JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает процесс дифференцировки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) в микроглиоподобные клетки для экспериментов in vitro . Мы также включили подробную процедуру генерации синаптосом человека из нижних двигательных нейронов, полученных из iPSC, которые могут быть использованы в качестве субстрата для анализов фагоцитоза in vitro с использованием систем визуализации живых клеток.

Аннотация

Микроглии являются резидентными иммунными клетками миелоидного происхождения, которые поддерживают гомеостаз в микроокружении мозга и стали ключевым игроком в многочисленных неврологических заболеваниях. Изучение микроглии человека в здоровье и болезнях представляет собой проблему из-за крайне ограниченного запаса человеческих клеток. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs), полученные от людей, могут быть использованы для обхода этого барьера. Здесь показано, как дифференцировать человеческие ИПСК в микроглиоподобные клетки (iMG) для экспериментов in vitro . Эти iMG демонстрируют ожидаемые и физиологические свойства микроглии, включая микроглиоподобную морфологию, экспрессию надлежащих маркеров и активный фагоцитоз. Кроме того, предоставляется документация по выделению и маркировке субстратов синаптосом, полученных из нижних двигательных нейронов человека, полученных из iPSC (i3LMN). Продольный анализ визуализации живых клеток используется для мониторинга поглощения синаптосом человека, помеченных pH-чувствительным красителем, что позволяет исследовать фагоцитарную способность iMG. Протоколы, описанные в настоящем документе, широко применимы к различным областям, которые исследуют биологию микроглии человека и вклад микроглии в заболевание.

Введение

Микроглии являются резидентными иммунными клетками в центральной нервной системе (ЦНС) и играют решающую роль в развитии ЦНС. Микроглия также важна в мозге взрослого человека для поддержания гомеостаза и активного реагирования на травмы и болезненные процессы. Кумулятивные данные показывают, что микроглия является ключевым фактором патогенеза множественных заболеваний нервного развития и нейродегенеративных заболеваний 1,2. Хотя современные знания о биологии микроглии были в основном получены из мышиных моделей, недавние исследования выявили важные различия между мышиной и человеческой микроглией, подчеркнув необходимость разработки технологий для изучения генетики и биологических функций микроглии человека 3,4. Выделение микроглии из рассеченной первичной ткани может сильно модифицировать свойства микроглии5, потенциально смешивая результаты, полученные с такими клетками. Общей целью этого метода является дифференциация человеческих ИПСК в иМГ, тем самым обеспечивая систему клеточных культур для изучения микроглии человека в базальных условиях. Кроме того, анализ фагоцитоза с использованием полностью человеческой модельной системы включен в настоящий документ в качестве средства для изучения функциональности iMG, как в качестве меры контроля качества, так и для оценки дисфункции iMG в контексте заболевания.

Множественные протоколы дифференциации микроглии от ИПСК недавно появились в литературе 6,7,8,9,10. Потенциальные недостатки некоторых протоколов включают длительные или длительные периоды дифференциации, добавление нескольких факторов роста и/или сложные экспериментальные процедуры 6,9,10. Здесь продемонстрирован «удобный для пользователя» метод дифференцировки, который повторяет аспекты онтогенеза микроглии путем дифференцировки иПСК в клетки-предшественники, называемые примитивными предшественниками макрофагов (PMP)7,11. PMP генерируются, как описано ранее, с некоторыми оптимизациями, представленными здесь12. PMP имитируют MYB-независимые макрофаги, полученные из желточного мешка, которые порождают микроглию во время эмбрионального развития, вторгаясь в мозг до закрытия гематоэнцефалического барьера13. Чтобы окончательно дифференцировать PMP в iMG, мы использовали быстрый и упрощенный метод монокультуры, основанный на протоколах Haenseler et al. и Brownjohn et al., с некоторыми модификациями для создания эффективного метода дифференциации микроглии, в котором iMG надежно экспрессируют маркеры, обогащенные микроглией 7,8. Этот метод дифференциации может быть воспроизведен в лабораториях, обладающих опытом в культуре иПСК и с исследовательскими целями, направленными на изучение биологии микроглии с использованием системы моделей человека.

Микроглии, полученные из iPSC, представляют собой биологически значимый источник микроглии человека для экспериментов in vitro и являются важным инструментом для исследования канонических функций микроглии, включая фагоцитоз. Микроглии являются профессиональными фагоцитами мозга и ЦНС, где они очищают клеточный мусор, агрегированные белки и деградированный миелин14. Микроглия также функционирует в синаптическом ремоделировании путем поглощения синапсов и в защите от внешних инфекций через фагоцитоз патогенов15,16. В этом протоколе фагоцитоз iMGs оценивается с использованием синаптосом человека в качестве материала для поглощения iMG. С этой целью описано выделение синаптосом, полученных из человеческих i3ЛМН. Синаптосомы человека, полученные из i3LMN, помечены pH-чувствительным красителем, который позволяет количественно определять синаптосомы, локализованные в кислых компартментах во время обработки и деградации фагосом in vitro. Показан анализ фагоцитоза с использованием живоклеточной микроскопии для мониторинга динамического процесса поглощения микроглии в режиме реального времени. Этот функциональный анализ устанавливает основу для исследования возможных дефектов фагоцитоза микроглии в здоровье и болезни с использованием полной системы человека.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, используемые в этом протоколе, должны быть стерильными, и все этапы должны выполняться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях. Все линии iPSC, а также носители обслуживания и дифференциации описаны в Таблице материалов. Способ дифференцировки микроглии, проиллюстрированный ниже, основан на ранее опубликованных протоколах 7,8,12 с новыми модификациями, описанными в настоящем описании.

1. Дифференциация микроглии

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор протокола кратко изложен на рисунке 1.

  1. Индуцированная культура плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию, описывающую методы культивирования iPSC, можно найти в другом месте17.
    1. Оттаивание и техническое обслуживание
      1. Подготовьте iPSC medium, аликвотируйте среду и храните при -20 °C до 6 месяцев. Разморозьте аликвоты на ночь при 4 °C и используйте их до 1 недели. Оставьте среду при температуре окружающей среды не менее чем на 1 ч перед использованием.
      2. Покрыть колодцы 6-луночной пластины путем добавления 1 мл 10 мкг/мл ламинина 521, разбавленного в DPBS, содержащих кальций и магний18. Храните пластины в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение не менее 2 ч или предпочтительно в течение ночи. После разбавления храните ламинин при 4 °C в течение 3 месяцев.
      3. Готовят 10 мМ ингибитора роназы Y27632 (ингибитор ROCK) стоковым раствором путем разведения в стерильной воде. Делают одноразовые аликвоты раствора ингибитора ROCK и хранят их при -20 °C до 1 года.
      4. Готовят 0,5 мМ ЭДТА путем разбавления исходного раствора 0,5 М ЭДТА в ДПБС.
      5. Чтобы разморозить флакон замороженных ИПСК, поместите флакон на водяную баню при 37 °C, пока он не будет в основном разморожен. Немедленно перенесите содержимое флакона в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл iPSC-среды. Центрифуга при 500 × г в течение 1 мин.
      6. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки, добавляя 1 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, медленно к стенке трубки, чтобы избежать нарушения колоний.
      7. Добавьте 1,5 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, в каждую из покрытых скважин и перенесите по каплям восстановленные колонии в скважины, содержащие среду.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 5-7 капель из шага 1.1.1.6 для поддержания культуры, но отрегулируйте оптимальную плотность посева для каждой линии iPSC.
      8. Равномерно распределите ячейки в колодцах, вручную перетасовывая пластину из стороны в сторону и назад спереди. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. На следующий день полностью замените среду, добавив свежую среду iPSC без ингибитора ROCK.
      9. Для поддержания меняйте среду каждый день, пока клетки не достигнут 80% слияния.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут поддерживаться без изменения среды в течение 2 дней, если используемая среда iPSC позволяет гибкий график кормления. Рекомендуется ограничить это до одного раза за проход и только в том случае, если клетки менее 50% сливаются.
    2. Расщепление
      1. Аспирировать среду и промыть клетки 1 мл DPBS (без кальция и магния).
      2. Чтобы выбить клетки, добавляют 1 мл 0,5 мМ ЭДТА и инкубируют в течение 2-3 мин при комнатной температуре до тех пор, пока края клеточных колоний не поднимутся с поверхности лунки. Снова промыть клетки DPBS и добавить 1 мл iPSC среды.
      3. Диссоциируйте клеточные колонии, осторожно соскребая их с помощью клеточного лифтера. Соскребайте каждый участок колодца только один раз, чтобы не беспокоить колонии.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные методы вытеснения колоний из колодца можно найти в другом месте17.
      4. Используя наконечник пипетки объемом 1 мл, соберите ячейки и перенесите их капля за каплей в соотношении 1:6 (ячейки к среде) в предварительно покрытые лунки (как упоминалось на этапе 1.1.1.2), содержащие 1,5 мл среды iPSC.
  2. Дифференцировка iPSC в микроглиоподобные клетки (iMG)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Малые молекулы и факторы роста растворяются в стерильно-фильтрованном 0,1% бычьем сывороточном альбумине в DPBS до концентрации запаса в 1000 раз выше конечной концентрации. Рекомендуется дифференцировать ИПСК в иМГ во время ранних проходов. Рекомендуется регулярное кариотипирование линий iPSC.
    1. Приготовьте стандартный раствор для покрытия
      1. Разморозьте исходный раствор реагента для покрытия внеклеточного матрикса на льду при 4 °C в течение ночи.
      2. Трубки для микроцентрифуг Prechill и наконечники фильтрующих пипеток при 4 °C.
      3. Aliquot 250 мкл концентрированного экстраклеточного реагента покрытия внеклеточного матрикса вводят в каждую трубку и сразу же помещают на лед. Храните аликвоты при -20 °C.
      4. Для приготовления раствора покрытия разморозьте один из экстраклеточных матриксов покрытия реагентом аликот на льду при 4 °C в течение ночи.
      5. Добавьте 50 мл ледяной среды DMEM-F12, оптимизированной для роста эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (называемых DMEM-F12), в предварительно охлажденную коническую трубку и удерживайте ее на льду.
      6. Охладите наконечник пипетки объемом 1 мл, несколько раз пипетируя холодный DMEM-F12 вверх и вниз, а затем немедленно используйте наконечник пипетки для переноса 250 мкл реагента внеклеточного матричного покрытия в коническую трубку, содержащую среду DMEM-F12.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный раствор для покрытия можно хранить в течение 2 недель при температуре 4 °C.
    2. Формирование эмбриоидного тела (EB)
      1. Приготовьте EB среду , которую можно поддерживать при 4 °C в течение 4 дней.
      2. Как только ИПСК достигнут 80% конфюентности, диссоциируют колонии путем промывки 1 мл DPBS и добавления 1 мл диссоциационного реагента в течение 2 мин при 37 °C. Вытесняйте колонии с помощью клеточного лифтера, соскребая несколько раз, чтобы создать одноклеточную суспензию. Соберите клетки и переложите все в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл DPBS.
      3. Центрифугируют клетки при 500 × г в течение 1 мин, удаляют супернатант и повторно суспендируют клетки в 1 мл среды EB. Взять 10 мкл клеток и разбавить 1:1 трипаном синего. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра и, основываясь на количестве клеток, разбавьте клеточный запас до окончательного разбавления 10 000 клеток на 100 мкл. Для гальванических ячеек добавьте 100 мкл разбавленных ячеек на скважину в пластину с низким адгезией с круглым дном, 96 лунками.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 48 скважин из 96-луночной плиты могут быть получены из каждой 80% сливающейся скважины иПСК.
      4. Центрифугируют пластину при 125 × г в течение 3 мин и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 4 дней. Выполните половинную смену среды на 2-й день, используя многоканальную пипетку и осторожно собрав 50 мкл старой среды, а затем добавив обратно 50 мкл свежей среды EB.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На 4-й день иПСК образуют сферические клеточные структуры, называемые ЭБ, как описано в разделе результатов. Процесс дифференцировки EB при необходимости может быть продлен до 7 дней.
    3. Генерация примитивных предшественников макрофагов (PMP)
      1. Подготовьте базовую среду PMP, стерильно-фильтрующую, и храните ее при температуре 4 °C до 1 месяца.
      2. Покрывают колодцы 6-луночной пластиной, добавляя 1 мл ледяного раствора матригеля и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение по меньшей мере 2 ч или предпочтительно в течение ночи.
      3. На 4-й день дифференциации EB перенесите ЭБ в скважины, покрытые матригелем, собрав ЭБ с помощью наконечников пипетки объемом 1 мл (с использованием пипетки). Пипетка вверх и вниз один или два раза, чтобы выбить ЭБ из колодца. Держите плиту с 6 скважинами под наклонным углом, чтобы ЭБ располагались на краю скважины.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Девять или десять ЭБ могут быть покрыты на одно хорошо покрытое покрытие.
      4. После того, как все ЭБ успокоятся, аккуратно пипетку и удалите старую среду, используя наконечник пипетки 1 мл, сохраняя ЭБ на краю колодца. Добавьте в каждую лунку 3 мл свежеприготовленной полноценной среды ПМП . Равномерно распределите ячейки в колодцах, вручную перетасовывая пластину из стороны в сторону и назад спереди. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
      5. Не беспокоить пластину в течение 7 дней, чтобы позволить ЭБ прикрепиться к дну колодца. По истечении этого времени выполните половинное изменение среды, используя полную среду PMP.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе большинство ЭБ должны быть прикреплены к пластине. Любые плавающие ЭБ могут быть удалены.
      6. Через 5-7 дней осмотрите ЭБ под световым полевым микроскопом с 4-кратным увеличением, чтобы убедиться, что они прикреплены к дну скважин. Изменить среду, как описано в пункте 1.2.3.5. На 21-й день выполните полную смену среды с 3 мл полной среды PMP.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Миелоидные предшественники, плавающие в среде, могут быть очевидны в этот момент. Эти клетки должны быть выброшены во время изменения среды.
      7. На 28-й день найдите в супернатанте круглые ячейки, называемые PMP, и соберите среду, содержащую PMP, используя пипетку объемом 10 мл и автоматический пипеттор. Позаботьтесь о том, чтобы не беспокоить ЭБ. Перенесите PMP и среду в коническую трубку объемом 15 мл и действуйте в соответствии с описанием, описанным на этапе 1.2.4.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно PMP из одной и той же линии iPSC могут быть собраны из пяти скважин 6-луночной плиты и объединены вместе в одну коническую трубу объемом 15 мл.
      8. Добавьте 3 мл свежей полноценной среды PMP для дальнейшего поддержания ЭБ. Поскольку PMP непрерывно появляются из ЭБ в течение более 3 месяцев, собирайте их каждые 4-7 дней (не позволяйте среде изменять цвет на желтый тон), как описано в шагах 1.2.3.7 и 1.2.3.8.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя PMP могут собираться в течение нескольких месяцев, они могут со временем менять свой фенотип.
    4. Дифференциация по iMG
      1. Подготовьте базовый носитель iMG (Таблица материалов), стерильный фильтр и храните при 4 °C до 3 недель.
      2. После того, как PMP были собраны в коническую трубку объемом 15 мл, центрифугируйте их при 200 × г в течение 4 мин. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать PMP, используя 1-2 мл базальной среды iMG. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, взяв небольшую аликвоту и разбавляя 1:1 трипановым синим.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 0,5-1,5 × 106 PMP обычно получают каждую неделю в зависимости от линии iPSC и возраста культуры EB.
      3. Центрифугируют остальные клетки снова при 200 × г в течение 4 мин. Разбавьте PMP до желаемой концентрации таким образом, чтобы клетки покрывались плотностью ~105/см2 на обработанных клеточными культурами пластинах с использованием свежеприготовленной полной среды iMG. Выполняйте половинную смену среды, используя свежеприготовленную полную среду iMG каждые 3-4 дня в течение 10-12 дней, чтобы обеспечить терминальную дифференциацию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент клетки должны приобрести микроглиоподобную морфологию. Чтобы подтвердить приверженность PMP судьбе микроглии, проводится иммунофлуоресцентный анализ для подтверждения экспрессии обогащенных микроглией маркеров, таких как пуринергический рецептор P2RY12 и трансмембранный белок 119 (TMEM119)9.
      4. Чтобы сохранить здоровье и жизнеспособность клеток, выполните все эксперименты между 10 и 12 днями дифференцировки iMG.

2. Анализ фагоцитоза с использованием синаптосом человека, полученных из моторных нейронов

  1. Транскрипционный фактор-опосредованная дифференцировка нижних двигательных нейронов, полученных из iPSC (i3ЛМН)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для процесса дифференцировки использовалась линия WTC11 со стабильной вставкой индуцируемого hNIL-фактора транскрипционного фактора, содержащего нейрогенин-2 (NGN2), островок-1 (ISL1) и факторы транскрипции LIM homeobox 3 (LHX3), в локус безопасной гавани CLYBL, как описано ранее.17. Линия iPSC поддерживалась, как описано на этапе 1.1.1, но с условиями покрытия, описанными на этапе 1.2.1. Любой реагент покрытия внеклеточного матрикса может быть использован для культивирования иПСК, которые будут использоваться для дифференцировки нейронов, поскольку ламинин 521 не требуется. Все среды уравновешиваются до температуры окружающей среды в течение не менее 1 ч перед использованием.
    1. Покрыть 10 см посуду 5 мл стандартного раствора покрытия, как описано на этапе 1.2.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались 3-4 блюда по 10 см за дифференциацию.
    2. Подготовьте среду Induction Base, стерильный фильтр, и храните при 4 °C до 3 недель.
    3. Приготовьте среду Neuron, стерильно-фильтруйте, и храните ее при 4 °C до 2 недель.
    4. Приготовьте боратный буфер, смешав 100 мМ борной кислоты, 25 мМ тетрабората натрия и 75 мМ хлорида натрия в стерильной воде. Отрегулируйте рН до 8,5 и стерильно отфильтруйте его.
    5. Как только иПСК достигнут 80% слияния, промывайте клетки с DPBS и вытесняйте колонии, добавляя 0,5 мМ ЭДТА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого 10-сантиметрового блюда обычно достаточно двух лунок.
    6. Инкубировать клетки в течение 4-5 мин при температуре окружающей среды. Удалите ЭДТА и добавьте 3 мл DMEM/F12 с HEPES в каждую лунку.
    7. Соскоблите ячейки с помощью подъемника и используйте пипетку 10 мл, чтобы удалить ячейки со дна колодца, осторожно пипетируя вверх и вниз 2-3x.
    8. Соберите клетки в коническую трубку объемом 15 мл и центрифугу по 300 × г в течение 3 мин.
    9. Повторно суспендируют клетки в 3 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, и подсчитывают их с помощью гемацитометра.
    10. Пластина 1,5 × 106 iPSCs в предварительно покрытой 10 см посуде с 12 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ.
    11. На следующий день удалите среду и промыть клетки DPBS. Добавьте 12 мл свежеприготовленной среды Complete Induction , чтобы индуцировать экспрессию факторов транскрипции.
    12. На 2-й день обмазать 10 см посуду 5 мл раствора для покрытия нейронов, приготовленного с равными объемами 0,1 мг/мл поли-D-лизина и 1 мг/мл поли-L-орнитина, разведенного в боратном буфере. Инкубировать в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.
    13. На 3-й день вымойте покрытую оболочкой посуду стерильной водой 3x, полностью аспирируйте воду и дайте посуде высохнуть, наклонив тарелки и оставив их частично непокрытыми внутри шкафа биобезопасности в течение не менее 1 ч при температуре окружающей среды.
    14. После того, как блюда полностью высохнут, покройте их 6 мл полной индукционной среды , дополненной 15 мкг/мл ламинина и 40 мкМ BrdU в течение не менее 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение BrdU рекомендуется для устранения митотически активных клеток и, таким образом, для повышения чистоты нейронных культур. Влияние BrdU на здоровье нейронов минимально.
    15. Обработать дифференцирующие клетки 3 мл диссоциационного реагента на чашку 10 см и инкубировать в течение 3-4 мин при температуре окружающей среды.
    16. Добавьте 6 мл DPBS в пластину, не удаляя диссоциационный реагент, и пипетку клеток в растворе вверх и вниз 4-5x с пипеткой 10 мл для диссоциации клеток.
    17. Соберите клеточную суспензию и пропустите ее через клеточный ситечко 40 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 1 мл индукционной базовой среды для промывки ситечка.
    18. Центрифугируют клетки при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать среду и повторно суспендировать клетки в 3 мл полной индукционной среды , содержащей 40 мкМ BrdU.
    19. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Пластину приблизительно 2,5 × 106 ячеек на чашку размером 10 см в предварительно покрытую посуду путем разбавления клеток в 6 мл полной индукционной среды , содержащей 40 мкМ BrdU, без удаления раствора покрытия, добавленного на стадии 2.1.14.
    20. На 4-й день аспирируйте среду, промывайте клетки 1 раз DPBS и добавляйте свежую среду Complete Induction , содержащую 40 мкМ BrdU.
    21. На 6-й день аспирируйте среду, промывайте клетки 1 раз DPBS и добавляйте среду Neuron , дополненную 1 мкг/мл ламинина.
    22. На 9-й день измените 1/3-ю часть среды, заменив ее свежей средой Neuron , дополненной 1 мкг/мл ламинина.
    23. Поддерживайтеi 3ЛМН в течение дополнительных 25 дней, выполняя половинные изменения среды с нейронной средой , дополненной свежим 1 мкг / мл ламинина каждые 3-4 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент времени i3ЛМН должны представлять морфологию нейронов с длительными процессами. Нейроны также имеют тенденцию образовывать скопления или скопления клеток. Более подробное описание того, как проверить дифференциацию i 3 ЛМН,можно найти в другом месте17.
  2. Очистка и маркировка синаптосом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильные условия и выполняйте все шаги внутри шкафа биобезопасности.
    1. Мойтеi 3 ЛМН дважды с DPBS.
    2. Добавьте 2 мл ледяного клеточного лизиса реагента для выделения синаптосом, инкубируйте на льду в течение 2 мин и плотно соскоблите нейроны.
    3. Переложите лизат на несколько микротрубок по 2 мл (~1,5 мл лизата на пробирку) и центрифугу при 1 200 × г в течение 10 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте трубки на льду на протяжении всей этой процедуры.
    4. Собрать супернатант (отбросить гранулу) и центрифугу при 15 000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Сохраните и повторно суспендируйте гранулы, содержащие синаптосомы с аналогичным объемом (как и исходный лизат) 5% DMSO в DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синаптосомы могут быть немедленно помечены флуорофором или сохранены при -80 °C для будущего использования.
    5. Выполните анализ белка бицинхониновой кислоты (BCA) для всех трубок, чтобы оценить общий выход белка в препарате синаптосомы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения концентрации белка могут быть использованы другие анализы. Общий выход белка, полученного из различных препаратов, был включен в таблицу 1 в качестве эталона. Рекомендуется проводить вестерн-блоттинговый анализ препарата синаптосом для подтверждения наличия пресинаптических и постсинаптических белков. Здесь пресинаптический маркер, синаптофизин (SYP), и постсинаптический маркер, постсинаптический белок плотности 95 (PSD95), были выбраны для анализа вестерн-блоттинга, как описано ранее19.
    6. Приготовьте раствор бикарбоната натрия 100 мМ в воде, отрегулируйте рН до 8,5 и стерильно-фильтруйте.
    7. Солюбилизируйте 1 мг лиофилизированного порошка используемого рН-чувствительного красителя в 150 мкл ДМСО. Сделайте одноразовые аликвоты и храните их при -80 °C.
    8. Центрифугируют синаптосомы при 15 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    9. Разводят до 1 мг синаптосом в 100 мкл раствора бикарбоната натрия 100 мМ.
    10. Чтобы маркировать синаптосомы, добавляют 1 мкл восстановленного pH-чувствительного красителя на 1 мг синаптосом и покрывают реакцию алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света. Встряхните при комнатной температуре в течение 2 ч с помощью шейкера для трубок.
    11. Добавьте в пробирку 1 мл DPBS и центрифугируйте меченые синаптосомы при 15 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    12. Удалите супернатант и выполните четыре дополнительные промывки, как описано в шаге 2.2.11.
    13. После окончательной промывки и отжима удалите супернатант как можно больше, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте меченые синаптосомы с 5% DMSO в DPBS в объеме для желаемой концентрации (здесь используется 0,7 мкг/мкл). Приготовьте одноразовые аликвоты и храните при -80 °C. Обязательно избегайте воздействия света на меченые синаптосомы.
  3. Анализ фагоцитоза живых клеток
    1. Пластина 20-30 × 104 PMP в 96-луночные пластины в 100 мкл полной среды iMG и следовать процессу дифференцировки в течение 10 дней, как указано на этапе 1.2.4.
    2. В день анализа готовят раствор для ядерного окрашивания, добавляя 1 каплю ядерного пятна для живых клеток в 2 мл базальной среды iMG.
    3. Удалите 40 мкл среды на лунку 96-луночной пластины и добавьте 10 мкл раствора для ядерного окрашивания с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать пластину при 37 °C и 5% CO2 в течение 2 ч.
    4. Разморозьте меченые синаптосомы на льду и аккуратно нанесите ультразвук с помощью водяного ультразвука в течение 1 мин. Немедленно перенесите синаптосомы обратно в лед. Разбавляют меченые синаптосомы в полной среде iMG в соотношении 1 мкл синаптосом на 50 мкл среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация синаптосом зависит от анализа и может потребовать оптимизации. Для поддержания относительно низкого процента (т.е. 0,1% или менее) ДМСО в среде рекомендуется не добавлять более 2 мкл синаптосом на лунку.
    5. В качестве отрицательного контроля предварительно обработайте некоторые скважины цитохалазином D для ингибирования полимеризации актина и, следовательно, фагоцитоза. Готовят раствор 60 мкМ цитохалазина D в полной среде iMG. Добавляют 10 мкл этого раствора в каждую лунку для конечной концентрации 10 мкМ и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 30 мин.
    6. Выньте пластину из инкубатора и инкубируйте при 10 °C в течение 10 мин. Выдержите пластину на льду и добавьте 50 мкл среды, содержащей синаптосомы, приготовленные, как описано на этапе 2.3.4.
    7. Центрифугируйте пластину при 270 × г в течение 3 мин при 10 °C и держите пластину на льду до получения изображения.
  4. Получение и анализ изображений
    1. Вставьте пластину в считыватель изображений живых клеток и выберите скважины для анализа.
    2. Выберите объектив 20x .
    3. Отрегулируйте фокусировку, интенсивность светодиодов (LED), время интеграции и усиление яркого поля и синего (4',6-диамидино-2-фенилиндол [DAPI]) каналов. Флуоресценция синаптосом должна быть незначительной в начальной точке времени. Чтобы сфокусироваться на красном (RFP) канале, используйте канал яркого поля в качестве эталона. Время интеграции и коэффициент усиления могут варьироваться в зависимости от эксперимента; используйте следующие начальные настройки для красного канала: LED: 4, время интеграции: 250 и коэффициент усиления: 5.
    4. Выберите количество отдельных плиток, которые будут приобретены при монтаже на скважину (приобретите 16 плиток в центре скважины, тем самым получив визуализацию примерно 5% от общей площади скважины). Установите температуру на 37 °C и требуемый интервал времени для визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были получены каждые 1 - 2 ч в течение 16 ч в этом исследовании.
    5. Откройте программное обеспечение для анализа.
      1. Откройте эксперимент, содержащий изображения. Щелкните значок Сокращение данных.
      2. В меню выберите Imaging Stitching в разделе Обработка изображений , чтобы создать полное изображение из 4 x 4 отдельных плиток в монтаже с параметрами, описанными в таблице 2.
      3. После создания сшитых изображений определите порог интенсивности , используя каналы DAPI и RFP для этих изображений. Откройте изображение и нажмите « Анализировать»; в разделе Анализ выберите Клеточный анализ, а в разделе Канал обнаружения выберите сшитое изображение в каналах DAPI или RFP. Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и установите пороговое значение и значения размера объекта , которые правильно выбирают ядра ячеек в канале DAPI или сигнал синаптосомы в канале RFP. Повторяйте процесс с различными изображениями до тех пор, пока не будут оптимизированы параметры, которые могут быть применены ко всему эксперименту.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые значения приведены в таблице 2.
      4. Чтобы подсчитать количество ядер, перейдите в меню «Уменьшение данных» и в разделе «Анализ изображений» выберите «Клеточный анализ». Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и в разделе Канал выберите сшитые изображения DAPI и используйте параметры, описанные в таблице 2.
      5. Перейдите на вкладку Вычисляемые метрики и выберите Количество ячеек. Чтобы получить площадь сигнала синаптосомы, перейдите в меню «Уменьшение данных» и в разделе «Анализ» выберите «Клеточный анализ».
      6. Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и в разделе Канал выберите Сшитые изображения RFP и используйте параметры, описанные в таблице 2.
      7. Перейдите на вкладку Вычисляемые метрики и выберите Область суммы объектов. На вкладке Data Reduction нажмите OK и позвольте программному обеспечению проанализировать все полученные изображения.
      8. Экспортируйте значения «Площадь суммы объектов» и «Количество ячеек» для каждой точки времени. Разделите площадь суммы объектов на количество ячеек, чтобы вычислить нормализованную площадь за точку времени. При сравнении нескольких методов лечения или генотипов рассчитайте индекс фагоцитоза, используя уравнение (1):
        figure-protocol-27113 (1)
      9. Сохраните результаты и интегрируйте данные.

Результаты

Для генерации iMG с использованием этого протокола важно начать с недифференцированных iPSCs, которые показывают компактную колониальную морфологию с четко определенными ребрами (рисунок 2A). Диссоциированные ИПСК, поддерживаемые, как описано в разделе формирования ЭБ, бу?...

Обсуждение

Протокол дифференцировки, описанный здесь, обеспечивает эффективный метод получения микроглиоподобных клеток, полученных из iPSC, за ~ 6-8 недель с высокой чистотой и с достаточным выходом для проведения экспериментов по иммунофлуоресценции и других анализов, требующих большего количес?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Авторы благодарят Майкла Уорда за предоставление линии WTC11 hNIL iPSC для дифференцировки моторных нейронов и Лаборатории Джексона за поставку клона KOLF2.1J WT линии B03 iPSC, используемой для дифференцировки микроглии. Мы также благодарим Дороти Шафер за ее поддержку во время внедрения протоколов, Энтони Джампетруцци и Джона Ландерса за их помощь с системой визуализации живых клеток, а также Хейдена Гэдда за его технический вклад во время пересмотра и Джонатана Юнга за его сотрудничество в этом исследовании. Эта работа была поддержана Фондом неврологии Дэна и Дианы Риччио из Медицинской школы UMASS Chan и Angel Fund, Inc.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibodyWako Chemical USANC92883641:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibodySigma-AldrichHPA0145181:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibodySigma-AldrichHPA0518701:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibodyAbcamab60461:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibodyAbclonalA63441:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibodyMilliporeMAB15961:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM)SigmaB6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (75 mM)Sigma S7653
Sodium tetraborate (25 mM)Sigma221732
Cell culture materials
6-well platesGreiner Bio-One657160
40 μm Cell Strainers Falcon352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture TreatedCELLTREAT229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, SterileCELLTREAT229305
low adherence round-bottom 96-well plateCorning7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture PlateCorning353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture PlateCorning353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom MicroplateCorning353872
Cell dissociation reagents
Accutase Corning25058CIdissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagentLife Technologies12-605-010dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane MatrixCorning™354230Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521STEMCELL Technology77004Referred as to laminin 521
Poly-D-LysineSigmaP7405Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-OrnithineSigma P3655Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
 mTeSR Plus KitSTEMCELL Technology100-0276To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4Fisher ScientificPHC9534final concentration 50 ng/mL
iPSC mediafinal concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632Fisher ScientificBD 562822final concentration 10 µM
SCFPeproTech300-07final concentration 20 ng/mL
VEGFPeproTech100-20Afinal concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAXGibco35050061final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15Lonza12001-988final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanolGibco21985023final concentration 55 µM
IL-3PeproTech200-03final concentration 25 ng/mL
M-CSFPeproTech300-25final concentration 100 ng/mL
PMP base mediafinal concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12Gibco12634010final concentration 1x
GlutaMAXGibco35050061final concentration 1x
N2 supplement, 100xGibco17502-048final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanolGibco21985023final concentration 55 µM
IL-34PeproTech or Biologend200-34 or 577904final concentration 100 ng/mL
iMG base mediafinal concentration 1x
M-CSFPeproTech300-25final concentration 5 ng/mL
TGF-βPeproTech100-21final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPESGibco11330032final concentration 1x
GlutaMAXGibco35050061final concentration 1x
N2 supplement, 100xGibco17502-048final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100xGibco11140050final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound ECalbiochem565790final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
DoxycyclineSigmaD9891final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base mediafinal concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632Fisher ScientificBD 562822final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture SystemGibcoA3653401final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAXGibco35050061final concentration 1x
N2 supplement, 100xGibco17502-048final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100xGibco11140050final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03The Jackson Laboratories
WTC11 hNILNational Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay KitThermo Scientific Pierce23227
dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction ReagentThermo Scientific87793Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagentInvitrogen R37605
pHrodo Red, succinimidyl esterThermoFisher Scientific P36600Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% SolutionAMRESCO INCK940-100ML
Bovine serum albumin (BSA)Sigma22144-77-0
BrdUSigmaB9285Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin DSigmafinal concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesiumCorning21-030-CV
DPBS without calcium and magnesiumCorning21-031-CVReferred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12Gibco12660012Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, NaturalGibco23017015Referred as to laminin
Software and Equipment
CentrifugeEppendorfModel 5810R
Cytation 5 live cell imaging readerBiotek
Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBiotekversion 3.03
Multi-Therm Heat-ShakeBenchmarkrefer as tube shaker
Water sonicatorElmaMode Transsonic 310

Ссылки

  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены