Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Resumen

Este protocolo describe el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en células similares a la microglía para la experimentación in vitro . También incluimos un procedimiento detallado para generar sinaptosomas humanos a partir de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC que se pueden usar como sustrato para ensayos de fagocitosis in vitro utilizando sistemas de imágenes de células vivas.

Resumen

La microglía son las células inmunes residentes de origen mieloide que mantienen la homeostasis en el microambiente cerebral y se han convertido en un jugador clave en múltiples enfermedades neurológicas. El estudio de la microglía humana en la salud y la enfermedad representa un desafío debido al suministro extremadamente limitado de células humanas. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de individuos humanos pueden usarse para eludir esta barrera. Aquí, se demuestra cómo diferenciar las iPSC humanas en células similares a la microglía (iMG) para la experimentación in vitro . Estos iMG exhiben las propiedades esperadas y fisiológicas de la microglía, incluida la morfología similar a la microglía, la expresión de marcadores adecuados y la fagocitosis activa. Además, se proporciona documentación para aislar y etiquetar sustratos sinaptosómicos derivados de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC humanas (i³LMN). Se utiliza un ensayo de imagen longitudinal de células vivas para monitorear la absorción de sinaptosomas humanos marcados con un tinte sensible al pH, lo que permite investigaciones de la capacidad fagocítica de iMG. Los protocolos descritos en este documento son ampliamente aplicables a diferentes campos que investigan la biología de la microglía humana y la contribución de la microglía a la enfermedad.

Introducción

La microglía son las células inmunes residentes en el sistema nervioso central (SNC) y desempeñan un papel crucial en el desarrollo del SNC. La microglía también es importante en el cerebro adulto para mantener la homeostasis y responder activamente a los procesos de trauma y enfermedad. La evidencia acumulada muestra que la microglía es un contribuyente clave para la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas y del desarrollo neurológico ^1,2. Aunque el conocimiento actual sobre la biología microglial se ha derivado predominantemente de modelos de ratón, estudios recientes han dilucidado diferencias importantes entre la microglía murina y humana, subrayando la necesidad de desarrollar tecnologías para estudiar la genética y las funciones biológicas de la microglía humana ^3,4. El aislamiento de la microglía del tejido primario disecado puede modificar gravemente las propiedades de la microglía⁵, lo que podría confundir los resultados adquiridos con tales células. El objetivo general de este método es diferenciar las iPSC humanas en iMG, proporcionando así un sistema de cultivo celular para estudiar la microglía humana en condiciones basales. Además, aquí se incluye un ensayo de fagocitosis utilizando un sistema modelo totalmente humano como un medio para estudiar la funcionalidad de los iMG, tanto como medida de control de calidad como para evaluar la disfunción de la MGI en el contexto de la enfermedad.

Múltiples protocolos para la diferenciación de microglia de iPSCs han surgido recientemente en la literatura 6,7,8,9,10. Las desventajas potenciales de algunos protocolos incluyen períodos prolongados o largos de diferenciación, la adición de múltiples factores de crecimiento y/o procedimientos experimentales complejos ^6,9,10. Aquí, se demuestra un método de diferenciación "fácil de usar" que recapitula aspectos de la ontogenia de la microglía a través de la diferenciación de iPSCs en células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)^7,11. Los PMP se generan como se describió anteriormente, con algunas optimizaciones presentadas aquí en¹². Los PMP imitan a los macrófagos derivados del saco vitelino independientes de MYB, que dan lugar a la microglía durante el desarrollo embrionario al invadir el cerebro antes del cierre de la barrera hematoencefálica¹³. Para diferenciar terminalmente las PMP en MGI, utilizamos un método de monocultivo rápido y simplificado basado en los protocolos de Haenseler et al. y Brownjohn et al., con algunas modificaciones para generar un método eficiente de diferenciación de microglia en el que los iMG expresan robustamente marcadores enriquecidos con microglía ^7,8. Este método de diferenciación se puede reproducir en laboratorios con experiencia en el cultivo de iPSCs y con objetivos de investigación destinados a estudiar la biología de la microglía utilizando un sistema modelo humano.

La microglía derivada de iPSC representa una fuente biológicamente relevante de microglía humana para la experimentación in vitro y es una herramienta importante para investigar las funciones canónicas microgliales, incluida la fagocitosis. La microglía son los fagocitos profesionales del cerebro y el SNC, donde limpian los desechos celulares, agregan proteínas y degradan la mielina¹⁴. La microglía también funciona en la remodelación sináptica por envolver sinapsis y en la defensa contra infecciones externas a través de fagocitosis de patógenos^15,16. En este protocolo, la fagocitosis por iMGs se evalúa utilizando sinaptosomas humanos como material para la absorción de iMG. Con este fin, se describe una descripción para aislar sinaptosomas derivados de LMNs humanos i³. Los sinaptosomas humanos derivados de i³LMN están marcados con un colorante sensible al pH que permite la cuantificación de sinaptosomas localizados dentro de compartimentos ácidos durante el procesamiento del fagosoma y la degradación in vitro. Se muestra un ensayo de fagocitosis utilizando microscopía de células vivas para monitorear el proceso dinámico de envolvimiento de microglia en tiempo real. Este ensayo funcional establece una base para investigar posibles defectos en la fagocitosis microglial en la salud y la enfermedad utilizando un sistema humano completo.

Protocolo

NOTA: Todos los reactivos utilizados en este protocolo deben ser estériles, y todos los pasos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles. Todas las líneas iPSC, así como los medios de mantenimiento y diferenciación, se describen en la Tabla de materiales. El método de diferenciación de microglía ilustrado a continuación se basa en protocolos previamente publicados ^7,8,12 con nuevas modificaciones descritas en este documento.

1. Diferenciación de la microglía

NOTA: En la figura 1 se resume una descripción general del protocolo.

1. Cultivo de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)
   NOTA: Se pueden encontrar más detalles que describen las técnicas de cultivo iPSC en otra parte¹⁷.
   1. Descongelación y mantenimiento
      1. Preparar iPSC mediana, alícuota la media, y almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Descongelar las alícuotas durante la noche a 4 °C y utilizarlas durante un máximo de 1 semana. Deje el medio a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de usarlo.
      2. Cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos agregando 1 ml de 10 μg/ml de laminina 521 diluida en DPBS que contiene calcio y magnesio¹⁸. Mantener las placas en una incubadora a 37 °C y 5% de_CO2 durante al menos 2 h o preferiblemente durante la noche. Una vez diluida, conservar la laminina a 4 °C durante 3 meses.
      3. Preparar 10 mM de solución madre inhibidora de la quinasa Rho Y27632 (inhibidor de ROCK) diluyendo en agua estéril. Hacer alícuotas de un solo uso de la solución inhibidora de ROCK y almacenarlas a -20 °C durante un máximo de 1 año.
      4. Preparar 0,5 mM EDTA diluyendo la solución madre de 0,5 M EDTA en DPBS.
      5. Para descongelar un vial de iPSCs congeladas, coloque el vial en un baño maría a 37 °C hasta que esté casi descongelado. Transfiera inmediatamente el contenido del vial a un tubo cónico de 15 ml que contenga 4 ml de medio iPSC. Centrifugar a 500 × g durante 1 min.
      6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células añadiendo 1 ml de medio iPSC que contenga 10 μM inhibidor de ROCK lentamente contra la pared del tubo para evitar la perturbación de las colonias.
      7. Añadir 1,5 ml de medio iPSC que contenga 10 μM inhibidor de ROCK a cada uno de los pocillos recubiertos y transferir las colonias resuspendidas gota a gota a los pocillos que contienen el medio.
         NOTA: Utilice 5-7 gotas del paso 1.1.1.6 para el mantenimiento del cultivo, pero ajuste la densidad de siembra óptima para cada línea iPSC.
      8. Distribuya uniformemente las celdas en los pocillos barajando manualmente la placa de lado a lado y de atrás hacia adelante. Colocar las células en una incubadora a 37 °C y 5% de_CO2. Al día siguiente, reemplace completamente el medio agregando un medio iPSC fresco sin inhibidor de ROCK.
      9. Para el mantenimiento, cambie el medio todos los días hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
         NOTA: Las células se pueden mantener sin cambiar el medio durante 2 días si el medio iPSC utilizado permite un horario de alimentación flexible. Se recomienda limitar esto a una vez por pasaje y solo si las células son menos del 50% confluentes.
   2. Desdoblamiento
      1. Aspirar el medio y lavar las células con 1 mL de DPBS (sin calcio y magnesio).
      2. Para desalojar las células, agregue 1 ml de 0.5 mM EDTA e incube durante 2-3 minutos a temperatura ambiente hasta que los bordes de las colonias celulares se levanten de la superficie del pozo. Lave las células de nuevo con DPBS y agregue 1 ml de medio iPSC.
      3. Disocie las colonias celulares raspándolas suavemente con un elevador celular. Raspa cada área del pozo solo una vez para evitar molestar a las colonias.
         NOTA: Los métodos alternativos para desalojar las colonias del pozo se pueden encontrar en otros lugares¹⁷.
      4. Con una punta de pipeta de 1 ml, recoger las células y transferirlas gota a gota en una proporción de 1:6 (células a medio) a pocillos prerecubiertos (como se mencionó en el paso 1.1.1.2) que contengan 1,5 ml de medio iPSC.
2. Diferenciación de iPSC a células similares a la microglía (iMG)
   NOTA: Las moléculas pequeñas y los factores de crecimiento se disuelven en albúmina sérica bovina al 0,1% filtrada estéril en DPBS a una concentración madre 1.000 veces mayor que la concentración final. Se recomienda diferenciar las iPSC en iMG durante los primeros pasajes. Se recomienda el cariotipo rutinario de las líneas iPSC.
   1. Preparar una solución de recubrimiento estándar
      1. Descongelar la solución madre de un reactivo de recubrimiento de matriz extracelular en hielo a 4 °C durante la noche.
      2. Preenfriar tubos de microcentrífuga y puntas de pipeta filtrante a 4 °C.
      3. Alícuota 250 μL del reactivo concentrado de recubrimiento de matriz extracelular en cada tubo y colocarlo inmediatamente en hielo. Conservar las alícuotas a -20 °C.
      4. Para preparar la solución de recubrimiento, descongelar una de las alícuotas del reactivo de recubrimiento de matriz extracelular en hielo a 4 °C durante la noche.
      5. Agregue 50 ml de DMEM-F12 helado optimizado para el crecimiento de células madre embrionarias humanas y pluripotentes inducidas (denominadas DMEM-F12) a un tubo cónico preenfriado y manténgalo en hielo.
      6. Enfríe una punta de pipeta de 1 ml pipeteando DMEM-F12 helada hacia arriba y hacia abajo varias veces, y luego use inmediatamente la punta de la pipeta para transferir 250 μL del reactivo de recubrimiento de matriz extracelular al tubo cónico que contiene el medio DMEM-F12.
         NOTA: La solución de recubrimiento estándar puede conservarse durante 2 semanas a 4 °C.
   2. Formación del cuerpo embrioide (EB)
      1. Prepare un medio EB que pueda mantenerse a 4 °C durante un máximo de 4 días.
      2. Una vez que las iPSCs hayan alcanzado el 80% de confluencia, disociar las colonias lavando con 1 mL de DPBS y añadiendo 1 mL de un reactivo de disociación durante 2 min a 37 °C. Desaloje las colonias usando un elevador celular raspando varias veces para crear una suspensión de una sola célula. Recoja las células y transfiera todo a un tubo cónico de 15 ml que contenga 9 ml de DPBS.
      3. Centrifugar las células a 500 × g durante 1 min, retirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de medio EB. Tomar 10 μL de células y diluir 1:1 con azul de tripano. Contar las células con un hemacitómetro y, basándose en el recuento de células, diluir el stock celular hasta una dilución final de 10.000 células por 100 μL. Para las células de recubrimiento, agregue 100 μL de las células diluidas por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo de baja adherencia.
         NOTA: En general, se pueden obtener 48 pozos de la placa de 96 pocillos de cada pozo confluente del 80% de las iPSC.
      4. Centrifugar la placa a 125 × g durante 3 min e incubar a 37 °C y 5% de_CO2 durante 4 días. Realice un cambio de medio medio el día 2 utilizando una pipeta multicanal y recogiendo suavemente 50 μL de medio viejo, y luego agregando 50 μL de medio EB fresco.
         NOTA: El día 4, las iPSC formarán estructuras celulares esféricas denominadas EB como se describe en la sección de resultados. El proceso de diferenciación de EB se puede extender hasta 7 días, si es necesario.
   3. Generación de precursores primitivos de macrófagos (PMPs)
      1. Prepare el medio base PMP, filtro estéril, y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
      2. Cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos agregando 1 ml de solución de recubrimiento Matrigel helada e incube a 37 °C y 5% de_CO2 durante al menos 2 h o preferiblemente durante la noche.
      3. En el día 4 de la diferenciación de EB, transfiera las EB a los pocillos recubiertos de Motrigel recolectando las EB con puntas de pipeta de 1 ml (usando una pipeta). Pipetear hacia arriba y hacia abajo una o dos veces para desalojar los EB del pozo. Sostenga la placa de 6 pocillos en un ángulo inclinado para permitir que los EB se asienten en el borde del pozo.
         NOTA: Se pueden chapar nueve o diez EB por pozo recubierto.
      4. Una vez que todos los EB se hayan asentado, pipetear suavemente y retirar el medio viejo con una punta de pipeta de 1 ml mientras mantiene los EB en el borde del pozo. Agregue 3 ml de medio completo PMP recién preparado a cada pocillo. Distribuya uniformemente las celdas en los pocillos barajando manualmente la placa de lado a lado y de atrás hacia adelante. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C y 5%_CO2.
      5. No perturbe la placa durante 7 días para permitir que los EB se adhieran al fondo del pozo. Después de ese tiempo, realice un cambio medio-medio utilizando el medio completo PMP.
         NOTA: En este punto, la mayoría de los EB deben estar unidos a la placa. Cualquier EB flotante se puede eliminar.
      6. Después de 5-7 días, inspeccione los EB bajo un microscopio de campo de luz con un aumento de 4x para asegurarse de que estén conectados al fondo de los pozos. Cambie el medio como se describe en 1.2.3.5. El día 21, realizar un cambio completo de medio con 3 mL de medio completo PMP.
         NOTA: Los progenitores mieloides que flotan en el medio pueden ser evidentes en este punto. Estas células deben descartarse durante el cambio del medio.
      7. El día 28, busque células redondas denominadas PMP en el sobrenadante y recoja el medio que contiene las PMP utilizando una pipeta de 10 ml y una pipeta automática. Tenga cuidado de no molestar a los EB. Transfiera las PMP y el medio a un tubo cónico de 15 ml y proceda como se describe en el paso 1.2.4.
         NOTA: Por lo general, los PMP de la misma línea iPSC se pueden recolectar de cinco pocillos de una placa de 6 pocillos y agruparse en un solo tubo cónico de 15 ml.
      8. Agregue 3 ml de medio completo PMP fresco para un mayor mantenimiento de los EB. Como los PMP emergen continuamente de los EB durante más de 3 meses, recójalos cada 4-7 días (no permita que el medio cambie de color a un tono amarillo) como se describe en los pasos 1.2.3.7 y 1.2.3.8.
         NOTA: Aunque las PMP se pueden recolectar durante varios meses, pueden cambiar su fenotipo con el tiempo.
   4. Diferenciación a los iMG
      1. Prepare el medio base iMG (Tabla de materiales), el filtro estéril y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
      2. Una vez que las PMP se hayan recogido en un tubo cónico de 15 ml, centrifugarlas a 200 × g durante 4 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las PMP utilizando 1-2 mL de medio basal iMG. Contar las células con un hemocitómetro tomando una pequeña alícuota y diluyendo 1:1 con azul de tripano.
         NOTA: 0.5-1.5 × 10⁶ PMP se obtienen normalmente cada semana dependiendo de la línea iPSC y la edad del cultivo EB.
      3. Centrifugar el resto de las células de nuevo a 200 × g durante 4 min. Diluir las PMP a la concentración deseada de tal manera que las células se coloquen en una densidad de ~ 10^{5 /} cm² en placas tratadas con cultivo celular utilizando un medio completo iMG recién preparado. Realice un cambio medio-medio utilizando un medio completo iMG recién preparado cada 3-4 días a lo largo de 10-12 días para permitir la diferenciación terminal.
         NOTA: En este punto, las células deben adquirir una morfología similar a la microglía. Para confirmar el compromiso de las PMP con el destino de la microglía, se realiza un análisis de inmunofluorescencia para corroborar la expresión de marcadores enriquecidos con microglía, como el receptor purinérgico P2RY12 y la proteína transmembrana 119 (TMEM119)⁹.
      4. Para preservar la salud y viabilidad celular, realice todos los experimentos entre los días 10 a 12 de diferenciación iMG.

2. Ensayo de fagocitosis utilizando sinaptosomas humanos derivados de neuronas motoras

1. Diferenciación mediada por el factor de transcripción de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC (i³LMN)
   NOTA: Para el proceso de diferenciación se utilizó una línea WTC11 con inserción estable del casete del factor de transcripción inducible hNIL que contiene los factores de transcripción neurogenina-2 (NGN2), islote-1 (ISL1) y LIM homeobox 3 (LHX3) en el locus de puerto seguro CLYBL¹⁷. La línea iPSC se mantuvo como se describe en el paso 1.1.1, pero con las condiciones de recubrimiento descritas en el paso 1.2.1. Cualquier reactivo de recubrimiento de matriz extracelular se puede utilizar para cultivar iPSCs que se utilizarán para la diferenciación neuronal ya que no se requiere laminina 521. Todos los medios se equilibran a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de su uso.
   1. Cubra los platos de 10 cm con 5 ml de solución de recubrimiento patrón como se describe en el paso 1.2.1.
      NOTA: Aquí, se utilizaron 3-4 platos de 10 cm por diferenciación.
   2. Preparar Induction Base media, filtro estéril, y almacenar a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
   3. Prepare Neuron medium, filtro estéril, y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
   4. Prepare el tampón de borato mezclando 100 mM de ácido bórico, tetraborato de sodio de 25 mM y cloruro de sodio de 75 mM en agua estéril. Ajuste el pH a 8.5 y filtre estéril.
   5. Una vez que las iPSC hayan alcanzado el 80% de confluencia, lave las células con DPBS y desaloje las colonias agregando 0.5 mM EDTA.
      NOTA: Dos pocillos suelen ser suficientes para cada plato de 10 cm.
   6. Incubar las células durante 4-5 min a temperatura ambiente. Retire el EDTA y agregue 3 ml de DMEM/F12 con HEPES a cada pocillo.
   7. Raspa las células con un elevador de células y usa una pipeta de 10 ml para extraer las células del fondo del pozo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3x.
   8. Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 300 × g durante 3 min.
   9. Resuspender las células en 3 ml de medio iPSC que contiene 10 μM inhibidor de ROCK y contarlas con un hemacitómetro.
   10. Placa 1,5 × 10⁶ iPSCs en una placa prerecubierta de 10 cm con 12 mL de medio iPSC que contiene 10 μM inhibidor de ROCK.
   11. Al día siguiente, retire el medio y lave las células con DPBS. Añadir 12 ml de medio de inducción completa recién preparado para inducir la expresión de los factores de transcripción.
   12. El día 2, cubra los platos de 10 cm con 5 ml de solución de recubrimiento neuronal preparada con volúmenes iguales de 0,1 mg / ml de poli-D-lisina y 1 mg / ml de poli-L-ornitina diluida en tampón de borato. Incubar durante la noche a 37 °C y 5% de_CO2.
   13. El día 3, lavar los platos recubiertos con agua estéril 3x, aspirar el agua completamente y dejar que los platos se sequen inclinando los platos y dejándolos parcialmente descubiertos dentro de un gabinete de bioseguridad durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
   14. Una vez que los platos se hayan secado completamente, cúbralos con 6 mL de medio de inducción completa suplementado con 15 μg/mL de laminina y 40 μM de BrdU durante al menos 1 h a 37 °C y 5% de_CO2.
       NOTA: El tratamiento con BrdU se recomienda para eliminar las células mitoticamente activas y así mejorar la pureza de los cultivos neuronales. Los efectos de BrdU en la salud neuronal son mínimos.
   15. Tratar las células diferenciadoras con 3 mL de reactivo de disociación por plato de 10 cm e incubar durante 3-4 min a temperatura ambiente.
   16. Añadir 6 ml de DPBS en la placa sin quitar el reactivo de disociación y pipetear las células en solución hacia arriba y hacia abajo 4-5x con una pipeta de 10 ml para disociar las células.
   17. Recoja la suspensión celular y pásela a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo cónico de 50 ml. Agregue 1 ml de medio base de inducción para enjuagar el colador.
   18. Centrifugar las células a 300 × g durante 5 min. Aspirar el medio y resuspender las células en 3 mL de medio de inducción completa que contenga 40 μM de BrdU.
   19. Cuente las células con un hemocitómetro. Colocar aproximadamente 2,5 × 10 6 células por plato de 10 cm en platos prerecubiertos diluyendo las células en⁶ ml de medio de inducción completa que contenga 40 μM de BrdU sin eliminar la solución de recubrimiento añadida en el paso 2.1.14.
   20. El día 4, aspirar el medio, lavar las células 1x con DPBS y añadir un nuevo medio de inducción completa que contenga 40 μM de BrdU.
   21. El día 6, aspirar el medio, lavar las células 1x con DPBS y añadir medio neuronal suplementado con 1 μg/ml de laminina.
   22. En el día 9, cambie 1/^{3 del medio} reemplazándolo con medio Neuron fresco suplementado con 1 μg / ml de laminina.
   23. Mantener i 3 LMNs durante 25 días adicionales realizando cambios de medio medio con medio neuronal suplementado con 1 μg/ml fresco de laminina cada^3-4días.
       NOTA: En este punto temporal, i³LMNs deben presentar una morfología neuronal con procesos largos. Las neuronas también tienden a formar grupos o grupos de células. Una descripción más detallada de cómo validar la diferenciación de i³LMN se puede encontrar en otra parte¹⁷.
2. Purificación y etiquetado de sinaptosomalos
   NOTA: Mantenga las condiciones estériles y realice todos los pasos dentro de un gabinete de bioseguridad.
   1. Lave^{i 3} LMN dos veces con DPBS.
   2. Agregue 2 ml de reactivo de lisis celular helada para el aislamiento de sinaptosomas, incubar en hielo durante 2 minutos y raspar firmemente las neuronas.
   3. Transfiera el lisado a múltiples microtubos de 2 ml (~ 1,5 ml de lisado por tubo) y centrifugar a 1.200 × g durante 10 minutos a 4 °C.
      NOTA: Mantenga los tubos en hielo durante todo este procedimiento.
   4. Recoger el sobrenadante (desechar el pellet) y centrifugar a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. Guarde y resuspenda el pellet que contiene los sinaptosomas con un volumen similar (como el lisado original) de 5% de DMSO en DPBS.
      NOTA: Los sinaptosomas pueden etiquetarse inmediatamente con un fluoróforo o almacenarse a -80 °C para su uso futuro.
   5. Realice un ensayo de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) para todos los tubos para evaluar el rendimiento total de proteína en la preparación del sinaptosoma.
      NOTA: Se pueden utilizar otros ensayos para medir la concentración de proteínas. El rendimiento proteico total obtenido de diferentes preparados se ha incluido en la Tabla 1 como referencia. Se recomienda realizar un análisis de Western blot de la preparación sinaptosómica para confirmar la presencia de proteínas presinápticas y postsinápticas. Aquí, el marcador presináptico, sinaptofisina (SYP), y el marcador postsináptico, la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD95) fueron elegidos para el análisis de western blotting como se describió anteriormente¹⁹.
   6. Prepare una solución de 100 mM de bicarbonato de sodio en agua, ajuste el pH a 8.5 y filtro estéril.
   7. Solubilizar 1 mg de polvo liofilizado del colorante sensible al pH utilizado en 150 μL de DMSO. Hacer alícuotas de un solo uso y almacenarlas a -80 °C.
   8. Centrifugar los sinaptosomas a 15.000 × g durante 5 min a 4 °C.
   9. Diluir hasta 1 mg de sinaptosomas en 100 μL de solución de bicarbonato de sodio a 100 mM.
   10. Para etiquetar los sinaptosomas, agregue 1 μL del colorante sensible al pH reconstituido por 1 mg de sinaptosomas y cubra la reacción con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Agitar a temperatura ambiente durante 2 h con un agitador de tubos.
   11. Añadir 1 ml de DPBS al tubo y centrifugar los sinaptosomas marcados a 15.000 × g durante 5 min a 4 °C.
   12. Retire el sobrenadante y realice cuatro lavados adicionales como se describe en el paso 2.2.11.
   13. Después del lavado y centrifugado final, retire el sobrenadante tanto como sea posible sin alterar el pellet y vuelva a suspender los sinaptosomas marcados con DMSO al 5% en DPBS a un volumen para la concentración deseada (0.7 μg / μL utilizado aquí). Preparar las alícuotas de un solo uso y almacenar a -80 °C. Asegúrese de evitar la exposición a la luz a los sinaptosomas etiquetados.
3. Ensayo de fagocitosis de células vivas
   1. Placa 20-30 × 10 4 PMP en placas de 96 pocillos en 100 μL de medio completo iMG y seguir el proceso de diferenciación durante 10 días como se indica en el paso 1.2.4.
   2. El día del ensayo, prepare la solución de tinción nuclear agregando 1 gota de una tinción nuclear para células vivas en 2 ml de medio basal iMG.
   3. Extraer 40 μL de medio por pocillo de la placa de 96 pocillos y añadir 10 μL de la solución de tinción nuclear utilizando una pipeta multicanal. Incubar la placa a 37 °C y 5% de_CO2 durante 2 h.
   4. Descongele los sinaptosomas etiquetados en hielo y sonicar suavemente usando un sonicador de agua durante 1 minuto. Transfiera inmediatamente los sinaptosomas de nuevo al hielo. Diluir los sinaptosomas marcados en medio completo iMG en una proporción de 1 μL de sinaptosomas por 50 μL de medio.
      NOTA: La concentración de sinaptosoma depende del ensayo y puede requerir optimización. Para mantener un porcentaje relativamente bajo (es decir, 0,1% o menos) de DMSO en el medio, se recomienda no agregar más de 2 μL de sinaptosomas por pocillo.
   5. Como control negativo, pretratar algunos de los pocillos con citocalasina D para inhibir la polimerización de actina y, por lo tanto, la fagocitosis. Preparar una solución de citocalasina D de 60 μM en medio completo iMG. Añadir 10 μL de esta solución a cada pocillo para obtener una concentración final de 10 μM e incubar a 37 °C y 5% de_CO2 durante 30 min.
   6. Retirar la placa de la incubadora e incubar a 10 °C durante 10 min. Mantener la placa en hielo y añadir 50 μL de medio que contenga sinaptosomas preparados como se describe en el paso 2.3.4.
   7. Centrifugar la placa a 270 × g durante 3 min a 10 °C y mantener la placa en hielo hasta la obtención de imágenes.
4. Adquisición y análisis de imágenes
   1. Inserte la placa en un lector de imágenes de células vivas y seleccione los pocillos que se analizarán.
   2. Seleccione una lente objetivo 20x .
   3. Ajuste el enfoque, la intensidad del diodo emisor de luz (LED), el tiempo de integración y la ganancia de los canales de campo claro y azul (4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]). La fluorescencia del sinaptosoma debe ser insignificante en el punto de tiempo inicial. Para centrarse en el canal rojo (RFP), utilice el canal de campo claro como referencia. El tiempo de integración y la ganancia pueden variar entre experimentos; utilice estos ajustes iniciales para el canal rojo: LED: 4, tiempo de integración: 250 y ganancia: 5.
   4. Seleccione el número de baldosas individuales que se adquirirán en un montaje por pozo (adquiera 16 baldosas en el centro del pozo, obteniendo así una imagen de aproximadamente el 5% del área total del pozo). Ajuste la temperatura a 37 °C y el intervalo de tiempo deseado para la obtención de imágenes.
      NOTA: Las imágenes fueron adquiridas cada 1 - 2 h hasta 16 h en este estudio.
   5. Abra el software de análisis.
      1. Abra el experimento que contiene las imágenes. Haga clic en el icono Reducción de datos.
      2. En el menú, seleccione Costura de imágenes en Procesamiento de imágenes para crear una imagen completa a partir de los mosaicos individuales de 4 x 4 del montaje con los parámetros descritos en la Tabla 2.
      3. Una vez creadas las imágenes cosidas, defina un umbral de intensidad utilizando los canales DAPI y RFP para estas imágenes. Abra una imagen y haga clic en Analizar; en Análisis, seleccione Análisis celular y, en Canal de detección, elija una imagen cosida en los canales DAPI o RFP. Vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y establezca un valor de umbral y valores de tamaño de objeto que seleccionen correctamente los núcleos celulares en el canal DAPI o la señal sinaptosómica en el canal RFP. Repita el proceso con diferentes imágenes hasta que se optimicen los parámetros que se pueden aplicar a todo el experimento.
         NOTA: Los valores sugeridos se pueden encontrar en la Tabla 2.
      4. Para contar el número de núcleos, vaya al menú Reducción de datos y, en Análisis de imágenes, seleccione Análisis celular. Vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y, en Canal, seleccione las imágenes cosidas DAPI y use los parámetros descritos en la Tabla 2.
      5. Vaya a la pestaña Métricas calculadas y seleccione Recuento de celdas. Para obtener el área de la señal del sinaptosoma, vaya al menú Reducción de datos y, en Análisis, seleccione Análisis celular.
      6. Vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y, en Canal, seleccione Imágenes unidas RFP y use los parámetros detallados en la Tabla 2.
      7. Vaya a la pestaña Métricas calculadas y seleccione Área de suma de objetos. En la pestaña Reducción de datos , haga clic en Aceptar y permita que el software analice todas las imágenes adquiridas.
      8. Exporte los valores Área de suma de objetos y Recuento de celdas para cada punto de tiempo. Divida el área de suma de objetos por el recuento de celdas para calcular el área normalizada por punto de tiempo. Si compara múltiples tratamientos o genotipos, calcule el índice de fagocitosis utilizando la ecuación (1):
         (1)
      9. Guarde los resultados e integre los datos.

Resultados

Para generar iMGs utilizando este protocolo, es importante comenzar con iPSCs indiferenciadas que muestren morfología de colonia compacta con bordes bien definidos (Figura 2A). Las iPSC disociadas mantenidas como se describe en la sección de formación de EB formarán agregados esféricos, denominados EB, que crecerán en tamaño hasta el día 4 de diferenciación (Figura 2B). Una vez que los EB se recogen y chapan en las condiciones apropiadas para la generac...

Discusión

El protocolo de diferenciación descrito aquí proporciona un método eficiente para obtener células similares a la microglía derivadas de iPSC en ~ 6-8 semanas con alta pureza y en un rendimiento suficiente para realizar experimentos de inmunofluorescencia y otros ensayos que requieren un mayor número de células. Este protocolo ha producido hasta 1 × 10⁶ iMGs en 1 semana, lo que permite la extracción de proteínas y ARN y los correspondientes análisis posteriores (por ejemplo, RNASeq, qRT-PCR, western ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody	Wako Chemical USA	NC9288364	1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody	Abcam	ab6046	1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody	Abclonal	A6344	1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody	Millipore	MAB1596	1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM)	Sigma	B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (75 mM)	Sigma	S7653
Sodium tetraborate (25 mM)	Sigma	221732
Cell culture materials
6-well plates	Greiner Bio-One	657160
40 μm Cell Strainers	Falcon	352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated	CELLTREAT	229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile	CELLTREAT	229305
low adherence round-bottom 96-well plate	Corning	7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate	Corning	353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate	Corning	353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
Cell dissociation reagents
Accutase	Corning	25058CI	dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent	Life Technologies	12-605-010	dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning™	354230	Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine	Sigma	P7405	Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655	Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
mTeSR Plus Kit	STEMCELL Technology	100-0276	To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	final concentration 50 ng/mL
iPSC media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	final concentration 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	final concentration 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 100 ng/mL
PMP base media			final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-34	PeproTech or Biologend	200-34 or 577904	final concentration 100 ng/mL
iMG base media			final concentration 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES	Gibco	11330032	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E	Calbiochem	565790	final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline	Sigma	D9891	final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401	final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03	The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL	National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific Pierce	23227
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	87793	Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester	ThermoFisher Scientific	P36600	Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution	AMRESCO INC	K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D	Sigma		final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium	Corning	21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV	Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12	Gibco	12660012	Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017015	Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake	Benchmark		refer as tube shaker
Water sonicator	Elma	Mode Transsonic 310