della camera a vuoto raggiunge ~50 °C. Mentre la pompa si sta riscaldando, posizionare un impasto di ghiaccio secco e etanolo al 100% nel condensatore della trappola fredda.
   NOTA: La trappola fredda condensa eventuali vapori o spore dal campione ed evita la contaminazione del sistema di pompe rotative a palette e dell'olio della pompa per vuoto.
3. Aprire la camera a vuoto utilizzando una chiave per allentare i morsetti a flangia a doppio artiglio da 16 mm. Inserire i campioni di agarosio nella camera e sigillare ermeticamente la camera con i morsetti a flangia a doppio artiglio da 16 mm.
4. Aprire la valvola della pompa per evacuare la camera. Lasciare asciugare i campioni per 60-120 minuti (ad esempio, a ~150 mTorr).
   NOTA: Questo tempo di asciugatura è sufficiente per rimuovere la maggior parte dell'umidità in piccole sezioni di agar. La determinazione empirica del tempo di asciugatura ottimale per la rimozione dell'umidità e la riduzione dell'altezza dell'agar può essere necessaria a seconda della configurazione individuale e dei campioni. Tempi di asciugatura sostanzialmente più lunghi possono far sì che l'agar essiccato diventi fragile e incline a screpolature.
5. Al termine, sfiatare lentamente la camera a vuoto a pressione ambiente chiudendo la valvola sulla pompa rotativa a palette e aprendo la valvola esterna all'aria ambiente. Aprire la camera utilizzando il protocollo precedentemente menzionato e rimuovere il campione di agarosio essiccato dalla camera.
6. Conservare il campione in una scatola asciutta con essiccante fino all'applicazione della matrice.
   NOTA: La figura 2 mostra le immagini della superficie dell'agar prima e dopo l'essiccazione.

4. Applicazione della matrice MALDI tramite spruzzatura robotizzata

NOTA: Dopo che i campioni di agarosio sono stati accuratamente essiccati e l'altezza delle sezioni di coltura è notevolmente diminuita, utilizzare uno spruzzatore a matrice robotica per applicare in modo omogeneo un rivestimento sottile di un composto chimico della matrice MALDI. Questa procedura deve essere eseguita in una cappa aspirante chimica e con adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, occhiali da laboratorio e un camice da laboratorio.

1. Selezionare la matrice MALDI appropriata. Per seguire questo protocollo, utilizzare la matrice MALDI 1,5-diaminonaftalene (DAN) per il suo favorevole desorbimento e ionizzazione degli amminoacidi in modalità ioni negativi.
2. Preparare 10 mL di una soluzione di matrice Dan Maldi da 10 mg/mL in acetonitrile/acqua 90/10 (v/v). Utilizzare solventi di grado HPLC, sonicare per 30 minuti e filtrare la soluzione attraverso filtri a siringa in nylon da 0,2 μm prima dell'introduzione alla pompa a siringa spruzzatrice robotizzata. Inoltre, preparare soluzioni di lavaggio per garantire che la linea dello spruzzatore sia pulita tra ogni utilizzo.
   NOTA: Le soluzioni di lavaggio vengono scelte per aumentare la solubilità della matrice e di altri contaminanti nella linea dello spruzzatore e facilitarne la rimozione dal sistema. Le soluzioni di lavaggio qui utilizzate sono 90/10 (v/v) acetonitrile/acqua, 50/50 (v/v) acqua/metanolo, 99/1 (v/v) acetonitrile/acido acetico e 95/5 (v/v) acqua/idrossido di ammonio.
3. Attaccare il campione al vassoio dello spruzzatore e caricare le soluzioni preparate nella linea dello spruzzatore (Figura 3). Utilizzando il software del computer, specificare i parametri necessari per consentire un rivestimento uniforme del composto della matrice: temperatura dell'ugello 30 °C, otto passaggi, portata 0,1 mL/min, schema CC, tempo di asciugatura 0 s, 10 psi.
   NOTA: È generalmente accettato che la maggior parte dei patogeni sarà inattivata mediante l'applicazione della matrice MALDI, che è tipicamente un piccolo acido organico o base.
4. Al termine della sequenza di spruzzatura, rimuovere il campione dal vassoio dello spruzzatore e conservarlo in un armadio di essiccazione fino all'analisi.

5. Preparazione di macrocolonie batteriche per l'acquisizione dei dati di spettrometria di massa di imaging MALDI

NOTA: Tutte le analisi di spettrometria di massa per immagini sono state eseguite utilizzando uno spettrometro di massa a risonanza di ciclotrone ionico a trasformata di Fourier (FTICR). Questo strumento è dotato di un sistema laser Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm).

1. Inserire il campione rivestito di matrice nell'adattatore per vetrino per microscopio a piastre target MALDI e scrivere almeno tre marcatori fiduciali che racchiudono l'area del campione utilizzando marcatori permanenti (Figura 4). Utilizzare uno scanner piano per acquisire un'immagine ottica del vetrino del microscopio, compresi i marcatori fiduciali.
   NOTA: I marcatori fiduciali consentiranno la registrazione dell'immagine ottica alla vista della telecamera MALDI osservata nello strumento.
2. Definire un metodo di strumento MS ottimizzato per l'intervallo di massa, la sensibilità e la risoluzione desiderati, che include la calibrazione di massa, le impostazioni del laser MALDI, i parametri dell'ottica ionica e le condizioni delle celle ICR. Per questo metodo, selezionare una finestra di massa di 100 Da da m/z 100 a 200 per l'arricchimento del segnale in fase gassosa in modalità ioni negativi utilizzando un approccio di accumulo continuo di ioni selezionati (CASI),²³ che comprende i valori m/z dei metaboliti di interesse.
3. Aprire il software di acquisizione immagini dello strumento e utilizzare la procedura guidata di configurazione per definire il nome e la posizione del file, il metodo di acquisizione MS, le regioni di interesse da campionare e la risoluzione spaziale dell'immagine.
   NOTA: Risoluzioni spaziali di 100-300 μm sono tipicamente impiegate per l'imaging di macrocolonie batteriche.
4. Una volta definiti tutti i parametri, avviare la sequenza di acquisizione per acquisire in serie uno spettro di massa in ogni pixel attraverso le regioni definite di interesse.
   NOTA: il tempo di acquisizione delle immagini dipende dalle impostazioni dello strumento, ma in genere varia da 2 a 6 ore per le immagini contenenti 5.000-10.000 pixel.

6. Analisi dei dati di spettrometria di massa per immagini e identificazione dei composti

1. Dopo l'acquisizione delle immagini, salvare i dati con un'estensione di file ".mis", che è un formato di file specifico del fornitore per le piattaforme di spettrometria di massa di imaging. Aprire il file di dati in pacchetti software flexImaging o SCiLS o esportare in un formato di dati non proprietario come .mzml e visualizzarlo utilizzando software indipendente dal fornitore (ad esempio, Cardinal²⁴ o MSIreader^25,26).
   NOTA: all'apertura dei dati di imaging in flexImaging viene visualizzato uno spettro di massa medio, che rappresenta le intensità medie di tutti gli ioni rilevati nelle regioni campionate. I picchi di interesse possono essere identificati provvisoriamente sulla base di misurazioni accurate della massa. Tipicamente, precisioni di massa superiori a 5 parti per milione (ppm) sono sufficienti per l'identificazione dei metaboliti sugli spettrometri di massa FTICR.
2. Utilizzando il software di riferimento, definire finestre di massa per i picchi di interesse per generare mappe di calore a falsi colori delle distribuzioni ioniche attraverso le regioni campionate.
   1. Sulla visualizzazione media dello spettro di massa, ingrandire il picco di interesse e selezionare una finestra di massa appropriata che comprenda l'area del profilo del picco.
   2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di massa evidenziata e selezionare Aggiungi filtro di massa .... Etichettare il valore m /z selezionato utilizzando l'identificazione provvisoria per il metabolita sospetto come determinato dalla misurazione accurata della massa ad alta risoluzione.
   3. Selezionare la soglia di intensità per regolare la gamma dinamica dell'immagine dell'analita visualizzata dalla mappa termica a falsi colori. Regolare ulteriormente i parametri di filtraggio di massa in modo che la finestra di massa comprenda l'area del profilo di picco, quindi aggiungere il filtro di massa.
      NOTA: la normalizzazione dell'intensità può essere eseguita in modo appropriato per migliorare la quantificazione relativa tra le regioni misurate. Gli esperimenti qui riportati hanno utilizzato l'acquisizione dei dati CASI (vide infra), che può rendere imprecisi i metodi di normalizzazione del conteggio totale degli ioni (TIC) e del quadrato medio della radice (RMS). Pertanto, tutte le immagini ioniche mostrate nel presente documento vengono visualizzate senza normalizzazione.

7. Preparazione e spedizione di tessuti cecali di topo non infetti e infetti da C. difficile

1. Innoculare topi maschi C57BL/6 di 4-8 settimane con antibiotici (0,5 mg/ml di cefoperazone o 0,5 mg/ml di cefoperazone + 1 mg/ml di vancomicina) in acqua potabile ad libitum per 5 giorni, seguiti da un periodo di recupero di 2 giorni e successiva infezione.
2. Eutanasia gli animali mediante asfissia CO₂ e raccogliere immediatamente l'organo cieco del topo. Incorporare in una miscela al 20% di composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) in acqua distillata.
3. Posizionare i campioni su ghiaccio secco e quindi imballare e spedire per l'analisi; conservare a -80 °C fino all'analisi.

8. Criosezionamento di tessuti cecali di topo non infetti da C. difficile

1. Pulire tutte le apparecchiature di criosezione risciacquando con etanolo al 100% e lasciare asciugare prima di posizionare i campioni nella camera del criostato. Preparare vetrini da microscopio rivestiti con ITO utilizzando un ohmmetro per identificare il lato del vetrino con il rivestimento conduttivo. Utilizzare uno scriba con punta di diamante per incidere ed etichettare il lato rivestito di ITO del vetrino del microscopio.
   NOTA: È necessario indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti, occhiali da laboratorio, un camice da laboratorio e maniche di criostato.
2. Eseguire la criosezione su un criomicrotomo di ricerca. Trasferire i tessuti ceca di topo incorporati in OCT da un congelatore a -80 °C alla camera di criomicrotomo (temperatura della camera di 30 °C, temperatura dell'oggetto di -28 °C) su ghiaccio secco. Montare i campioni di tessuto da confrontare utilizzando la spettrometria di massa di imaging (ad esempio, controllo non infetto vs. C. difficile-infetto) sullo stesso vetrino da microscopio per garantire una preparazione identica del campione di entrambi i tipi di tessuto e consentire confronti accurati dei metaboliti.
3. All'interno della camera di criomicrotomo, montare il tessuto incorporato in OCT su un mandrino campione utilizzando una soluzione OCT aggiuntiva. Dopo che la soluzione OCT si è solidificata, fissare il mandrino alla testa del campione. Iniziare la criosezione con incrementi di 10-50 μm per raggiungere la profondità / piano tissutale desiderato dell'organo.
4. Una volta raggiunta una sezione trasversale ottimale del tessuto, iniziare a raccogliere sezioni a 12 μm di spessore. Manipolare delicatamente la fetta usando pennelli artistici e posizionarla su un vetrino da microscopio rivestito in teflon.
5. Arrotolare il vetrino del microscopio rivestito ITO sulla parte superiore della sezione di tessuto per prelevare il tessuto dal vetrino rivestito in teflon. Scongelare la sezione di tessuto sul vetrino del microscopio premendo il palmo sul retro del vetrino rivestito di ITO. Continuare a scongelare il supporto fino a quando la sezione del tessuto passa da una texture traslucida a una opaca/opaca.
6. Trasferire i vetrini del microscopio montati su ghiaccio secco in una scatola asciutta con essiccante per la conservazione per l'analisi in giornata, o conservare a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

9. Preparazione di tessuti cecali di topo non infetti rispetto a quelli infettati da C. difficile per l'applicazione di matrici e spettrometria di massa con imaging MALDI

1. Eseguire l'applicazione della matrice MALDI utilizzando lo stesso protocollo descritto al punto 4 (temperatura ugello 30 ° C, otto passaggi, portata 0,1 ml / min, schema CC, tempo di asciugatura 0 s, 10 psi).
2. Eseguire la spettrometria di massa per imaging MALDI utilizzando gli stessi protocolli descritti nei passaggi 5 e 6.
3. Analizza le immagini ioniche da più repliche biologiche e confronta i risultati per la significatività tramite confronti di grafici a scatola di intensità utilizzando il software statistico SCiLS di cui sopra.
   NOTA: I test statistici e i confronti appropriati dipenderanno dall'applicazione e possono includere segmentazione spaziale, modelli di classificazione e analisi comparativa per determinare le caratteristiche spettrali discriminative e correlate. Le analisi comparative possono includere l'assegnazione di valori p a caratteristiche significative, la generazione di analisi delle componenti principali per i confronti dei tessuti e la visualizzazione di grafici a scatola per identificare le variazioni. È anche utile visualizzare il tessuto utilizzando la microscopia a campo chiaro della sezione di tessuto colorata tramite ematossilina ed eosina (H & E) dopo spettrometria di massa di imaging. Ciò consente una chiara identificazione delle caratteristiche morfologiche nel tessuto e può essere analizzato in consultazione con un patologo qualificato.

Risultati

Abbiamo eseguito la spettrometria di massa con imaging MALDI di colonie batteriche modello e topi co-colonizzati con E. faecalis e C. difficile per studiare il ruolo degli amminoacidi nelle interazioni microbo-microbo. Le macrocolonie batteriche coltivate su agar fungono da modello ben definito per analizzare i cambiamenti biochimici distinti nella formazione del biofilm batterico. È importante garantire un processo di essiccazione controllato per le macrocolonie di coltura batterica coltivate su terre...

Discussione

Durante la spettrometria di massa per imaging MALDI, è importante disporre di una superficie piana del campione per fornire un diametro focale costante del laser MALDI incidente sul substrato del campione. Le deviazioni nell'altezza del campione possono causare lo spostamento del raggio laser MALDI fuori fuoco, causando alterazioni del diametro e dell'intensità del fascio, che possono influire sull'efficienza della ionizzazione MALDI. Queste alterazioni nell'efficienza di ionizzazione possono provocare differenze nell'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Titan3 nylon syringe filters	Thermo Scientific	42225-NN
1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix	Sigma Aldrich	2243-62-1
20 mL Henke Ject luer lock syringes	Henke Sass Wolf	4200.000V0
275i series convection vacuum gauge	Kurt J. Lesker company	KJL275807LL
7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Acetic acid solution, suitable for HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis	Sigma Aldrich	1336-21-6
Autoclavable biohazard bags: 55 gal	Grainger	45TV10
Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.)	Fisher Scientific	01-800-07
Brain heart infusion broth	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 male mice	Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner	Canon
CM 3050S research cryomicrotome	Leica Biosystems
Desiccator cabinet	Sigma Aldrich	Z268135
Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific	50-254-51
Drierite desiccant pellets	Drierite	21005
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2701
flexImaging software	Bruker Daltonics
ftmsControl software	Bruker Daltonics
Glass vacuum trap	Sigma Aldrich	Z549460
HTX M5 TM robotic sprayer	HTX Technologies
Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides	Delta Technologies	CG-81IN-S115
In-line HEPA filter to vacuum pump	LABCONCO	7386500
Methanol, HPLC Grade	Fisher Chemical	67-56-1
MTP slide-adapter II	Bruker Daltonics	235380
Optimal cutting temperature (OCT) compound	Fischer Scientific	23-730-571
Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner	CONTEC	CR85335
PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Rotary vane vacuum pump RV8	Edwards	A65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades	Electron Microscopy Sciences	63068-HP
Transparent vacuum tubing	Cole Palmer	EW-06414-30
Ultragrade 19 vacuum pump oil	Edwards	H11025011
Variable voltage transformer	Powerstat
Water, suitable for HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Wide-mouth dewar flask	Sigma Aldrich	Z120790