人小胶质细胞样细胞:使用人突触体从诱导多能干细胞和 体外 活细胞吞噬测定中分化

摘要

该协议描述了人诱导多能干细胞（iPSC）成小胶质细胞样细胞进行 体外 实验的分化过程。我们还包括从iPSC衍生的下运动神经元生成人突触体的详细程序，该神经元可用作使用活细胞成像系统进行 体外 吞噬测定的底物。

摘要

小胶质细胞是骨髓来源的常驻免疫细胞，在大脑微环境中维持稳态，已成为多种神经系统疾病的关键参与者。由于人类细胞供应极其有限，研究人类小胶质细胞在健康和疾病中是一项挑战。源自人类个体的诱导多能干细胞（iPSC）可用于规避这一屏障。在这里，展示了如何将人iPSCs分化为小胶质细胞样细胞（iMGs）以进行 体外 实验。这些iMG表现出小胶质细胞的预期和生理特性，包括小胶质细胞样形态，适当标志物的表达和活性吞噬作用。此外，还提供了用于分离和标记源自人 iPSC 衍生的下运动神经元（i³LMN）的突触体底物的文档。活细胞纵向成像测定用于监测用pH敏感染料标记的人突触体的吞噬，从而可以研究iMG的吞噬能力。本文描述的方案广泛适用于研究人类小胶质细胞生物学和小胶质细胞对疾病的贡献的不同领域。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在CNS的发展中起着至关重要的作用。小胶质细胞在成人大脑中对于维持体内平衡和积极应对创伤和疾病过程也很重要。累积证据表明，小胶质细胞是多种神经发育和神经退行性疾病发病机制的关键因素^1，2。尽管目前关于小胶质细胞生物学的知识主要来自小鼠模型，但最近的研究阐明了小鼠和人类小胶质细胞之间的重要差异，强调了开发技术来研究人类小胶^质细胞的遗传学和生物学功能的必要性3^，4。从解剖的原代组织中分离小胶质细胞会严重改变小胶质细胞的特性⁵，这可能会混淆用这些细胞获得的结果。该方法的总体目标是将人iPSCs分化为iMG，从而提供细胞培养系统在基础条件下研究人小胶质细胞。此外，本文还包括使用全人模型系统的吞噬作用测定，作为研究iMGs功能的手段，既作为质量控制措施，又评估疾病背景下的iMG功能障碍。

最近在文献⁶，⁷，⁸，^9，10中出现了从iPSC分化小胶质细胞的多种方案。某些方案的潜在缺点包括延长或长时间的分化，添加多种生长因子和/或复杂的实验程序⁶，^9，10。在这里，展示了一种"用户友好"的分化方法，该方法通过将iPSC分化为称为原始巨噬细胞前体（PMP^）的前体细胞来概括小胶质细胞个体发生的各个方面7^，11。PMP如前所述生成，本文¹²中提供了一些优化。PMP模仿MYB非依赖性卵黄囊衍生的巨噬细胞，巨噬细胞在胚胎发育过程中通过在血脑屏障关闭之前侵入大脑而产生小胶质细胞¹³。为了最终将PMP分化为iMG，我们使用了基于Haenseler等人和Brownjohn等人的协议的快速简化的单一培养方法，并进行了一些修改以产生一种有效的小胶质细胞分化方法，其中iMG稳健地表达富含小胶质细胞的标记^7，8。这种分化方法可以在具有iPSC培养专业知识的实验室中复制，其研究目标是使用人类模型系统研究小胶质细胞生物学。

iPSC来源的小胶质细胞是用于 体外 实验的人小胶质细胞的生物学相关来源，是研究小胶质细胞典型功能（包括吞噬作用）的重要工具。小胶质细胞是大脑和中枢神经系统的专业吞噬细胞，它们清除细胞碎片、聚集蛋白和降解的髓磷脂¹⁴。小胶质细胞还通过吞噬突触在突触重塑中发挥作用，并通过病原体的吞噬作用防御外部感染^15，16。在该协议中，使用人突触体作为iMG吞噬的材料评估iMG的吞噬作用。为此，描述了分离源自人类i³LMN的突触体的描述。i³LMN衍生的人突触体用pH敏感染料标记，该染料允许在吞噬体加工和体外降解过程中定量位于酸性区室内的突触 体。显示了使用活细胞显微镜的吞噬作用测定，用于实时监测小胶质细胞吞噬的动态过程。该功能测定为使用完整的人体系统研究健康和疾病中小胶质细胞吞噬作用的可能缺陷奠定了基础。

研究方案

注意:本协议中使用的所有试剂必须是无菌的，并且所有步骤必须在无菌条件下在生物安全柜中进行。所有iPSC细胞系以及维护和分化培养基均在材料表中进行了描述。下面图示的小胶质细胞分化方法基于先前发表的方案⁷，^8，12，并在此描述新的修改。

1.小胶质细胞分化

注意: 图 1 总结了该协议的概述。

1. 诱导多能干细胞 （iPSC） 培养
   注意:描述iPSC培养技术的更多详细信息可在别处找到¹⁷。
   1. 解冻和维护
      1. 制备 iPSC培养基，分装培养基，并在-20°C下储存长达6个月。将等分试样在4°C下解冻过夜，并使用长达1周。使用前将介质在环境温度下放置至少 1 小时。
      2. 通过加入 1 mL 的 10 μg/mL 层粘连蛋白 521 在含有钙和镁¹⁸ 的 DPBS 中稀释，涂覆 6 孔板的孔。将板保持在37°C和5%CO 2的培养箱中至少₂ 小时或优选过夜。稀释后，将层粘连蛋白在4°C下储存3个月。
      3. 通过在无菌水中稀释来制备10mM Rho激酶抑制剂Y27632（ROCK抑制剂）储备溶液。制作一次性等分试样的ROCK抑制剂溶液，并将其在-20°C下储存长达1年。
      4. 通过在DPBS中稀释0.5M EDTA的储备溶液来制备0.5mM EDTA。
      5. 要解冻一瓶冷冻的iPSC，请将小瓶置于37°C的水浴中，直到大部分解冻。立即将小瓶的内容物转移到含有 4 mL iPSC 培养基的 15 mL 锥形管中。以500× g 离心1分钟。
      6. 吸出上清液并通过在管壁上缓慢加入 1 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的 iPSC 培养基 来重悬细胞，以避免菌落紊乱。
      7. 向每个包被的孔中加入 1.5 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的 iPSC 培养 基，并将重悬菌落逐滴转移到含有培养基的孔中。
         注意:使用步骤1.1.1.6中的5-7滴进行培养维持，但调整每个iPSC系的最佳接种密度。
      8. 通过手动左右和从后到前洗牌，将细胞均匀分布在孔中。将细胞置于37°C和5%CO₂的培养箱中。第二天，通过添加不含ROCK抑制剂的新鲜 iPSC 培养基来完全更换培养基。
      9. 为了维持，每天更换培养基，直到细胞达到80%汇合。
         注意:如果使用的 iPSC 培养基允许灵活的补给时间表，则可以在不更换培养基的情况下保持细胞2天。建议将其限制为每次传代一次，并且仅在细胞汇合度低于50%的情况下。
   2. 分裂
      1. 吸出培养基并用 1 mL DPBS（不含钙和镁）洗涤细胞。
      2. 为了去除细胞，加入 1 mL 的 0.5 mM EDTA 并在室温下孵育 2-3 分钟，直到细胞集落的边缘从孔表面抬起。用DPBS再次洗涤细胞并加入1 mL iPSC培养基。
      3. 通过使用细胞提升器轻轻刮取细胞集落来解离细胞集落。只刮一次井的每个区域，以免打扰殖民地。
         注意:将菌落从井中移出的替代方法可以在其他地方找到¹⁷.
      4. 使用 1 mL 移液器吸头收集细胞并以 1:6 的比例（细胞与培养基）逐滴转移到含有 1.5 mL iPSC 培养基的预包被孔（如步骤 1.1.1.2 中所述）中。
2. iPSC 分化为小胶质细胞样细胞 （iMG）
   注意:将小分子和生长因子溶解在DPBS中无菌过滤的0.1%牛血清白蛋白中，至比最终浓度高1，000倍的原液浓度。建议在早期传代期间将iPSCs分化为iMG。建议对 iPSC 细胞系进行常规核型分析。
   1. 制备标准涂层溶液
      1. 将细胞外基质包衣试剂的储备溶液在4°C的冰上解冻过夜。
      2. 在4°C下预冷微量离心管和过滤移液器吸头。
      3. 将 250 μL 浓缩的细胞外基质包衣试剂分装到每个试管中，并立即置于冰上。将等分试样储存在-20°C。
      4. 为了制备包衣溶液，将细胞外基质包衣试剂之一在4°C的冰上解冻过夜。
      5. 将 50 mL 针对人类胚胎和诱导多能干细胞（称为 DMEM-F12）生长优化的冰冷 DMEM-F12 培养基中，并将其保存在冰上。
      6. 通过多次上下移液冰冷的 DMEM-F12 冷却 1 mL 移液器吸头，然后立即使用移液器吸头将 250 μL 细胞外基质包衣试剂转移到含有 DMEM-F12 培养基的锥形管中。
         注意:标准涂层溶液可在4°C下储存2周。
   2. 拟胚体 （EB） 形成
      1. 准备可在4°C下保持长达4天的 EB培养基 。
      2. 一旦iPSC达到80%汇合，通过用1mL DPBS洗涤并在37°C下加入1mL解离试剂2分钟来解离菌落。 使用细胞提升器通过多次刮擦来去除菌落以产生单细胞悬液。收集细胞并将所有细胞转移到含有 9 mL DPBS 的 15 mL 锥形管中。
      3. 将细胞以500 × g 离心1分钟，除去上清液，并将细胞重悬于1 mL EB培养基中。取 10 μL 细胞，用台盼蓝 1:1 稀释。用血细胞计数器计数细胞，并根据细胞计数，将细胞原液稀释至每 100 μL 10，000 个细胞的最终稀释度。对于电镀细胞，每孔向低粘附性圆底 96 孔板中加入 100 μL 稀释细胞。
         注意:通常，从iPSC的每个80%汇合孔中获得96孔板的48个孔。
      4. 将板以125 ×g 离心3分钟，并在37°C和5%CO₂ 下孵育4天。在第 2 天使用多通道移液器轻轻收集 50 μL 旧培养基，然后重新加入 50 μL 新鲜 EB 培养基，进行半 培养基更换。
         注意:在第4天，iPSCs将形成称为EB的球形细胞结构，如结果部分所述。如有必要，EB差异化过程可延长至7天。
   3. 原始巨噬细胞前体（PMP）的产生
      1. 制备 PMP基础培养基，无菌过滤器，并将其在4°C下储存长达1个月。
      2. 通过加入 1 mL 冰冷的 Matrigel 涂层溶液涂覆 6 孔板的孔，并在 37 °C 和 5% CO 2 下孵育至少₂ 小时或优选过夜。
      3. 在EB分化的第4天，通过用1 mL移液器吸头（使用移液器）收集EB，将EB转移到Matrigel包被的孔中。上下移液一次或两次，将EB从井中取出。以倾斜的角度握住 6 孔板，以使 EB 在孔的边缘沉降。
         注意:每个涂层孔可以镀九个或十个EB。
      4. 一旦所有EB稳定下来，轻轻移液并使用1 mL移液器吸头取出旧培养基，同时将EB保持在孔的边缘。向每个孔中加入 3 mL 新鲜制备的 PMP 完全培养基 。通过手动左右和从后到前洗牌，将细胞均匀分布在孔中。将板置于37°C和5%CO₂的培养箱中。
      5. 7天内不要打扰板，以使EB附着在井底。之后，使用 PMP完全培养基进行半培养基更换。
         注意:此时，大多数EB应连接到板上。可以删除任何浮动的EB。
      6. 5-7天后，在4倍放大倍率的光场显微镜下检查EB，以确保它们附着在孔底。按照 1.2.3.5 中所述更改介质。在第 21 天，用 3 mL PMP 完全培养基进行 完全培养基更换。
         注意:此时漂浮在培养基中的髓系祖细胞可能很明显。这些细胞应在更换培养基期间丢弃。
      7. 在第 28 天，在上清液中寻找称为 PMP 的圆形细胞，并使用 10 mL 移液器和自动移液器收集含有 PMP 的培养基。注意不要打扰EB。将PMP和培养基转移到15 mL锥形管中，并按照步骤1.2.4中所述进行操作。
         注意:通常，来自同一iPSC系的PMP可以从6孔板的五个孔中收集，并汇集在单个15 mL锥形管中。
      8. 加入 3 mL 新鲜 PMP 完全培养基 以进一步维护 EB。由于PMP连续从EB中出现超过3个月，请按照步骤1.2.3.7和1.2.3.8中所述每4-7天收集一次（不要让培养基变色为黄色调）。
         注意:虽然PMP可以收集几个月，但它们可能会随着时间的推移而改变其表型。
   4. 与iMG的差异化
      1. 制备 iMG基础培养基 （材料表），无菌过滤器并将其在4°C下储存长达3周。
      2. 将PMP收集到15 mL锥形管中后，以200 × g 离心4分钟。吸出上清液并使用 1-2 mL iMG 基础培养基重悬 PMP。使用血细胞计数器计数细胞，取少量等分试样并用台盼蓝 1:1 稀释。
         注意:通常每周获得 0.5-1.5 × 10⁶ PMP，具体取决于 iPSC 系和 EB 培养的年龄。
      3. 再次以200×g离心其余细胞4分钟。将PMP稀释至所需浓度，使得使用新鲜制备的iMG完全培养基以~10^{5 /} cm²的密度将细胞接种在细胞培养处理的平板上。在10-12天内，每3-4天使用新鲜制备的iMG完全培养基进行半培养基更换，以实现终末分化。
         注意:此时，细胞应获得小胶质细胞样形态。为了确认PMP对小胶质细胞命运的承诺，进行了免疫荧光分析以证实富含小胶质细胞的标志物的表达，例如嘌呤能受体P2RY12和跨膜蛋白119（TMEM119）⁹。
      4. 为了保持细胞健康和活力，在iMG分化的第10至12天之间进行所有实验。

2. 使用运动神经元衍生的人突触体进行吞噬试验

1. 转录因子介导的iPSC衍生的下运动神经元的分化（i³LMN）
   注意:WTC11系将含有神经原蛋白-2（NGN2），胰岛-1（ISL1）和LIM同源盒3（LHX3）转录因子的hNIL诱导转录因子盒稳定插入CLYBL安全港位点，用于先前描述的分化过程¹⁷.iPSC线保持如步骤1.1.1中所述，但包被条件如步骤1.2.1中所述。由于不需要层粘连蛋白521，因此任何细胞外基质包被试剂都可用于培养将用于神经元分化的iPSC。使用前，将所有培养基平衡至环境温度至少1小时。
   1. 按照步骤 1.2.1 所述，用 5 mL 标准涂层溶液涂覆 10 cm 培养皿。
      注意:在这里，每个区分使用了 3-4 个 10 厘米的培养皿。
   2. 制备 诱导基培养基，无菌过滤器，并将其在4°C下储存长达3周。
   3. 准备 神经元培养基，无菌过滤器，并将其在4°C下储存长达2周。
   4. 通过在无菌水中混合 100 mM 硼酸、25 mM 四硼酸钠和 75 mM 氯化钠来制备硼酸盐缓冲液。将pH调节至8.5并无菌过滤。
   5. 一旦iPSC达到80%汇合，用DPBS洗涤细胞并通过添加0.5mM EDTA去除菌落。
      注意:每个 10 厘米的培养皿通常有两个孔就足够了。
   6. 将细胞在环境温度下孵育4-5分钟。取出 EDTA 并向每个孔中加入 3 mL 带有 HEPES 的 DMEM/F12。
   7. 使用细胞提升器刮取细胞，并使用 10 mL 移液器轻轻上下移液 2-3 次，从孔底部取出细胞。
   8. 将细胞收集在 15 mL 锥形管中，并以 300 × g 离心 3 分钟。
   9. 将细胞重悬于含有 10 μM ROCK 抑制剂的 3 mL iPSC 培养基 中，并使用血细胞计数器对其进行计数。
   10. 在预包被的 10 cm 培养皿中板 1.5 × 10 6^{个 iPSC} ，其中含有 12 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的 iPSC 培养基 。
   11. 第二天，取出培养基并用DPBS洗涤细胞。加入 12 mL 新鲜制备的 完全诱导培养基以诱导 转录因子的表达。
   12. 在第 2 天，用 5 mL 神经元包被溶液涂覆 10 cm 培养皿，该溶液用等体积的 0.1 mg/mL 聚-D-赖氨酸和 1 mg/mL 在硼酸盐缓冲液中稀释的聚-L-鸟氨酸制备。在37°C和5%CO₂下孵育过夜。
   13. 在第3天，用无菌水清洗涂有涂层的餐具3次，完全吸出水，并通过倾斜盘子并将它们部分暴露在生物安全柜内在环境温度下至少1小时，让培养皿干燥。
   14. 培养皿完全干燥后，在37°C和5%CO₂下用补充有15μg/ mL层粘连蛋白和40μM BrdU的6mL完全诱导培养基涂覆至少1小时。
       注意:建议进行BrdU处理以消除有丝分裂活性细胞，从而提高神经元培养物的纯度。BrdU对神经元健康的影响很小。
   15. 每 10 cm 培养皿用 3 mL 解离试剂处理分化细胞，并在环境温度下孵育 3-4 分钟。
   16. 在不去除解离试剂的情况下将 6 mL DPBS 添加到板中，并用 10 mL 移液管将溶液中的细胞上下移液 4-5 倍以解离细胞。
   17. 收集细胞悬液并将其通过 40 μm 细胞过滤器进入 50 mL 锥形管中。加入 1 mL 感应基培养 基 冲洗过滤器。
   18. 将细胞以300 × g 离心5分钟。吸出培养基并将细胞重悬于含有 40 μM BrdU 的 3 mL 完全诱导培养基 中。
   19. 用血细胞计数器计数细胞。通过将细胞稀释在含有40μM BrdU的6mL完全诱导培养基中而不除去步骤2.1.14中添加的包衣溶液，将每10cm培养皿中约2.5×10个⁶个细胞板到预包被的培养皿中。
   20. 在第4天，吸出培养基，用DPBS洗涤细胞1倍，并加入含有40μM BrdU的新鲜 完全诱导培养基 。
   21. 在第6天，吸出培养基，用DPBS洗涤细胞1倍，并加入补充有1μg/ mL层粘连蛋白的 神经元培养基 。
   22. 在第 9 天，用补充有 1 μg/mL 层粘连蛋白的新鲜神经元培养基代替培养基，更换培养基的 1/3^rd。
   23. 每 3-4 天用补充有新鲜 1 μg/mL 层粘连蛋白的神经元培养基进行半培养基更换，将^{i 3}个 LMN 再维持 25 天。
       注意:在这个时间点，i³LMN应该呈现具有长过程的神经元形态。神经元也倾向于形成细胞团块或细胞簇。有关如何验证i³LMN的分化的更详细描述可以在别处找到¹⁷。
2. 突触体纯化和标记
   注意:保持无菌条件并在生物安全柜内执行所有步骤。
   1. 用^{DPBS 清洗 i 3} 个 LMN 两次。
   2. 加入 2 mL 冰冷细胞裂解试剂用于分离突触体，在冰上孵育 2 分钟，并牢固地刮擦神经元。
   3. 将裂解物转移到多个2 mL微管（每管~1.5 mL裂解物）中，并在4°C下以1，200× g 离心10分钟。
      注意:在整个过程中将试管保持在冰上。
   4. 收集上清液（弃去沉淀）并在4°C下以15，000× g 离心20分钟。 在DPBS中保存并重悬含有具有相似体积（与原始裂解物）的5%DMSO的突触体的沉淀。
      注意:突触体可以立即用荧光团标记或储存在-80°C以备将来使用。
   5. 对所有试管进行二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定，以评估突触体制剂中蛋白质的总产量。
      注意:可以使用其他测定来测量蛋白质浓度。从不同制剂获得的总蛋白得率已列入 表1 作为参考。建议对突触体制剂进行蛋白质印迹分析，以确认突触前和突触后蛋白的存在。在这里，如前所述，选择突触前标记物突触素（SYP）和突触后标记物突触后密度蛋白95（PSD95）进行蛋白质印迹分析，如前^所述19。
   6. 制备100mM碳酸氢钠在水中的溶液，将pH调节至8.5，并无菌过滤。
   7. 将所用pH敏感染料的1mg冻干粉末溶解到150μLDMSO中。制作一次性等分试样并将其储存在-80°C。
   8. 在4°C下以15，000× g 离心突触体5分钟。
   9. 在 100 μL 100 mM 碳酸氢钠溶液中稀释多达 1 mg 突触体。
   10. 要标记突触体，每 1 mg 突触体加入 1 μL 重构 pH 敏感染料，并用铝箔覆盖反应以避免光照。使用摇管在室温下摇动2小时。
   11. 向管中加入1mL DPBS，并在4°C下以15，000× g 离心标记的突触体5分钟。
   12. 除去上清液并按照步骤2.2.11所述进行四次额外的洗涤。
   13. 在最后一次洗涤和旋转后，在不干扰沉淀的情况下尽可能多地去除上清液，并在DPBS中用5%DMSO重悬标记的突触体，体积为所需浓度（此处使用的0.7μg/ μL）。准备一次性等分试样并储存在-80°C。 确保避免光暴露在标记的突触体中。
3. 活细胞吞噬试验
   1. 将板 20-30 × 10⁴ PMP 放入 100 μL iMG 完全培养基中的 96 孔板中，并按照步骤 1.2.4 所示进行 10 天的分化过程。
   2. 在测定当天，通过将1滴活细胞核染色剂加入2mL iMG基础培养基中来制备核染色溶液。
   3. 96孔板每孔取出40 μL培养基，并使用多通道移液器加入10 μL核染色溶液。将板在37°C和5%CO₂ 下孵育2小时。
   4. 在冰上解冻标记的突触体，并使用水超声仪轻轻超声处理1分钟。立即将突触体转移回冰块。在 iMG完全 培养基中以每50μL培养基1μL突触体的比例稀释标记的突触体。
      注意:突触体的浓度取决于测定，可能需要优化。为了在培养基中保持相对较低的DMSO百分比（即0.1%或更低），建议每孔添加的突触体不要超过2μL。
   5. 作为阴性对照，用细胞松弛素D预处理一些孔以抑制肌动蛋白聚合，从而抑制吞噬作用。在 iMG完全培养基中制备60μM细胞松弛素D的溶液。向每个孔中加入10μL该溶液，终浓度为10μM，并在37°C和5%CO₂ 下孵育30分钟。
   6. 从培养箱中取出板并在10°C下孵育10分钟。将板保持在冰上，并加入50μL含有按步骤2.3.4制备的突触体的培养基。
   7. 将板在10°C下以270 ×g 离心3分钟，并将板保持在冰上直到成像采集。
4. 成像采集和分析
   1. 将板插入活细胞成像读数器并选择要分析的孔。
   2. 选择 20倍 物镜。
   3. 调整明场和蓝色（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]）通道的焦点、发光二极管 （LED） 强度、积分时间和增益。突触体荧光在初始时间点应可忽略不计。要聚焦于红色 （RFP） 通道，请使用明场通道作为参考。积分时间和增益可能因实验而异;对红色通道使用以下初始设置:LED:4、积分时间:250和增益:5。
   4. 选择每孔蒙太奇中要采集的单个图块的数量（在孔中心采集 16个图块 ，从而成像大约占总 孔面积的5%）。将 温度 设置为 37°C 和 所需的成像时间间隔 。
      注意:在本研究中，每1-2小时采集一次图像长达16小时。
   5. 打开分析软件。
      1. 打开包含图像的实验。单击 数据缩减 图标。
      2. 在菜单中，选择"成像处理"下的"成像拼接"，以使用表 2 中所述的参数从蒙太奇中的 4 x 4 个单独拼接创建完整图像。
      3. 创建拼接图像后，使用这些图像的 DAPI 和 RFP 通道定义强度阈值。打开图像并单击分析;在"分析"下，选择"蜂窝分析"，然后在"检测通道"下，在 DAPI 或 RFP 通道中选取拼接图像。转到"主掩码和计数"选项卡，并建立阈值和对象大小值，以正确选择DAPI通道中的细胞核或RFP通道中的突触体信号。用不同的图像重复该过程，直到可以应用于整个实验的参数得到优化。
         注意:建议值可在 表 2 中找到。
      4. 要计算细胞核的数量，请转到"数据缩减"菜单，然后在"图像分析"下选择"细胞分析"。转到主掩码和计数选项卡，在通道下，选择 DAPI 拼接图像并使用表 2 中所述的参数。
      5. 转到 "计算指标 "选项卡，然后选择 "单元格计数"。 要获取突触体信号的区域，请转到 "数据缩减 "菜单，然后在"分析 "下选择 "细胞分析"。
      6. 转到 主掩码和计数 选项卡，在 通道下，选择 RFP 拼接 图像并使用 表 2 中详述的参数。
      7. 转到 计算指标 选项卡，然后选择 对象总和区域。在 数据缩减 标签 ，单击 确定 并允许软件分析所有采集的图像。
      8. 导出每个时间点的对象 总和面积 和 像元计数 值。将 对象总和 面积除以 单元格计数以计算每个时间点的归一化面积。如果比较多种治疗或基因型，请使用公式（1）计算吞噬指数:
         （1）
      9. 保存结果并集成数据。

结果

为了使用该协议生成iMG，重要的是从未分化的iPSC开始，这些iPSCs显示出紧凑的集落形态和明确的边缘（图2A）。如EB形成部分所述维持的解离iPSC将形成球形聚集体，称为EB，其大小将增长到分化的第4天（图2B）。一旦EB被收集并在适当的条件下接种以产生PMP，它们就会附着在Matrigel涂层的板上，并且一层细胞将扩散并围绕球形聚集体（图2C...

讨论

此处描述的分化方案提供了一种有效的方法，可在~6-8周内获得iPSC衍生的小胶质细胞样细胞，具有高纯度和足够的产量，以进行免疫荧光实验和其他需要更多细胞数的测定。该协议在 1 周内产生了多达 1 × 10⁶ iMG，这允许蛋白质和 RNA 提取以及相应的下游分析（例如，RNASeq、qRT-PCR、蛋白质印迹、质谱）。也就是说，该协议的局限性是iMG的产量可能会限制某些应用。可以实施额外的修饰以积?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody	Wako Chemical USA	NC9288364	1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody	Abcam	ab6046	1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody	Abclonal	A6344	1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody	Millipore	MAB1596	1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM)	Sigma	B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (75 mM)	Sigma	S7653
Sodium tetraborate (25 mM)	Sigma	221732
Cell culture materials
6-well plates	Greiner Bio-One	657160
40 μm Cell Strainers	Falcon	352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated	CELLTREAT	229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile	CELLTREAT	229305
low adherence round-bottom 96-well plate	Corning	7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate	Corning	353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate	Corning	353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
Cell dissociation reagents
Accutase	Corning	25058CI	dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent	Life Technologies	12-605-010	dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning™	354230	Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine	Sigma	P7405	Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655	Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
mTeSR Plus Kit	STEMCELL Technology	100-0276	To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	final concentration 50 ng/mL
iPSC media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	final concentration 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	final concentration 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 100 ng/mL
PMP base media			final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-34	PeproTech or Biologend	200-34 or 577904	final concentration 100 ng/mL
iMG base media			final concentration 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES	Gibco	11330032	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E	Calbiochem	565790	final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline	Sigma	D9891	final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401	final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03	The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL	National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific Pierce	23227
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	87793	Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester	ThermoFisher Scientific	P36600	Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution	AMRESCO INC	K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D	Sigma		final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium	Corning	21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV	Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12	Gibco	12660012	Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017015	Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake	Benchmark		refer as tube shaker
Water sonicator	Elma	Mode Transsonic 310