Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Differenzierungsprozess von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in Mikroglia-ähnliche Zellen für In-vitro-Experimente. Wir enthalten auch ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung menschlicher Synaptosomen aus iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen, die als Substrat für In-vitro-Phagozytose-Assays mit Lebendzellbildgebungssystemen verwendet werden können.

Zusammenfassung

Mikroglia sind die ansässigen Immunzellen myeloischen Ursprungs, die die Homöostase in der Mikroumgebung des Gehirns aufrechterhalten und zu einem Schlüsselakteur bei mehreren neurologischen Erkrankungen geworden sind. Die Untersuchung menschlicher Mikroglia in Gesundheit und Krankheit stellt aufgrund der extrem begrenzten Versorgung mit menschlichen Zellen eine Herausforderung dar. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die von menschlichen Individuen stammen, können verwendet werden, um diese Barriere zu umgehen. Hier wird gezeigt, wie menschliche iPS-Zellen in Mikroglia-ähnliche Zellen (iMGs) für In-vitro-Experimente differenziert werden können. Diese iMGs zeigen die erwarteten und physiologischen Eigenschaften von Mikroglia, einschließlich Mikroglia-ähnlicher Morphologie, Expression geeigneter Marker und aktiver Phagozytose. Zusätzlich wird eine Dokumentation zur Isolierung und Markierung von Synaptosomensubstraten bereitgestellt, die von humanen iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen (i³LMNs) stammen. Ein Lebendzell-Longitudinal-Imaging-Assay wird verwendet, um das Verschlingen menschlicher Synaptosomen zu überwachen, die mit einem pH-empfindlichen Farbstoff markiert sind, was Untersuchungen der phagozytischen Kapazität von iMG ermöglicht. Die hierin beschriebenen Protokolle sind allgemein auf verschiedene Bereiche anwendbar, die die Biologie der menschlichen Mikroglia und den Beitrag von Mikroglia zur Krankheit untersuchen.

Einleitung

Mikroglia sind die residenten Immunzellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Mikroglia sind auch im erwachsenen Gehirn wichtig, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und aktiv auf Traumata und Krankheitsprozesse zu reagieren. Kumulative Evidenz zeigt, dass Mikroglia einen Schlüsselbeitrag zur Pathogenese multipler neuroentwicklungsbedingter und neurodegenerativer Erkrankungen leisten ^1,2. Obwohl das aktuelle Wissen über die Mikrogliabiologie überwiegend aus Mausmodellen abgeleitet wurde, haben neuere Studien wichtige Unterschiede zwischen murinen und menschlichen Mikroglia aufgeklärt, was die Notwendigkeit der Entwicklung von Technologien zur Untersuchung der Genetik und der biologischen Funktionen menschlicher Mikroglia unterstreicht ^3,4. Die Isolierung von Mikroglia aus seziertem Primärgewebe kann die Eigenschaften der Mikroglia stark verändern⁵, was möglicherweise die mit solchen Zellen erzielten Ergebnisse verwirrt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, humane iPS-Zellen in iMGs zu differenzieren und dadurch ein Zellkultursystem zur Untersuchung menschlicher Mikroglia unter basalen Bedingungen bereitzustellen. Darüber hinaus ist hierin ein Phagozytose-Assay unter Verwendung eines vollständig menschlichen Modellsystems enthalten, um die Funktionalität von iMGs sowohl als Qualitätskontrollmaßnahme als auch zur Beurteilung der iMG-Dysfunktion im Kontext der Krankheit zu untersuchen.

Mehrere Protokolle zur Mikroglia-Differenzierung von iPS-Zellen sind kürzlich in der Literatur 6,7,8,9,10 aufgetaucht. Mögliche Nachteile einiger Protokolle sind verlängerte oder lange Differenzierungsperioden, die Zugabe mehrerer Wachstumsfaktoren und/oder komplexe experimentelle Verfahren ^6,9,10. Hier wird eine "benutzerfreundliche" Differenzierungsmethode demonstriert, die Aspekte der Mikroglia-Ontogenese durch Differenzierung von iPS-Zellen in Vorläuferzellen, die als primitive Makrophagen-Vorläufer (PMPs) bezeichnet werden, rekapituliert7,11. PMPs werden wie zuvor beschrieben generiert, wobei einige Optimierungen hierin¹² vorgestellt werden. Die PMPs ahmen MYB-unabhängige Dottersack-abgeleitete Makrophagen nach, die während der Embryonalentwicklung Mikroglia erzeugen, indem sie vor dem Schließen der Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn eindringen¹³. Um PMPs in iMGs zu differenzieren, verwendeten wir eine schnelle und vereinfachte Monokulturmethode, die auf Protokollen von Haenseler et al. und Brownjohn et al. basiert, mit einigen Modifikationen, um eine effiziente Mikroglia-Differenzierungsmethode zu erzeugen, in der iMGs Mikroglia-angereicherte Marker robust exprimieren ^7,8. Diese Differenzierungsmethode kann in Laboratorien mit Expertise in der Kultur von iPSCs und mit Forschungszielen reproduziert werden, die darauf abzielen, die Mikrogliabiologie anhand eines humanen Modellsystems zu untersuchen.

iPSC-abgeleitete Mikroglia stellen eine biologisch relevante Quelle menschlicher Mikroglia für In-vitro-Experimente dar und sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung mikroglialer kanonischer Funktionen, einschließlich Phagozytose. Mikroglia sind die professionellen Phagozyten des Gehirns und des ZNS, wo sie Zelltrümmer, aggregierte Proteine und abgebautes Myelin¹⁴ entfernen. Mikroglia funktionieren auch beim synaptischen Umbau durch Verschlingen von Synapsen und bei der Abwehr äußerer Infektionen durch Phagozytose von Krankheitserregern^15,16. In diesem Protokoll wird die Phagozytose durch iMGs unter Verwendung menschlicher Synaptosomen als Material für das iMG-Engulfment bewertet. Zu diesem Zweck wird eine Beschreibung zur Isolierung von Synaptosomen beschrieben, die von humanenⁱ³LMNs abgeleitet sind. Die i3-LMN-abgeleiteten menschlichen Synaptosomen sind mit einem pH-sensitiven Farbstoff markiert, der die Quantifizierung von Synaptosomen ermöglicht, die während der Phagosomenverarbeitung und des Abbaus in vitro in sauren Kompartimenten lokalisiert sind. Ein Phagozytose-Assay mit Lebendzellmikroskopie wird gezeigt, um den dynamischen Prozess der Mikroglia-Verschlängung in Echtzeit zu überwachen. Dieser funktionelle Assay schafft eine Grundlage, um mögliche Defekte der Mikroglia-Phagozytose in Gesundheit und Krankheit mit einem vollständigen menschlichen System zu untersuchen.

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien müssen steril sein, und alle Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alle iPSC-Linien sowie Wartungs- und Differenzierungsmedien sind im Materialverzeichnis beschrieben. Die unten dargestellte Mikroglia-Differenzierungsmethode basiert auf den zuvor veröffentlichten Protokollen ^7,8,12 mit den hierin beschriebenen neuen Modifikationen.

1. Mikroglia-Differenzierung

HINWEIS: Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst.

1. Induzierte pluripotente Stammzellkultur (iPSC)
   HINWEIS: Weitere Details, die iPSC-Kulturtechniken beschreiben, finden Sie an anderer Stelle¹⁷.
   1. Auftauen und Wartung
      1. iPSC-Medium vorbereiten, aliquot speichern und bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern. Die Aliquots über Nacht bei 4 °C auftauen und bis zu 1 Woche verwenden. Lassen Sie das Medium vor Gebrauch mindestens 1 Stunde bei Umgebungstemperatur.
      2. Beschichten Sie die Vertiefungen einer 6-Well-Platte durch Zugabe von 1 ml 10 μg/ml Laminin 521, verdünnt in DPBS, das Calcium und Magnesium¹⁸ enthält. Bewahren Sie die Platten mindestens 2 h oder vorzugsweise über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2 auf. Nach der Verdünnung das Laminin 3 Monate bei 4 °C lagern.
      3. 10 mM Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 (ROCK Inhibitor) Stammlösung durch Verdünnen in sterilem Wasser herstellen. Machen Sie Einweg-Aliquots von ROCK-Inhibitorlösung und lagern Sie sie bei -20 °C für bis zu 1 Jahr.
      4. 0,5 mM EDTA durch Verdünnen der Stammlösung von 0,5 M EDTA in DPBS herstellen.
      5. Um eine Durchstechflasche mit gefrorenen iPSCs aufzutauen, stellen Sie die Durchstechflasche in ein Wasserbad bei 37 °C, bis sie größtenteils aufgetaut ist. Übertragen Sie den Inhalt der Durchstechflasche sofort in ein 15-ml-konisches Röhrchen mit 4 ml iPSC-Medium. Bei 500 × g 1 min zentrifugieren.
      6. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 1 ml iPSC-Medium , das 10 μM ROCK-Inhibitor enthält, langsam gegen die Wand des Röhrchens geben, um eine Störung der Kolonien zu vermeiden.
      7. Fügen Sie 1,5 ml iPSC-Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor zu jedem der beschichteten Vertiefungen hinzu und übertragen Sie die resuspendierten Kolonien Tropfen für Tropfen in die Vertiefungen, die das Medium enthalten.
         HINWEIS: Verwenden Sie 5-7 Tropfen aus Schritt 1.1.1.6 für die Kulturpflege, passen Sie jedoch die optimale Aussaatdichte für jede iPSC-Linie an.
      8. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen, indem Sie die Platte manuell von Seite zu Seite und von hinten nach vorne mischen. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium vollständig, indem Sie ein frisches iPSC-Medium ohne ROCK-Inhibitor hinzufügen.
      9. Zur Wartung wechseln Sie das Medium jeden Tag, bis die Zellen 80% Konfluenz erreichen.
         HINWEIS: Die Zellen können ohne Mediumwechsel für 2 Tage gepflegt werden, wenn das verwendete iPSC-Medium einen flexiblen Fütterungsplan zulässt. Es wird empfohlen, dies auf eine Zeit pro Passage zu beschränken und nur, wenn die Zellen weniger als 50% konfluent sind.
   2. Spaltung
      1. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen mit 1 ml DPBS (ohne Kalzium und Magnesium).
      2. Um die Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA hinzu und inkubieren Sie für 2-3 min bei Raumtemperatur, bis sich die Ränder der Zellkolonien von der Oberfläche des Brunnens heben. Waschen Sie die Zellen erneut mit DPBS und fügen Sie 1 ml iPSC-Medium hinzu.
      3. Dissoziieren Sie die Zellkolonien, indem Sie sie vorsichtig mit einem Zellheber abkratzen. Kratzen Sie jeden Bereich des Brunnens nur einmal, um die Kolonien nicht zu stören.
         ANMERKUNG: Alternative Methoden, um die Kolonien aus dem Brunnen zu entfernen, finden Sie an anderer Stelle¹⁷.
      4. Sammeln Sie die Zellen mit einer 1-ml-Pipettenspitze und überführen Sie sie Tropfen für Tropfen im Verhältnis 1:6 (Zellen zu Medium) in vorbeschichtete Vertiefungen (wie in Schritt 1.1.1.2 erwähnt), die 1,5 ml iPSC-Medium enthalten.
2. iPSC-Differenzierung zu Mikroglia-ähnlichen Zellen (iMGs)
   HINWEIS: Die kleinen Moleküle und Wachstumsfaktoren werden in steril filtriertem 0,1% Rinderserumalbumin in DPBS bis zu einer Stammkonzentration gelöst, die 1.000x höher ist als die Endkonzentration. Es wird empfohlen, iPSCs in frühen Passagen in iMGs zu differenzieren. Eine routinemäßige Karyotypisierung von iPSC-Linien wird empfohlen.
   1. Standardbeschichtungslösung vorbereiten
      1. Die Stammlösung eines extrazellulären Matrixbeschichtungsreagenzes auf Eis bei 4 °C über Nacht auftauen.
      2. Mikrozentrifugenröhrchen und Filterpipettenspitzen bei 4 °C vorkühlen.
      3. Aliquot 250 μL des konzentrierten extrazellulären Matrixbeschichtungsreagenz in jedes Röhrchen geben und sofort auf Eis legen. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C.
      4. Zur Herstellung der Beschichtungslösung tauen Sie eines der extrazellulären Matrixbeschichtungsreagenz-Aliquots über Nacht auf Eis bei 4 °C auf.
      5. 50 ml eiskaltes DMEM-F12, optimiert für das Wachstum von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen (DMEM-F12) Medien, in ein vorgekühltes konisches Röhrchen geben und auf Eis halten.
      6. Kühlen Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, indem Sie eiskaltes DMEM-F12 mehrmals auf und ab pipettieren, und verwenden Sie dann sofort die Pipettenspitze, um 250 μL des extrazellulären Matrixbeschichtungsreagenzes in das konische Röhrchen mit dem DMEM-F12-Medium zu überführen.
         HINWEIS: Die Standard-Beschichtungslösung kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
   2. Bildung des embryoiden Körpers (EB)
      1. Bereiten Sie EB-Medium vor, das bis zu 4 Tage bei 4 °C gehalten werden kann.
      2. Sobald die iPSCs 80% Konfluenz erreicht haben, dissoziieren Sie die Kolonien, indem Sie mit 1 ml DPBS waschen und 1 ml eines Dissoziationsreagenzes für 2 min bei 37 °C hinzufügen. Entfernen Sie die Kolonien mit einem Zelllifter, indem Sie mehrmals kratzen, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Sammeln Sie die Zellen und übertragen Sie alles in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 9 ml DPBS.
      3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 1 Minute, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml EB-Medium. Nehmen Sie 10 μL Zellen und verdünnen Sie 1:1 mit Trypanblau. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer und verdünnen Sie basierend auf der Zellzahl den Zellbestand auf eine endgültige Verdünnung von 10.000 Zellen pro 100 μL. Für Beschichtungszellen fügen Sie 100 μL der verdünnten Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden mit geringer Haftung hinzu.
         HINWEIS: Im Allgemeinen können 48 Vertiefungen der 96-Well-Platte aus jeder 80% konfluierenden Vertiefung von iPSCs erhalten werden.
      4. Die Platte bei 125 × g für 3 min zentrifugieren und 4 Tage bei 37 °C und 5% CO₂ inkubieren. Führen Sie an Tag 2 einen Halbmediumwechsel durch, indem Sie eine Mehrkanalpipette verwenden und vorsichtig 50 μL altes Medium sammeln und dann 50 μL frisches EB-Medium wieder hinzufügen.
         HINWEIS: An Tag 4 bilden iPSCs sphärische Zellstrukturen, die als EBs bezeichnet werden, wie im Ergebnisabschnitt beschrieben. Der EB-Differenzierungsprozess kann bei Bedarf auf bis zu 7 Tage verlängert werden.
   3. Erzeugung primitiver Makrophagenvorläufer (PMPs)
      1. PMP-Basismedium und Sterilfilter vorbereiten und bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.
      2. Beschichten Sie die Vertiefungen einer 6-Well-Platte durch Zugabe von 1 mL eiskalter Matrigel-Beschichtungslösung und inkubieren Sie bei 37 °C und 5%_CO2 für mindestens 2 h oder vorzugsweise über Nacht.
      3. Am Tag 4 der EB-Differenzierung werden die EBs in die matrigelbeschichteten Vertiefungen überführt, indem Sie die EBs mit 1 ml Pipettenspitzen (mit einer Pipette) sammeln. Pipettieren Sie ein- oder zweimal auf und ab, um die EBs aus dem Bohrloch zu entfernen. Halten Sie die 6-Well-Platte in einem geneigten Winkel, damit sich die EBs am Rand des Bohrlochs absetzen können.
         HINWEIS: Pro beschichteter Vertiefung können neun oder zehn EBs plattiert werden.
      4. Sobald sich alle EBs beruhigt haben, pipetten und entfernen Sie das alte Medium vorsichtig mit einer 1-ml-Pipettenspitze, während Sie die EBs am Rand des Brunnens halten. Fügen Sie 3 ml frisch zubereitetes PMP Complete Medium in jede Vertiefung hinzu. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen, indem Sie die Platte manuell von Seite zu Seite und von hinten nach vorne mischen. Stellen Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO₂ in den Inkubator.
      5. Stören Sie die Platte 7 Tage lang nicht, damit die EBs am Boden des Brunnens befestigt werden können. Führen Sie nach dieser Zeit einen Halbmediumwechsel mit PMP complete medium durch.
         HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollten die meisten EBs an der Platte befestigt werden. Alle schwebenden EBs können entfernt werden.
      6. Nach 5-7 Tagen untersuchen Sie die EBs unter einem Lichtfeldmikroskop bei 4-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie am Boden der Vertiefungen befestigt sind. Wechseln Sie das Medium wie in 1.2.3.5 beschrieben. Führen Sie am Tag 21 einen vollständigen Mediumwechsel mit 3 ml PMP-Komplettmedium durch.
         HINWEIS: Myeloische Vorläufer, die im Medium schweben, können an dieser Stelle offensichtlich sein. Diese Zellen sollten während des Medienwechsels verworfen werden.
      7. Suchen Sie am 28. Tag nach runden Zellen, die als PMPs im Überstand bezeichnet werden, und sammeln Sie das Medium, das die PMPs enthält, mit einer 10-ml-Pipette und einem automatischen Pipettor. Achten Sie darauf, die EBs nicht zu stören. Die PMPs und das Medium werden in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und wie in Schritt 1.2.4 beschrieben fortgefahren.
         HINWEIS: Normalerweise können PMPs aus derselben iPSC-Linie aus fünf Vertiefungen einer 6-Well-Platte gesammelt und in einem einzigen konischen 15-ml-Rohr zusammengefasst werden.
      8. Fügen Sie 3 ml frisches PMP-Komplettmedium zur weiteren Wartung der EBs hinzu. Da PMPs länger als 3 Monate kontinuierlich aus EBs hervorgehen, sammeln Sie sie alle 4-7 Tage (lassen Sie das Medium nicht in einen gelben Ton wechseln), wie in den Schritten 1.2.3.7 und 1.2.3.8 beschrieben.
         HINWEIS: Obwohl PMPs für mehrere Monate gesammelt werden können, können sie ihren Phänotyp im Laufe der Zeit ändern.
   4. Abgrenzung zu iMGs
      1. iMG-Basismedium (Table of Materials) vorbereiten, sterilfiltern und bis zu 3 Wochen bei 4 °C lagern.
      2. Sobald die PMPs in einem 15 ml konischen Röhrchen gesammelt wurden, zentrifugieren Sie sie bei 200 × g für 4 min. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die PMPs mit 1-2 ml iMG-Basalmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, indem Sie ein kleines Aliquot nehmen und 1:1 mit Trypanblau verdünnen.
         HINWEIS: 0,5-1,5 × 10⁶ PMPs werden normalerweise jede Woche erhalten, abhängig von der iPSC-Linie und dem Alter der EB-Kultur.
      3. Zentrifugieren Sie die restlichen Zellen erneut bei 200 × g für 4 min. Die PMPs werden auf die gewünschte Konzentration so verdünnt, dass die Zellen mit einer Dichte von ~10⁵/^cm2 auf Zellkultur-behandelten Platten mit frisch hergestelltem iMG-Komplettmedium plattiert werden. Führen Sie alle 3-4 Tage während 10-12 Tagen einen Halbmediumwechsel mit frisch zubereitetem iMG-Komplettmedium durch, um eine terminale Differenzierung zu ermöglichen.
         HINWEIS: An diesem Punkt sollten die Zellen eine mikrogliaähnliche Morphologie erwerben. Um das Engagement von PMPs für das Schicksal von Mikroglia zu bestätigen, wird eine Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt, um die Expression von mit Mikroglia angereicherten Markern wie dem purinergen Rezeptor P2RY12 und dem Transmembranprotein 119 (TMEM119)⁹ zu bestätigen.
      4. Um die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, führen Sie alle Experimente zwischen den Tagen 10 bis 12 der iMG-Differenzierung durch.

2. Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen aus Motorneuronen

1. Transkriptionsfaktor-vermittelte Differenzierung von iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen (i³LMNs)
   HINWEIS: Eine WTC11-Linie mit stabiler Insertion der hNIL-induzierbaren Transkriptionsfaktorkassette, die die Transkriptionsfaktoren Neurogenin-2 (NGN2), Islet-1 (ISL1) und LIM Homöobox 3 (LHX3) enthält, in den CLYBL-Safe-Harbor-Locus wurde für den zuvor beschriebenen Differenzierungsprozess verwendet.¹⁷. Die iPSC-Linie wurde wie in Schritt 1.1.1 beschrieben, jedoch mit den in Schritt 1.2.1 beschriebenen Beschichtungsbedingungen beibehalten. Jedes extrazelluläre Matrixbeschichtungsreagenz kann für die Kultivierung von iPS-Zellen verwendet werden, die für die neuronale Differenzierung verwendet werden, da Laminin 521 nicht benötigt wird. Alle Medien werden vor Gebrauch für mindestens 1 h auf Umgebungstemperatur ausgeglichen.
   1. Beschichten Sie 10 cm Schalen mit 5 ml Standardbeschichtungslösung wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.
      HINWEIS: Hier wurden 3-4 10 cm Geschirr pro Differenzierung verwendet.
   2. Induktionsbasismedium und Sterilfilter vorbereiten und bis zu 3 Wochen bei 4 °C lagern.
   3. Neuron medium, sterilen Filter vorbereiten und bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.
   4. Bereiten Sie den Boratpuffer vor, indem Sie 100 mM Borsäure, 25 mM Natriumtetraborat und 75 mM Natriumchlorid in sterilem Wasser mischen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,5 ein und filtern Sie ihn steril.
   5. Sobald iPSCs eine Konsistenz von 80% erreicht haben, waschen Sie die Zellen mit DPBS und entfernen Sie die Kolonien durch Zugabe von 0,5 mM EDTA.
      HINWEIS: Zwei Vertiefungen sind in der Regel für jede 10 cm Schüssel ausreichend.
   6. Inkubieren Sie die Zellen für 4-5 min bei Umgebungstemperatur. Entfernen Sie die EDTA und geben Sie 3 ml DMEM/F12 mit HEPES in jede Vertiefung.
   7. Schaben Sie die Zellen mit einem Zellheber ab und verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um die Zellen vom Boden des Brunnens zu entfernen, indem Sie vorsichtig 2-3x auf und ab pipettieren.
   8. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 3 min.
   9. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml iPSC-Medium , das 10 μM ROCK-Inhibitor enthält, und zählen Sie sie mit einem Hämazytometer.
   10. Platte 1,5 × 10⁶ iPSCs in einer vorbeschichteten 10-cm-Schale mit 12 mL iPSC-Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
   11. Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. Fügen Sie 12 ml frisch zubereitetes Complete Induction-Medium hinzu, um die Expression der Transkriptionsfaktoren zu induzieren.
   12. An Tag 2 beschichten Sie 10 cm Schalen mit 5 ml Neuronenbeschichtungslösung, die mit gleichen Volumina von 0,1 mg/ml Poly-D-Lysin und 1 mg/ml Poly-L-Ornithin in Boratpuffer verdünnt hergestellt wurde. Über Nacht bei 37 °C und 5% CO₂ inkubieren.
   13. Am Tag 3 waschen Sie das beschichtete Geschirr 3x mit sterilem Wasser, saugen Sie das Wasser vollständig ab und lassen Sie das Geschirr trocknen, indem Sie die Teller kippen und es mindestens 1 Stunde bei Umgebungstemperatur teilweise unbedeckt in einem Biosicherheitsschrank lassen.
   14. Sobald die Gerichte vollständig getrocknet sind, beschichten Sie sie mit 6 mL Complete Induction Medium , ergänzt mit 15 μg/mL Laminin und 40 μM BrdU für mindestens 1 h bei 37 °C und 5%_CO2.
       HINWEIS: Eine BrdU-Behandlung wird empfohlen, um mitotisch aktive Zellen zu eliminieren und somit die Reinheit der neuronalen Kulturen zu verbessern. Die Auswirkungen von BrdU auf die neuronale Gesundheit sind minimal.
   15. Behandeln Sie die differenzierenden Zellen mit 3 ml Dissoziationsreagenz pro 10 cm Schale und inkubieren Sie für 3-4 min bei Umgebungstemperatur.
   16. Geben Sie 6 ml DPBS in die Platte, ohne das Dissoziationsreagenz zu entfernen, und pipettieren Sie die Zellen in Lösung 4-5x mit einer 10-ml-Pipette, um die Zellen zu dissoziieren.
   17. Sammeln Sie die Zellsuspension und führen Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein 50-ml-konisches Röhrchen. Fügen Sie 1 ml Induktionsbasismedium hinzu, um das Sieb zu spülen.
   18. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 5 min. Saugen Sie das Medium ab und resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml Complete Induction Medium , das 40 μM BrdU enthält.
   19. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Etwa 2,5 × 10 6 Zellen pro 10 cm Schale in vorbeschichtete Schalen geben, indem die Zellen in⁶ ml vollständigem Induktionsmedium mit 40 μM BrdU verdünnt werden, ohne die in Schritt 2.1.14 hinzugefügte Beschichtungslösung zu entfernen.
   20. Am Tag 4 saugen Sie das Medium ab, waschen Sie die Zellen 1x mit DPBS und fügen Sie ein frisches Komplettinduktionsmedium mit 40 μM BrdU hinzu.
   21. Am Tag 6 saugen Sie das Medium ab, waschen Sie die Zellen 1x mit DPBS und fügen Sie Neuronmedium hinzu, das mit 1 μg / ml Laminin ergänzt wird.
   22. Ändern Sie an Tag 9 1/^{3 des} Mediums, indem Sie es durch frisches Neuron-Medium ersetzen, das mit 1 μg / ml Laminin ergänzt wird.
   23. Halten Sie i 3 LMNs für weitere 25 Tage aufrecht, indem Sie halbe Mediumwechsel mit Neuron-Medium durchführen, das alle^3-4Tage mit frischem 1 μg / ml Laminin ergänzt wird.
       HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollten i³LMNs eine neuronale Morphologie mit langen Prozessen aufweisen. Neuronen neigen auch dazu, Klumpen oder Cluster von Zellen zu bilden. Eine detailliertere Beschreibung, wie die Differenzierung von i³LMNs validiert werden kann, findet sich an anderer Stelle¹⁷.
2. Synaptosomenreinigung und -markierung
   HINWEIS: Halten Sie sterile Bedingungen aufrecht und führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitswerkbank durch.
   1. Waschen Sie i³ LMNs zweimal mit DPBS.
   2. Fügen Sie 2 ml eiskaltes Zelllysereagenz zur Isolierung von Synaptosomen hinzu, inkubieren Sie 2 Minuten auf Eis und kratzen Sie die Neuronen fest ab.
   3. Das Lysat in mehrere 2-ml-Mikroröhrchen (~1,5 mL Lysat pro Röhrchen) überführen und bei 1.200 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
      HINWEIS: Halten Sie die Röhrchen während dieses Vorgangs auf Eis.
   4. Den Überstand auffangen (Pellet entsorgen) und bei 15.000 g × g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Speichern und resuspendieren Sie das Pellet mit den Synaptosomen mit einem ähnlichen Volumen (wie das ursprüngliche Lysat) von 5% DMSO in DPBS.
      HINWEIS: Die Synaptosomen können sofort mit einem Fluorophor markiert oder bei -80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden.
   5. Führen Sie einen Bicinchoninic Acid (BCA)-Proteintest für alle Röhrchen durch, um die Gesamtausbeute an Protein in der Synaptosomenzubereitung zu beurteilen.
      HINWEIS: Andere Assays zur Messung der Proteinkonzentration können verwendet werden. Die Gesamtproteinausbeute aus verschiedenen Zubereitungen wurde in Tabelle 1 als Referenz aufgeführt. Es wird empfohlen, eine Western-Blot-Analyse des Synaptosomenpräparats durchzuführen, um das Vorhandensein präsynaptischer und postsynaptischer Proteine zu bestätigen. Hier wurden der präsynaptische Marker Synaptophysin (SYP) und der postsynaptische Marker, das postsynaptische Dichteprotein 95 (PSD95), für die Western-Blotting-Analyse ausgewählt, wie zuvor beschrieben¹⁹.
   6. Bereiten Sie eine Lösung von 100 mM Natriumbicarbonat in Wasser vor, stellen Sie den pH-Wert auf 8,5 ein und filtern Sie ihn steril.
   7. 1 mg lyophilisiertes Pulver des verwendeten pH-sensitiven Farbstoffs werden in 150 μL DMSO gelöst. Stellen Sie Einwegaliquots her und lagern Sie sie bei -80 °C.
   8. Zentrifugieren Sie die Synaptosomen bei 15.000 × g für 5 min bei 4 °C.
   9. Verdünnen Sie bis zu 1 mg Synaptosomen in 100 μL 100 mM Natriumbicarbonatlösung.
   10. Um die Synaptosomen zu markieren, fügen Sie 1 μL des rekonstituierten pH-empfindlichen Farbstoffs pro 1 mg Synaptosomen hinzu und decken Sie die Reaktion mit Aluminiumfolie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Bei Raumtemperatur 2 h mit einem Tubenschüttler schütteln.
   11. Geben Sie 1 ml DPBS in das Röhrchen und zentrifugieren Sie die markierten Synaptosomen bei 15.000 × g für 5 min bei 4 °C.
   12. Entfernen Sie den Überstand und führen Sie vier weitere Waschgänge durch, wie in Schritt 2.2.11 beschrieben.
   13. Nach dem abschließenden Waschen und Schleudern den Überstand so weit wie möglich entfernen, ohne das Pellet zu stören, und die markierten Synaptosomen mit 5% DMSO in DPBS in einem Volumen für die gewünschte Konzentration (0,7 μg/μL hier verwendet) resuspendieren. Einwegaliquots zubereiten und bei -80 °C lagern. Achten Sie darauf, Lichteinwirkung auf die markierten Synaptosomen zu vermeiden.
3. Lebendzell-Phagozytose-Assay
   1. Die Platte 20-30 × 10⁴ PMP in 96-Well-Platten in 100 μL iMG-Gesamtmedium einfüllen und den Differenzierungsprozess 10 Tage lang wie in Schritt 1.2.4 angegeben befolgen.
   2. Bereiten Sie am Tag des Assays die Kernfärbelösung vor, indem Sie 1 Tropfen eines Kernflecks für lebende Zellen in 2 ml iMG-Basalmedium geben.
   3. Entfernen Sie 40 μL Medium pro Vertiefung der 96-Well-Platte und fügen Sie 10 μL der Kernfärbelösung mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Die Platte bei 37 °C und 5%_CO2 für 2 h inkubieren.
   4. Die markierten Synaptosomen auf Eis auftauen und vorsichtig mit einem Wasserbeschaller für 1 min beschallen. Übertragen Sie die Synaptosomen sofort wieder auf Eis. Verdünnen Sie die markierten Synaptosomen in iMG vollständigem Medium in einem Verhältnis von 1 μL Synaptosomen pro 50 μL Medium.
      HINWEIS: Die Konzentration des Synaptosoms ist assayabhängig und kann optimiert werden. Um einen relativ niedrigen Prozentsatz (d. H. 0,1% oder weniger) von DMSO im Medium aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, nicht mehr als 2 μL Synaptosomen pro Vertiefung hinzuzufügen.
   5. Als Negativkontrolle einige der Vertiefungen mit Cytochalasin D vorbehandeln, um die Aktinpolymerisation und damit die Phagozytose zu hemmen. Bereiten Sie eine Lösung von 60 μM Cytochalasin D in iMG vollständigem Medium vor. 10 μL dieser Lösung werden in jede Vertiefung gegeben, um eine Endkonzentration von 10 μM zu erhalten, und bei 37 °C und 5%_CO2 für 30 min inkubiert.
   6. Die Platte aus dem Inkubator nehmen und 10 min bei 10 °C inkubieren. Die Platte wird auf Eis gehalten und 50 μl Medium mit Synaptosomen hinzugefügt, das wie in Schritt 2.3.4 beschrieben hergestellt wurde.
   7. Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 × g für 3 min bei 10 °C und halten Sie die Platte bis zur Aufnahme der Bildgebung auf Eis.
4. Bildgebungserfassung und -analyse
   1. Führen Sie die Platte in ein Bildgebungsgerät mit lebender Zelle ein und wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen aus.
   2. Wählen Sie ein 20-faches Objektiv.
   3. Stellen Sie den Fokus, die Intensität der Leuchtdiode (LED), die Integrationszeit und die Verstärkung der Hellfeld - und Blaukanäle (4',6-Diamidino-2-phenylindol [DAPI]) ein. Die Synaptosomenfluoreszenz sollte zum Anfangszeitpunkt vernachlässigbar sein. Um sich auf den roten Kanal (RFP) zu konzentrieren, verwenden Sie den Hellfeldkanal als Referenz. Die Integrationszeit und der Gewinn können zwischen den Experimenten variieren. Verwenden Sie diese Anfangseinstellungen für den roten Kanal: LED: 4, Integrationszeit: 250 und Verstärkung: 5.
   4. Wählen Sie die Anzahl der einzelnen Kacheln, die in einer Montage pro Vertiefung erfasst werden sollen (erfassen Sie 16 Kacheln in der Mitte des Bohrlochs, wodurch etwa 5% der gesamten Wellfläche abgebildet werden). Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und das gewünschte Zeitintervall für die Bildgebung ein.
      HINWEIS: Die Bilder wurden in dieser Studie alle 1 - 2 h für bis zu 16 h aufgenommen.
   5. Öffnen Sie die Analysesoftware.
      1. Öffnen Sie das Experiment, das die Bilder enthält. Klicken Sie auf das Symbol Datenreduktion.
      2. Wählen Sie im Menü unter Bildbearbeitung die Option Imaging-Stitching aus, um ein vollständiges Bild aus den 4 x 4 einzelnen Kacheln in der Montage mit den in Tabelle 2 beschriebenen Parametern zu erstellen.
      3. Nachdem die zusammengefügten Bilder erstellt wurden, definieren Sie einen Intensitätsschwellenwert mithilfe der DAPI- und RFP-Kanäle für diese Bilder. Öffnen Sie ein Bild und klicken Sie auf Analysieren; Wählen Sie unter Analyse die Option Mobilfunkanalyse aus, und wählen Sie unter Erkennungskanal ein zusammengefügtes Bild entweder im DAPI- oder RFP-Kanal aus. Wechseln Sie zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl und legen Sie einen Schwellenwert und Objektgrößenwerte fest, die die Zellkerne im DAPI-Kanal oder das Synaptosomensignal im RFP-Kanal richtig auswählen. Wiederholen Sie den Vorgang mit verschiedenen Bildern, bis Parameter, die auf das gesamte Experiment angewendet werden können, optimiert sind.
         HINWEIS: Die vorgeschlagenen Werte finden Sie in Tabelle 2.
      4. Um die Anzahl der Kerne zu zählen, wechseln Sie zum Menü Datenreduktion, und wählen Sie unter Bildanalyse die Option Zellanalyse aus. Wechseln Sie zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl, wählen Sie unter Kanal die DAPI-zusammengefügten Bilder aus, und verwenden Sie die in Tabelle 2 beschriebenen Parameter.
      5. Wechseln Sie zur Registerkarte Berechnete Metriken und wählen Sie Zellenanzahl aus. Um den Bereich des Synaptosomensignals zu erhalten, gehen Sie zum Menü Datenreduktion und wählen Sie unter Analyse die Option Zelluläre Analyse aus.
      6. Wechseln Sie zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl , wählen Sie unter Kanal die Option RFP-gestickte Bilder aus, und verwenden Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Parameter.
      7. Wechseln Sie zur Registerkarte Berechnete Metriken und wählen Sie Objektsummenbereich. Klicken Sie auf der Registerkarte Datenreduktion auf OK und lassen Sie die Software alle aufgenommenen Bilder analysieren.
      8. Exportieren Sie die Werte für Objektsummenbereich und Zellenanzahl für jeden Zeitpunkt. Teilen Sie die Objektsummenfläche durch die Zellanzahl, um die normalisierte Fläche pro Zeitpunkt zu berechnen. Wenn Sie mehrere Behandlungen oder Genotypen vergleichen, berechnen Sie den Phagozytoseindex mit Gleichung (1):
         (1)
      9. Speichern Sie die Ergebnisse und integrieren Sie die Daten.

Ergebnisse

Um iMGs mit diesem Protokoll zu generieren, ist es wichtig, mit undifferenzierten iPSCs zu beginnen, die eine kompakte Koloniemorphologie mit gut definierten Kanten aufweisen (Abbildung 2A). Dissoziierte iPSCs, die wie im Abschnitt EB-Bildung beschrieben beibehalten werden, bilden sphärische Aggregate, die als EBs bezeichnet werden und bis zum Tag 4 der Differenzierung an Größe zunehmen (Abbildung 2B). Sobald die EBs gesammelt und unter den geeigneten Bedingu...

Diskussion

Das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll bietet eine effiziente Methode, um iPSC-abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen in ~6-8 Wochen mit hoher Reinheit und in ausreichender Ausbeute zu erhalten, um Immunfluoreszenzexperimente und andere Assays durchzuführen, die eine höhere Anzahl von Zellen erfordern. Dieses Protokoll hat bis zu 1 × 10⁶ iMGs in 1 Woche ergeben, was eine Protein- und RNA-Extraktion und entsprechende Downstream-Analysen (z.B. RNASeq, qRT-PCR, Western Blot, Massenspektrometrie) ermö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody	Wako Chemical USA	NC9288364	1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody	Abcam	ab6046	1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody	Abclonal	A6344	1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody	Millipore	MAB1596	1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM)	Sigma	B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (75 mM)	Sigma	S7653
Sodium tetraborate (25 mM)	Sigma	221732
Cell culture materials
6-well plates	Greiner Bio-One	657160
40 μm Cell Strainers	Falcon	352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated	CELLTREAT	229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile	CELLTREAT	229305
low adherence round-bottom 96-well plate	Corning	7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate	Corning	353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate	Corning	353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
Cell dissociation reagents
Accutase	Corning	25058CI	dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent	Life Technologies	12-605-010	dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning™	354230	Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine	Sigma	P7405	Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655	Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
mTeSR Plus Kit	STEMCELL Technology	100-0276	To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	final concentration 50 ng/mL
iPSC media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	final concentration 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	final concentration 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 100 ng/mL
PMP base media			final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-34	PeproTech or Biologend	200-34 or 577904	final concentration 100 ng/mL
iMG base media			final concentration 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES	Gibco	11330032	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E	Calbiochem	565790	final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline	Sigma	D9891	final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401	final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03	The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL	National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific Pierce	23227
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	87793	Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester	ThermoFisher Scientific	P36600	Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution	AMRESCO INC	K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D	Sigma		final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium	Corning	21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV	Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12	Gibco	12660012	Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017015	Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake	Benchmark		refer as tube shaker
Water sonicator	Elma	Mode Transsonic 310