Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani

Riepilogo

Questo protocollo descrive il processo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in cellule simili alle microglia per la sperimentazione in vitro . Includiamo anche una procedura dettagliata per generare sinaptosomi umani da motoneuroni inferiori derivati da iPSC che possono essere utilizzati come substrato per saggi di fagocitosi in vitro utilizzando sistemi di imaging di cellule vive.

Abstract

Le microglia sono le cellule immunitarie residenti di origine mieloide che mantengono l'omeostasi nel microambiente cerebrale e sono diventate un attore chiave in molteplici malattie neurologiche. Lo studio della microglia umana in salute e malattia rappresenta una sfida a causa della fornitura estremamente limitata di cellule umane. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da individui umani possono essere utilizzate per aggirare questa barriera. Qui, viene dimostrato come differenziare le iPSC umane in cellule simili alla microglia (iMG) per la sperimentazione in vitro . Queste iMG mostrano le proprietà attese e fisiologiche della microglia, compresa la morfologia simile alla microglia, l'espressione di marcatori appropriati e la fagocitosi attiva. Inoltre, viene fornita la documentazione per l'isolamento e l'etichettatura dei substrati di sinaptosomi derivati da motoneuroni inferiori derivati da iPSC umani (i³LMN). Un test di imaging longitudinale a cellule vive viene utilizzato per monitorare l'inghiottimento dei sinaptosomi umani marcati con un colorante sensibile al pH, consentendo indagini sulla capacità fagocitaria di iMG. I protocolli qui descritti sono ampiamente applicabili a diversi campi che stanno studiando la biologia della microglia umana e il contributo della microglia alle malattie.

Introduzione

Le microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo del SNC. Le microglia sono anche importanti nel cervello adulto per mantenere l'omeostasi e rispondere attivamente ai traumi e ai processi patologici. Evidenze cumulative mostrano che le microglia sono fattori chiave per la patogenesi di molteplici malattie neuroevolutive e neurodegenerative ^1,2. Sebbene le attuali conoscenze sulla biologia microgliale siano state prevalentemente derivate da modelli murini, studi recenti hanno chiarito importanti differenze tra microglia murina, sottolineando la necessità di sviluppare tecnologie per studiare la genetica e le funzioni biologiche della microglia umana ^3,4. L'isolamento della microglia dal tessuto primario sezionato può modificare gravemente le proprietà della microglia⁵, potenzialmente confondendo i risultati acquisiti con tali cellule. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di differenziare le iPSC umane in iMG, fornendo così un sistema di coltura cellulare per studiare la microglia umana in condizioni basali. Inoltre, un test di fagocitosi che utilizza un sistema modello completamente umano è incluso nel presente documento come mezzo per studiare la funzionalità delle iMG, sia come misura di controllo della qualità che per valutare la disfunzione di iMG nel contesto della malattia.

Protocolli multipli per la differenziazione delle microglia dalle iPSC sono recentemente emersi in letteratura 6,7,8,9,10. I potenziali svantaggi di alcuni protocolli includono lunghi o prolungati periodi di differenziazione, l'aggiunta di più fattori di crescita e/o procedure sperimentali complesse ^6,9,10. Qui viene dimostrato un metodo di differenziazione "user-friendly" che ricapitola aspetti dell'ontogenesi della microglia attraverso la differenziazione di iPSCs in cellule precursori denominate precursori primitivi dei macrofagi (PMP)^7,11. I PMP vengono generati come descritto in precedenza, con alcune ottimizzazioni presentate qui¹². I PMP imitano i macrofagi derivati dal sacco vitellino indipendenti da MYB, che danno origine alla microglia durante lo sviluppo embrionale invadendo il cervello prima della chiusura della barriera emato-encefalica¹³. Per differenziare terminalmente i PMP in iMG, abbiamo utilizzato un metodo di monocoltura veloce e semplificato basato sui protocolli di Haenseler et al. e Brownjohn et al., con alcune modifiche per generare un efficiente metodo di differenziazione della microglia in cui le iMG esprimono robustamente marcatori arricchiti di microglia ^7,8. Questo metodo di differenziazione può essere riprodotto in laboratori con esperienza nella coltura di iPSC e con obiettivi di ricerca volti a studiare la biologia delle microglia utilizzando un sistema modello umano.

Le microglia derivate da iPSC rappresentano una fonte biologicamente rilevante di microglia umana per la sperimentazione in vitro e sono uno strumento importante per studiare le funzioni canoniche microgliali, compresa la fagocitosi. Le microglia sono i fagociti professionali del cervello e del SNC, dove eliminano i detriti cellulari, le proteine aggregate e la mielina degradata¹⁴. Le microglia funzionano anche nel rimodellamento sinaptico inghiottendo le sinapsi e nella difesa contro le infezioni esterne attraverso la fagocitosi dei patogeni^15,16. In questo protocollo, la fagocitosi da parte di iMG viene valutata utilizzando sinaptosomi umani come materiale per l'inghiottimento di iMG. A tal fine, viene descritta una descrizione per isolare i sinaptosomi derivati da i³LMN umani. I sinaptosomi umani derivati da i³LMN sono marcati con un colorante sensibile al pH che consente la quantificazione dei sinaptosomi localizzati all'interno di compartimenti acidi durante l'elaborazione e la degradazione dei fagosomi in vitro. Viene mostrato un test di fagocitosi utilizzando la microscopia a cellule vive per monitorare il processo dinamico di inghiottimento della microglia in tempo reale. Questo test funzionale stabilisce una base per studiare possibili difetti nella fagocitosi microgliale in salute e malattia utilizzando un sistema umano completo.

Protocollo

NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo devono essere sterili e tutte le fasi devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza in condizioni sterili. Tutte le linee iPSC, così come i mezzi di manutenzione e differenziazione, sono descritti nella Tabella dei Materiali. Il metodo di differenziazione delle microglia illustrato di seguito si basa^{sui protocolli} 7,8,12 precedentemente pubblicati con nuove modifiche qui descritte.

1. Differenziazione delle microglia

NOTA: una panoramica del protocollo è riepilogata nella Figura 1.

1. Coltura di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)
   NOTA: Ulteriori dettagli che descrivono le tecniche di coltura iPSC sono disponibili altrove¹⁷.
   1. Scongelamento e manutenzione
      1. Preparare il terreno iPSC, aliquote del terreno e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Scongelare le aliquote per una notte a 4 °C e utilizzarle per un massimo di 1 settimana. Lasciare il fluido a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.
      2. Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti aggiungendo 1 mL di 10 μg/mL di laminina 521 diluita in DPBS contenente calcio e magnesio¹⁸. Conservare le piastre in un'incubatrice a 37 °C e al 5% di CO 2 per almeno₂ ore o preferibilmente durante la notte. Una volta diluita, conservare la laminina a 4 °C per 3 mesi.
      3. Preparare 10 mM di soluzione madre di inibitore della chinasi Rho chinasi Y27632 (inibitore ROCK) diluendo in acqua sterile. Produrre aliquote monouso della soluzione inibitrice di ROCK e conservarle a -20 °C per un massimo di 1 anno.
      4. Preparare 0,5 mM EDTA diluendo la soluzione madre di 0,5 M EDTA in DPBS.
      5. Per scongelare un flaconcino di iPSC congelate, porre il flaconcino a bagnomaria a 37 °C fino a quando non è per lo più scongelato. Trasferire immediatamente il contenuto del flaconcino in un tubo conico da 15 mL contenente 4 mL di mezzo iPSC. Centrifugare a 500 × g per 1 min.
      6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo 1 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK lentamente contro la parete del tubo per evitare il disturbo delle colonie.
      7. Aggiungere 1,5 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK a ciascuno dei pozzetti rivestiti e trasferire le colonie risospese goccia a goccia ai pozzetti contenenti il mezzo.
         NOTA: Utilizzare 5-7 gocce dal punto 1.1.1.6 per il mantenimento della coltura, ma regolare la densità di semina ottimale per ogni linea iPSC.
      8. Distribuire uniformemente le celle nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da dietro a davanti. Posizionare le celle in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂. Il giorno successivo, sostituire completamente il terreno aggiungendo un nuovo mezzo iPSC senza inibitore ROCK.
      9. Per il mantenimento, cambiare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.
         NOTA: Le celle possono essere mantenute senza cambiare il terreno per 2 giorni se il mezzo iPSC utilizzato consente un programma di alimentazione flessibile. Si consiglia di limitare questo a una volta per passaggio e solo se le cellule sono meno del 50% confluenti.
   2. Emicranico
      1. Aspirare il mezzo e lavare le cellule con 1 mL di DPBS (senza calcio e magnesio).
      2. Per rimuovere le cellule, aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA e incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente fino a quando i bordi delle colonie cellulari si sollevano dalla superficie del pozzetto. Lavare nuovamente le celle con DPBS e aggiungere 1 mL di mezzo iPSC.
      3. Dissociare le colonie cellulari raschiandole delicatamente usando un sollevatore cellulare. Raschiare ogni area del pozzo solo una volta per evitare di disturbare le colonie.
         NOTA: Metodi alternativi per rimuovere le colonie dal pozzo possono essere trovati altrove¹⁷.
      4. Utilizzando una punta per pipetta da 1 ml, raccogliere le cellule e trasferirle goccia a goccia in rapporto 1:6 (cellule e mezzo) in pozzetti prepatinati (come indicato al punto 1.1.1.2) contenenti 1,5 mL di mezzo iPSC.
2. Differenziazione iPSC in cellule simili alla microglia (iMG)
   NOTA: Le piccole molecole e i fattori di crescita sono disciolti in albumina sierica bovina allo 0,1% filtrata sterile in DPBS a una concentrazione di riserva 1.000 volte superiore alla concentrazione finale. Si raccomanda di differenziare le iPSC in iMG durante i primi passaggi. Si consiglia il cariotipo di routine delle linee iPSC.
   1. Preparare la soluzione di rivestimento standard
      1. Scongelare la soluzione madre di un reagente di rivestimento della matrice extracellulare su ghiaccio a 4 °C durante la notte.
      2. Prechill tubi per microcentrifuga e punte di pipette filtranti a 4 °C.
      3. Aliquot 250 μL del reagente di rivestimento concentrato della matrice extracellulare in ciascuna provetta e posto immediatamente su ghiaccio. Conservare le aliquote a -20 °C.
      4. Per preparare la soluzione di rivestimento, scongelare una delle aliquote del reagente di rivestimento della matrice extracellulare sul ghiaccio a 4 °C durante la notte.
      5. Aggiungere 50 ml di DMEM-F12 ghiacciato ottimizzato per la crescita di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte (indicato come DMEM-F12) in un tubo conico prerefrigerato e tenerlo in ghiaccio.
      6. Raffreddare una punta di pipetta da 1 mL pipettando più volte DMEM-F12 ghiacciato su e giù, quindi utilizzare immediatamente la punta della pipetta per trasferire 250 μL del reagente di rivestimento della matrice extracellulare nel tubo conico contenente il mezzo DMEM-F12.
         NOTA: La soluzione di rivestimento standard può essere conservata per 2 settimane a 4 °C.
   2. Formazione del corpo embrioide (EB)
      1. Preparare il terreno EB che può essere mantenuto a 4 °C per un massimo di 4 giorni.
      2. Una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, dissociare le colonie lavando con 1 mL di DPBS e aggiungendo 1 mL di un reagente di dissociazione per 2 minuti a 37 °C. Rimuovere le colonie utilizzando un sollevatore di cellule raschiando più volte per creare una sospensione a cella singola. Raccogliere le cellule e trasferire tutto in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL di DPBS.
      3. Centrifugare le cellule a 500 × g per 1 minuto, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di mezzo EB. Prendere 10 μL di cellule e diluire 1:1 con Trypan blue. Contare le cellule con un ematocitometro e, in base al numero di cellule, diluire lo stock cellulare fino a una diluizione finale di 10.000 cellule per 100 μL. Per le celle di placcatura, aggiungere 100 μL delle celle diluite per pozzetto in una piastra a bassa aderenza, a fondo arrotondato, a 96 pozzetti.
         NOTA: Generalmente, 48 pozzetti della piastra a 96 pozzetti possono essere ottenuti da ciascun pozzo confluente all'80% di iPSC.
      4. Centrifugare la piastra a 125 × g per 3 minuti e incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 4 giorni. Eseguire un cambio medio-medio il giorno 2 utilizzando una pipetta multicanale e raccogliendo delicatamente 50 μL di vecchio fluido, quindi aggiungendo 50 μL di terreno EB fresco.
         NOTA: Il giorno 4, le iPSC formeranno strutture cellulari sferiche denominate EB come descritto nella sezione dei risultati. Il processo di differenziazione EB può essere esteso fino a 7 giorni, se necessario.
   3. Generazione di precursori primitivi dei macrofagi (PMP)
      1. Preparare il terreno base PMP, filtrare sterile e conservarlo a 4 °C per un massimo di 1 mese.
      2. Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti aggiungendo 1 ml di soluzione di rivestimento Matrigel ghiacciata e incubare a 37 °C e 5% di CO 2 per almeno₂ ore o preferibilmente durante la notte.
      3. Il giorno 4 della differenziazione EB, trasferire gli EB nei pozzetti rivestiti Matrigel raccogliendo gli EB con 1 mL di punte per pipette (usando una pipetta). Pipettare su e giù una o due volte per rimuovere gli EB dal pozzo. Tenere la piastra a 6 pozzetti con un angolo inclinato per consentire agli EB di depositarsi sul bordo del pozzo.
         NOTA: nove o dieci EB possono essere placcati per pozzetto rivestito.
      4. Una volta che tutti gli EB si sono sistemati, pipettare delicatamente e rimuovere il vecchio mezzo utilizzando una punta di pipetta da 1 mL mantenendo gli EB sul bordo del pozzetto. Aggiungere 3 ml di terreno completo PMP appena preparato a ciascun pozzetto. Distribuire uniformemente le celle nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da dietro a davanti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO₂.
      5. Non disturbare la piastra per 7 giorni per consentire agli EB di attaccarsi al fondo del pozzo. Dopo tale periodo, eseguire una modifica semi-media utilizzando il mezzo completo PMP.
         NOTA: A questo punto, la maggior parte degli EB deve essere attaccata alla piastra. Qualsiasi EB galleggiante può essere rimosso.
      6. Dopo 5-7 giorni, ispezionare gli EB al microscopio a campo luminoso con ingrandimento 4x per assicurarsi che siano attaccati al fondo dei pozzetti. Modificare il supporto come descritto al punto 1.2.3.5. Il giorno 21, eseguire un cambio completo del mezzo con 3 ml di terreno completo PMP.
         NOTA: I progenitori mieloidi che galleggiano nel mezzo possono essere evidenti a questo punto. Queste celle devono essere scartate durante il cambio del mezzo.
      7. Il giorno 28, cercare celle rotonde denominate PMP nel surnatante e raccogliere il mezzo contenente i PMP utilizzando una pipetta da 10 ml e un pipettatore automatico. Fare attenzione a non disturbare gli EB. Trasferire i PMP e il mezzo in un tubo conico da 15 mL e procedere come descritto al punto 1.2.4.
         NOTA: Di solito i PMP della stessa linea iPSC possono essere raccolti da cinque pozzetti di una piastra a 6 pozzetti e raggruppati insieme in un singolo tubo conico da 15 ml.
      8. Aggiungere 3 ml di PMP fresco completo per un'ulteriore manutenzione degli EB. Poiché i PMP emergono continuamente dagli EB per più di 3 mesi, raccoglierli ogni 4-7 giorni (non consentire al mezzo di cambiare colore in un tono giallo) come descritto nei passaggi 1.2.3.7 e 1.2.3.8.
         NOTA: Sebbene i PMP possano essere raccolti per diversi mesi, possono cambiare il loro fenotipo nel tempo.
   4. Differenziazione rispetto alle iMG
      1. Preparare il terreno base iMG (Table of Materials), filtrare sterile e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
      2. Una volta raccolti i PMP in una provetta conica da 15 ml, centrifugarli a 200 × g per 4 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere i PMP utilizzando 1-2 mL di mezzo basale iMG. Contare le cellule utilizzando un emocitometro prendendo una piccola aliquota e diluendo 1:1 con Trypan blue.
         NOTA: 0,5-1,5 × 10⁶ PMP sono normalmente ottenuti ogni settimana a seconda della linea iPSC e dell'età della cultura EB.
      3. Centrifugare nuovamente il resto delle cellule a 200 × g per 4 minuti. Diluire i PMP alla concentrazione desiderata in modo tale che le cellule siano placcate ad una densità di ~10⁵/cm² su piastre trattate con colture cellulari utilizzando il mezzo completo iMG appena preparato. Eseguire un cambio medio-medio utilizzando il mezzo completo iMG appena preparato ogni 3-4 giorni per 10-12 giorni per consentire la differenziazione terminale.
         NOTA: A questo punto, le cellule dovrebbero acquisire morfologia simile alla microglia. Per confermare l'impegno delle PMP nel destino delle microglia, viene eseguita un'analisi di immunofluorescenza per corroborare l'espressione di marcatori arricchiti di microglia come il recettore purinergico P2RY12 e la proteina transmembrana 119 (TMEM119)⁹.
      4. Per preservare la salute e la vitalità cellulare, eseguire tutti gli esperimenti tra i giorni 10 e 12 della differenziazione iMG.

2. Saggio di fagocitosi utilizzando sinaptosomi umani derivati da motoneuroni

1. Differenziazione mediata dal fattore di trascrizione dei motoneuroni inferiori derivati da iPSC (i³LMN)
   NOTA: Per il processo di differenziazione è stata utilizzata una linea WTC11 con inserimento stabile della cassetta del fattore di trascrizione inducibile hNIL contenente i fattori di trascrizione neurogenina-2 (NGN2), isol-1 (ISL1) e LIM homeobox 3 (LHX3) nel locus Safe Harbor CLYBL¹⁷. La linea iPSC è stata mantenuta come descritto al punto 1.1.1, ma con le condizioni di rivestimento descritte nella fase 1.2.1. Qualsiasi reagente di rivestimento della matrice extracellulare può essere utilizzato per la coltura di iPSC che verranno utilizzate per la differenziazione neuronale poiché la laminina 521 non è richiesta. Tutti i fluidi sono equilibrati a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.
   1. Rivestire i piatti di 10 cm con 5 ml di soluzione di rivestimento standard come descritto al punto 1.2.1.
      NOTA: Qui, sono stati utilizzati 3-4 piatti da 10 cm per differenziazione.
   2. Preparare il mezzo Induction Base, filtrare sterilemente e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
   3. Preparare il mezzo Neuron, filtrare sterilemente e conservarlo a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
   4. Preparare il tampone borato mescolando 100 mM di acido borico, 25 mM di tetraborato di sodio e 75 mM di cloruro di sodio in acqua sterile. Regolare il pH a 8,5 e filtrarlo sterilemente.
   5. Una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, lavare le cellule con DPBS e rimuovere le colonie aggiungendo 0,5 mM di EDTA.
      NOTA: Due pozzetti sono generalmente sufficienti per ogni piatto di 10 cm.
   6. Incubare le cellule per 4-5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'EDTA e aggiungere 3 ml di DMEM/F12 con HEPES a ciascun pozzetto.
   7. Raschiare le cellule usando un sollevatore di celle e utilizzare una pipetta da 10 ml per rimuovere le cellule dal fondo del pozzetto pipettando delicatamente su e giù 2-3 volte.
   8. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 3 minuti.
   9. Risospendere le cellule in 3 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK e contarle utilizzando un emocitometro.
   10. Piastra 1,5 × 10⁶ iPSC in un piatto prerivestito da 10 cm con 12 mL di terreno iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK.
   11. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con DPBS. Aggiungere 12 ml di mezzo di induzione completa appena preparato per indurre l'espressione dei fattori di trascrizione.
   12. Il giorno 2, rivestire piatti di 10 cm con 5 ml di soluzione di rivestimento neuronale preparata con volumi uguali di 0,1 mg / ml di poli-D-lisina e 1 mg / ml di poli-L-ornitina diluita in tampone borato. Incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO₂.
   13. Il giorno 3, lavare i piatti rivestiti con acqua sterile 3x, aspirare completamente l'acqua e lasciare asciugare i piatti inclinando le piastre e lasciandole parzialmente scoperte all'interno di un armadio di biosicurezza per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
   14. Una volta che le stoviglie sono completamente asciutte, ricoprirle con 6 ml di terreno di induzione completa integrato con 15 μg/ml di laminina e 40 μM di BrdU per almeno 1 ora a 37 °C e 5% di CO₂.
       NOTA: Il trattamento con BrdU è raccomandato per eliminare le cellule mitoticamente attive e quindi per migliorare la purezza delle colture neuronali. Gli effetti di BrdU sulla salute neuronale sono minimi.
   15. Trattare le cellule differenzianti con 3 ml di reagente di dissociazione per piatto da 10 cm e incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente.
   16. Aggiungere 6 mL di DPBS nella piastra senza rimuovere il reagente di dissociazione e pipettare le cellule in soluzione su e giù 4-5 volte con una pipetta da 10 mL per dissociare le cellule.
   17. Raccogliere la sospensione cellulare e farla passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 1 mL di base a induzione per risciacquare il colino.
   18. Centrifugare le cellule a 300 × g per 5 minuti. Aspirare il mezzo e risospendere le cellule in 3 mL di mezzo di induzione completa contenente 40 μM BrdU.
   19. Contare le cellule con un emocitometro. Placcare circa 2,5 × 10 6 celle per piatto da 10 cm in piatti prepatinati diluendo le celle in⁶ ml di mezzo di induzione completa contenente 40 μM di BrdU senza rimuovere la soluzione di rivestimento aggiunta al punto 2.1.14.
   20. Il giorno 4, aspirare il fluido, lavare le celle 1x con DPBS e aggiungere un nuovo mezzo di induzione completa contenente 40 μM di BrdU.
   21. Il giorno 6, aspirare il substrato, lavare le cellule 1x con DPBS e aggiungere Neuron medium integrato con 1 μg / mL di laminina.
   22. Al giorno 9, cambiare 1/3^del terreno sostituendolo con Neuron medium fresco integrato con 1 μg/mL di laminina.
   23. Mantenere i 3 LMN per altri 25 giorni eseguendo cambiamenti di mezzo medio con Neuron medium integrato con 1 μg/mL fresco di laminina ogni^3-4giorni.
       NOTA: In questo momento, i³LMN dovrebbero presentare una morfologia neuronale con processi lunghi. I neuroni tendono anche a formare grumi o gruppi di cellule. Una descrizione più dettagliata di come convalidare la differenziazione di i³LMN può essere trovata altrove¹⁷.
2. Purificazione ed etichettatura dei sinaptosomi
   NOTA: Mantenere condizioni sterili ed eseguire tutte le fasi all'interno di un armadio di biosicurezza.
   1. Lavare i³ LMN due volte con DPBS.
   2. Aggiungere 2 ml di reagente di lisi cellulare ghiacciato per l'isolamento dei sinaptosomi, incubare sul ghiaccio per 2 minuti e raschiare saldamente i neuroni.
   3. Trasferire il lisato in più microtubi da 2 mL (~1,5 mL di lisato per provetta) e centrifugare a 1.200 × g per 10 minuti a 4 °C.
      NOTA: Mantenere i tubi sul ghiaccio durante questa procedura.
   4. Raccogliere il surnatante (scartare il pellet) e centrifugare a 15.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Salvare e risospendere il pellet contenente i sinaptosomi con un volume simile (come il lisato originale) del 5% di DMSO in DPBS.
      NOTA: I sinaptosomi possono essere immediatamente marcati con un fluoroforo o conservati a -80 °C per un uso futuro.
   5. Eseguire un test proteico dell'acido bicinconinico (BCA) per tutte le provette per valutare la resa totale di proteine nella preparazione del sinaptosoma.
      NOTA: Possono essere utilizzati altri test per misurare la concentrazione proteica. La resa proteica totale ottenuta da diversi preparati è stata inclusa nella tabella 1 come riferimento. Si raccomanda di eseguire l'analisi western blot della preparazione del sinaptosoma per confermare la presenza di proteine presinaptiche e postsinaptiche. Qui, il marcatore presinaptico, sinaptofisina (SYP), e il marcatore postsinaptico, la proteina di densità postsinaptica 95 (PSD95) sono stati scelti per l'analisi western blotting come descritto in precedenza¹⁹.
   6. Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 100 mM in acqua, regolare il pH a 8,5 e filtrare sterile.
   7. Solubilizzare 1 mg di polvere liofilizzata del colorante pH sensibile utilizzato in 150 μL di DMSO. Fabbricare aliquote monouso e conservarle a -80 °C.
   8. Centrifugare i sinaptosomi a 15.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
   9. Diluire fino a 1 mg di sinaptosomi in 100 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 100 mM.
   10. Per etichettare i sinaptosomi, aggiungere 1 μL del colorante ricostituito sensibile al pH per 1 mg di sinaptosomi e coprire la reazione con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Agitare a temperatura ambiente per 2 ore utilizzando uno scuotitubo.
   11. Aggiungere 1 mL di DPBS alla provetta e centrifugare i sinaptosomi marcati a 15.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
   12. Rimuovere il surnatante ed effettuare quattro lavaggi supplementari come descritto al punto 2.2.11.
   13. Dopo il lavaggio finale e la centrifuga, rimuovere il surnatante il più possibile senza disturbare il pellet e risospendere i sinaptosomi marcati con DMSO al 5% in DPBS ad un volume per la concentrazione desiderata (0,7 μg / μL utilizzati qui). Preparare aliquote monouso e conservare a -80 °C. Assicurati di evitare l'esposizione alla luce ai sinaptosomi etichettati.
3. Saggio di fagocitosi su cellule vive
   1. Piastra 20-30 × 10 4 PMP in piastre da 96 pozzetti in 100 μL di mezzo completo iMG e seguire il processo di differenziazione per 10 giorni come indicato al punto 1.2.4.
   2. Il giorno del test, preparare la soluzione di colorazione nucleare aggiungendo 1 goccia di una macchia nucleare per cellule vive in 2 ml di mezzo basale iMG.
   3. Rimuovere 40 μL di mezzo per pozzetto della piastra a 96 pozzetti e aggiungere 10 μL della soluzione di colorazione nucleare utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra a 37 °C e 5% CO 2 per₂ ore.
   4. Scongelare i sinaptosomi etichettati sul ghiaccio e sonicare delicatamente usando un sonicatore ad acqua per 1 minuto. Trasferire immediatamente i sinaptosomi al ghiaccio. Diluire i sinaptosomi marcati nel mezzo completo iMG con un rapporto di 1 μL di sinaptosomi per 50 μL di terreno.
      NOTA: La concentrazione del sinaptosoma dipende dal saggio e può richiedere un'ottimizzazione. Per mantenere una percentuale relativamente bassa (cioè lo 0,1% o meno) di DMSO nel mezzo, si consiglia di non aggiungere più di 2 μL di sinaptosomi per pozzetto.
   5. Come controllo negativo, pretrattare alcuni dei pozzetti con citocalasina D per inibire la polimerizzazione dell'actina e quindi la fagocitosi. Preparare una soluzione di 60 μM di citocalasina D nel mezzo completo iMG. Aggiungere 10 μL di questa soluzione in ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 10 μM e incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 30 min.
   6. Togliere la piastra dall'incubatore e incubare a 10 °C per 10 minuti. Mantenere la piastra su ghiaccio e aggiungere 50 μL di terreno contenente sinaptosomi preparati come descritto al punto 2.3.4.
   7. Centrifugare la piastra a 270 × g per 3 minuti a 10 °C e mantenere la piastra su ghiaccio fino all'acquisizione dell'imaging.
4. Acquisizione e analisi delle immagini
   1. Inserire la piastra in un lettore di imaging a cellule vive e selezionare i pozzetti da analizzare.
   2. Selezionare un obiettivo 20x .
   3. Regolare la messa a fuoco, l'intensità del diodo a emissione luminosa (LED), il tempo di integrazione e il guadagno dei canali brightfield e blu (4',6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI]). La fluorescenza del sinaptosoma dovrebbe essere trascurabile al momento iniziale. Per mettere a fuoco il canale rosso (RFP), utilizzare il canale campo luminoso come riferimento. Il tempo e il guadagno di integrazione possono variare tra gli esperimenti; utilizzare queste impostazioni iniziali per il canale rosso: LED: 4, tempo di integrazione: 250 e guadagno: 5.
   4. Selezionare il numero di singole tessere da acquisire in un montaggio per pozzetto (acquisire 16 tessere al centro del pozzo, visualizzando così circa il 5% dell'area totale del pozzo). Impostare la temperatura su 37 °C e l'intervallo di tempo desiderato per l'imaging.
      NOTA: Le immagini sono state acquisite ogni 1 - 2 ore per un massimo di 16 ore in questo studio.
   5. Aprire il software di analisi.
      1. Apri l'esperimento che contiene le immagini. Fare clic sull'icona Riduzione dati.
      2. Nel menu, selezionate Cucitura immagini in Elaborazione immagini per creare un'immagine completa dalle singole porzioni 4 x 4 nel montaggio con i parametri descritti nella Tabella 2.
      3. Una volta create le immagini cucite, definire una soglia di intensità utilizzando i canali DAPI e RFP per queste immagini. Apri un'immagine e fai clic su Analizza; In Analisi selezionare Analisi cellulare e in Canale di rilevamento selezionare un'immagine cucita nei canali DAPI o RFP. Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e stabilisci un valore di soglia e valori di dimensione dell'oggetto che selezionano correttamente i nuclei cellulari nel canale DAPI o il segnale del sinaptosoma nel canale RFP. Ripeti il processo con immagini diverse fino a quando i parametri che possono essere applicati all'intero esperimento non vengono ottimizzati.
         NOTA: i valori suggeriti sono riportati nella Tabella 2.
      4. Per contare il numero di nuclei, vai al menu Riduzione dati e, in Analisi immagine, seleziona Analisi cellulare. Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e in Canale, seleziona le immagini cucite DAPI e usa i parametri descritti nella Tabella 2.
      5. Vai alla scheda Metriche calcolate e seleziona Conteggio celle. Per ottenere l'area del segnale del sinaptosoma, vai al menu Riduzione dati e in Analisi, seleziona Analisi cellulare.
      6. Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e in Canale, seleziona Immagini cucite RFP e usa i parametri dettagliati nella Tabella 2.
      7. Vai alla scheda Metriche calcolate e seleziona Area somma oggetti. Nella scheda Riduzione dati , fare clic su OK e consentire al software di analizzare tutte le immagini acquisite.
      8. Esportare i valori Area somma oggetti e Conteggio celle per ogni punto temporale. Dividere l'area della somma degli oggetti per il conteggio delle celle per calcolare l'area normalizzata per punto temporale. Se si confrontano più trattamenti o genotipi, calcolare l'indice di fagocitosi utilizzando l'equazione (1):
         (1)
      9. Salvare i risultati e integrare i dati.

Risultati

Per generare iMG utilizzando questo protocollo, è importante iniziare con iPSC indifferenziate che mostrano una morfologia compatta della colonia con bordi ben definiti (Figura 2A). Le iPSC dissociate mantenute come descritto nella sezione sulla formazione di EB formeranno aggregati sferici, chiamati EB, che cresceranno di dimensioni fino al giorno 4 della differenziazione (Figura 2B). Una volta che gli EB sono stati raccolti e placcati nelle condizioni appropr...

Discussione

Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un metodo efficiente per ottenere cellule simili a microglia derivate da iPSC in ~ 6-8 settimane con elevata purezza e in una resa sufficiente per eseguire esperimenti di immunofluorescenza e altri test che richiedono un numero maggiore di cellule. Questo protocollo ha prodotto fino a 1 × 10⁶ iMG in 1 settimana, il che consente l'estrazione di proteine e RNA e le corrispondenti analisi a valle (ad esempio, RNASeq, qRT-PCR, western blot, spettrometria di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody	Wako Chemical USA	NC9288364	1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA014518	1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody	Sigma-Aldrich	HPA051870	1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody	Abcam	ab6046	1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody	Abclonal	A6344	1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody	Millipore	MAB1596	1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM)	Sigma	B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (75 mM)	Sigma	S7653
Sodium tetraborate (25 mM)	Sigma	221732
Cell culture materials
6-well plates	Greiner Bio-One	657160
40 μm Cell Strainers	Falcon	352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated	CELLTREAT	229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile	CELLTREAT	229305
low adherence round-bottom 96-well plate	Corning	7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate	Corning	353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate	Corning	353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning	353872
Cell dissociation reagents
Accutase	Corning	25058CI	dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent	Life Technologies	12-605-010	dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning™	354230	Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine	Sigma	P7405	Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655	Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
mTeSR Plus Kit	STEMCELL Technology	100-0276	To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	final concentration 50 ng/mL
iPSC media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	final concentration 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	final concentration 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 100 ng/mL
PMP base media			final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	final concentration 55 µM
IL-34	PeproTech or Biologend	200-34 or 577904	final concentration 100 ng/mL
iMG base media			final concentration 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	final concentration 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES	Gibco	11330032	final concentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E	Calbiochem	565790	final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline	Sigma	D9891	final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media			final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401	final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX	Gibco	35050061	final concentration 1x
N2 supplement, 100x	Gibco	17502-048	final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x	Gibco	11140050	final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03	The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL	National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific Pierce	23227
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	87793	Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester	ThermoFisher Scientific	P36600	Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution	AMRESCO INC	K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D	Sigma		final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium	Corning	21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV	Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12	Gibco	12660012	Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017015	Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake	Benchmark		refer as tube shaker
Water sonicator	Elma	Mode Transsonic 310