基于流式细胞术的心肌B细胞定量和分析

摘要

在这里，我们报告了一种使用流式细胞术根据心肌B淋巴细胞在血管内或内皮空间中的位置对心肌B淋巴细胞进行定量和分化的协议。

摘要

越来越多的证据表明，B淋巴细胞在心肌生理学和心肌适应损伤的背景下起着重要作用。然而，文献报告了关于心肌B细胞患病率的对比数据。据报道，B细胞既是啮齿动物心脏中最普遍的免疫细胞之一，要么存在，但患病率明显低于骨髓细胞，或者相当罕见。同样，几组人描述急性缺血性心肌损伤后心肌B细胞数量增加，但一组报告受损心肌B细胞数量没有变化。实施一种共享的、可重复的方法来评估心肌B细胞的患病率对于协调不同研究小组的观察结果至关重要，从而促进B细胞心肌相互作用研究的进展。根据我们的经验，文献中报道的看似相反的观察结果可能源于这样一个事实，即鼠心肌B细胞大多在血管内并与微血管内皮相连。因此，从小鼠心脏中回收的B细胞数量对用于清洁器官的灌注条件和所使用的消化方法非常敏感。在这里，我们报告了一个优化的协议，该协议以特定的方式考虑了这两个关键变量。该协议能够对鼠心肌B细胞的数量进行可重复的，基于流式细胞术的分析，并允许研究人员区分血管外与血管内心肌B细胞。

引言

B淋巴细胞是高度特化的免疫细胞，在适应性和先天免疫反应中都起着重要作用¹。B细胞有两个主要群体:较小的B1细胞群，主要在胚胎生命期间产生，以及成年后在骨髓中产生的B2细胞群占^{主导地位1。}在骨髓中成熟后，B细胞迁移到原代和次级淋巴器官。从那里，它们在通过血管和淋巴管的淋巴器官之间不断循环²。B细胞在其表面表达特异性抗体，其作为受体发挥作用。当B细胞遇到与其受体结合的抗原时，可以触发激活信号。活化的B细胞要么迁移到发现抗原的组织，要么回到骨髓，在那里它们可以成熟为产生抗体的浆细胞^3，4。

最近，人们认识到心脏含有大量的B细胞。对啮齿动物的研究表明，B细胞在^{胚胎发育早期}定植在心脏5，并且心肌相关B细胞大多是血管内幼稚的B2细胞粘附在内皮6，7上^，其中B1^{细胞的比例}很小⁷。仍有许多不确定的领域，但现有数据表明，B细胞在幼稚的心脏和心肌适应损伤的背景下都起着重要作用。

对幼稚鼠心脏的研究表明，在基线时心肌B细胞大多位于血管内间隙，粘附在内皮上（发现>95%的小鼠心脏B细胞位于血管内间隙）。发现这些B细胞的基因表达模式与从外周血分离的循环B细胞的基因表达模式不同。对B细胞缺陷动物的幼稚心脏和同系对照的分析发现，缺乏B细胞的动物心脏较小，射血分数^较高6。所有这些证据表明，B细胞可能调节心肌生长和/或心肌功能，不仅间质，而且血管内B细胞都可能负责这种观察。还发现B细胞调节心肌常驻巨噬细胞的表型⁸。

一些研究表明，B细胞在心肌适应损伤的背景下起着重要作用⁸，^9，10，¹¹，^12，13。B细胞在受伤的心脏中短暂积累，可能是通过CXCL13-CXCR5依赖机制^11，13。从那里，B细胞通过几种机制促进不良心脏重塑，包括细胞因子介导的单核细胞募集^9，12。此外，B细胞可以产生针对心脏蛋白的抗体，这些抗体可以通过几种机制促进心脏损伤的扩展和不良心脏重塑¹⁴，15，¹⁶，^17，18，¹⁹，20，21，^22，23，^24，25.B细胞还可以通过分泌IL-10对受伤的心脏发挥保护作用¹⁰。

随着研究B细胞在幼稚和受伤心脏中的作用的小组数量的增加，定义共享协议以正确量化和评估心肌B细胞变得越来越重要，从而避免已经开始出现在文献中的不一致。事实上，据报道，B细胞都是啮齿^{动物心脏中}最常见的免疫细胞之一7，并且其患病率明显低于骨髓细胞26，^27，或者相当罕见²⁸。同样，有几组人描述急性缺血性心^肌损伤后心肌B细胞数量增加7、^9、13，但有一组报告受损心肌B细胞数量没有变化²⁹。对心脏免疫细胞的研究很少给出灌注条件的细节，对消化条件也没有达成共识。由于在啮齿动物心脏中，很大一部分B细胞在血管内，并且从心肌中提取免疫细胞高度依赖于所使用的消化方法，因此文献中报道的差异可能是器官灌注和组织消化差异的结果。

这里介绍的是一种基于流式细胞术的鼠心肌B细胞定量的详细方法，该方法通过优化灌注和消化条件来最大限度地提高B细胞回收率，并允许区分血管内与血管外心肌^B细胞6。该协议是对区分血管内和间质免疫细胞的其他类似方案的改编和优化²⁸，^30，31。

在该协议中，我们将心肌灌注标准化，以消除漂浮在血管内空间中的B细胞，而无需去除粘附在微血管内皮上的生物学相关B细胞。此外，基于先前描述使用静脉注射抗体来区分血管内和间质免疫细胞^的方案32，并利用B细胞表达表面标志物B220³³的事实，我们演示了如何通过在动物处死和心脏灌注前立即血管内注射B220特异性抗体来区分血管内和血管外心肌B细胞。该协议与任何有兴趣包括幼稚和受伤心脏中心肌B细胞分析的科学家的研究相关。该协议的广泛实施将减少研究小组之间的不一致，将允许分析血管内和血管外心肌B细胞库的变化，从而促进心脏免疫学领域发现的进步。

总之，该协议代表了一种优化的工作流程，可通过流式细胞术量化和分析心肌B细胞，同时区分位于血管外空间和血管内间隙的细胞。

研究方案

本手稿中描述的所有实验均在约翰霍普金斯大学医学院IACUC的批准下进行。

1. 准备工作

1. 准备FACS缓冲液，如 表1中所述。
2. 确保有足够的CO₂ 对动物实施安乐死。
3. 准备解剖空间（放置工作台垫并将胶带和解剖工具放在附近）。
4. 标记15 mL试管，在每个试管中放入3 mL含钙和镁的HBSS（参见材料表）并将它们放在冰上（每个心脏一个管，一个额外的用于参考组/流式细胞术对照）。此外，用HBSS填充小（35毫米）培养皿。
5. 打开温控摇床，将其设置为37°C，并在4°C的温度下预冷离心机。
6. 准备注射泵并将流速设置为 3 mL/min。用HBSS填充20 mL注射器，用缓冲液灌注管路，并去除任何气泡。

2.血管内B细胞染色（体内）

1. 称量C57BL / 6J品系的12周龄雄性小鼠。用 100 μL B220 抗体稀释液（PBS 中的 1:10）加载 3/10 cc 胰岛素注射器。用铝箔覆盖注射器以防止光线照射。
2. 麻醉一只小鼠。
   1. 腹膜内注射2%2，2，2-三溴乙醇，剂量为400mg / kg，等待10-20分钟。
      注意:监测鼠标的呼吸和运动。一旦鼠标停止移动，通过捏住脚趾来刺激疼痛;没有戒断反射表明充分麻醉。
   2. 如果在20分钟内没有达到足够的麻醉，则可以给予100mg / kg的额外剂量的麻醉剂，并且应每5分钟评估一次小鼠动力学，戒断反射和呼吸。
3. 将鼠标放在实验室工作台上，放在向一侧倾斜的长凳垫上，轻轻拉下背部的皮肤，然后将身体轻轻按压在工作台上，使眼睛突出。
4. 通过眶后注射注射步骤2.1中稀释的B220抗体。
   1. 将注射器从小鼠头部的矢状面45°引入眼睛。慢慢注入溶液。如果感觉到阻力，请取出注射器并再次进入。等待2分钟。
      注意:延长孵育时间会危及区分血管内与血管外 B 细胞的能力，因为它会让注射的抗体有时间扩散到脉管系统外。
5. 按照IACUC规定对小鼠实施安乐死。
   1. 以 0.5 L/min 的速率打开流向安乐死室的 CO₂ 流量，或根据腔室大小推荐的流速。
   2. 将鼠标放在腔室中建议的时间，确保它不再呼吸。将其移除并进行颈椎脱位作为安乐死的次要方法。
   3. 一旦小鼠被安乐死，立即进行器官摘取和灌注。

3. 心脏收集

1. 胸部开口。
   1. 在上腹部用镊子握住小鼠的皮肤。用剪刀在皮肤上开一个2毫米的开口，用镊子剥开皮肤，露出胸部和腹部的筋膜层，一个有光泽的半透明层。在上腹部通过筋膜和腹膜切开腹壁并露出剑突。使用止血钳夹住剑突。
   2. 用剪刀在每侧锁骨中线水平处垂直切开胸壁，抬起前胸壁以露出纵隔内容物，使用止血钳作为重物来保持开口。
2. 心脏灌注和提取。
   1. 使用镊子去除心脏周围的任何脂肪或胸腺组织。
   2. 使用镊子从后面牢固地握住主动脉。将注射器针头（25G）引入心脏顶点。以 3 mL/min 的速率灌注 3 mL HBSS。
      注意:监测灌注。肝脏应充盈，冠状血管中的血液应完全清除。建议使用校准为 1 mL/min 的注射泵以保持稳定的流量。
   3. 用剪刀剪主动脉并取出心脏。用HBSS清洗培养皿中的心脏以去除任何残留的血液。使用剪刀和镊子去除脂肪，结缔组织和胸腺，并干燥心脏。称量孤立的心脏并注意以毫克为单位的重量。用刀片在室温下将心脏切成小块（1-2毫米）。
      注意:成年小鼠心脏的重量可能在0.090-0.210毫克之间。
   4. 测量心脏组织的质量，并将 60 mg 要消化的碎心脏放入含有 3 mL HBSS 的 15 mL 管中。保留剩余的心脏组织并放入标有"参考对照组织"的管中;这将用于活死信号和自发荧光的补偿控制。

4. 心脏消化和细胞染色

1. 向含有碎组织的每个管中加入酶（见 表1）。向管中加入 0.5 μL/mg 的 DNase 1（60 mg 心脏组织为 300 单位）、0.5 μL/mg 胶原酶 II（60 mg 心脏组织为 625 单位）和 0.2 μL/mg 透明质酸酶（60 mg 心脏组织为 50 单位）。
2. 将消化反应以300rpm的速度放入摇床中30分钟。将振动架调整到倾斜度约 25°。
3. 向每个15mL反应管中加入7mL HBSS，并在4°C下以250 x g 离心5分钟，加速和破碎设置为中等或缓慢。倒出上清液并将每个沉淀重悬于 5 mL ACK 裂解缓冲液中以去除红细胞。在室温下在ACK裂解缓冲液中孵育5分钟。
4. 向每个管中加入 10 mL PBS，混合，然后用 40 μm 过滤器过滤到 50 mL 管中。确保所有碎屑都在过滤室内。用注射器柱塞粉碎过滤器上的任何碎屑，直到它完全悬浮在过滤室内。
5. 通过过滤器添加PBS，直到体积达到每颗心脏25毫升;这将允许悬浮的细胞通过过滤器。向参比对照组织管中额外添加 25 mL PBS，并将体积分成不同的管（每个 25 mL）。将其中一个管标记为"未染色"，将另一个标记为"活死"。在4°C下以250× g 离心5分钟。
   注意:此时，准备活死污渍的稀释液（稀释:1x PBS中的1:500）。
6. 倒出上清液，将沉淀重悬于未染色管中的 100 μL PBS 中，其他每个沉淀重悬于 100 μL 活死染色稀释液中。在黑暗中在冰上孵育30分钟，用铝箔覆盖冰桶。
7. 向每个样品中加入 500 μL FACS 缓冲液，并通过 40 μm 过滤器将其转移到标记的 FACS 管中。在4°C下以250× g 离心FACS管5分钟。 弃去上清液。将沉淀重悬于 500 μL FACS 缓冲液中。
8. 向每个试管中加入 50 μL Fc 封闭溶液（参见 表 1），未染色和活死管除外。混合并孵育5分钟。
9. 向每个试管中加入 50 μL 抗体混合物溶液（参见 表 1），未染色和活死管除外，并在黑暗中孵育 30 分钟，用铝箔覆盖冰桶。
10. 向每个试管中加入2mL FACS缓冲液，并在4°C下以250× g 离心5分钟。 除去上清液并重悬于300-500μLFACS缓冲液中。

5. 流式细胞术

1. 设置仪器控制设置。
   注意:在该协议中，使用4激光Cytek Aurora流式细胞仪分析样品。另一种合适的流式细胞仪可用于检测感兴趣的标志物。
   1. 打开仪器控制软件（参见 材料表）。在窗口顶部，选择" 获取 "选项卡，然后单击" 新建 +"。将显示一个名为 "创建新实验" 的窗口。
   2. 在 "库"部分的" 要筛选的类型"字段中，键入 PE、PerCP-Cy5.5、BV421、Alexa Fluor 700 和 Zombie Aqua，在键入每个内容后单击 "添加 "。荧光基团名称应在右侧看到。然后单击 下一页 进入 组 标签。
   3. 在 组 选项卡中，单击带管子的符号以添加用于分析的心脏。
   4. 单击" + 引用 "组，将显示一个窗口。在荧光标记列中选择 僵尸水族，在控制类型列中选择 单元格，然后单击 保存。
   5. 点击 下一页 > 标记 标签;将显示一个包含荧光基团名称的表格。在每个荧光基团列的第一行中键入相应的细胞标记物， 然后输入:用于PerCP-Cy5.5的CD45;CD19 代表 BV421;用于Alexa Fluor 700的CD11b;用于PE的B220;和僵尸水的活死人。
   6. 单击" 下一步 "两次以转到 "获取 "选项卡。在实验组的 要记录的事件 中键入 10，000，000，在参考组行的同一字段中键入 200，000。单击 保存并打开。其他设置应保持默认值， 停止时间 为 10，000 ，停止音量 为 3，000。
   7. 在左下角单击 仪器控制。将 电压 设置为 FSC-50、SSC-175、SSC-B-175。然后，选择 采集控件。对于 流量 选项，从下拉菜单中选择 高 。
2. 使用细胞仪采集参比样品并在软件中解混。
   1. 涡旋未染色的心脏管并将其牢固地放置在样品进样口（SIP）上。确保绿色指示箭头指向正确的样品，然后单击细胞仪软件采集控制面板中的"开始"并等待记录事件。对活死染色的心脏组织做同样的事情。
   2. 选择 "取消混合 "菜单并设置以下控件:
      1. 选中库中列中 PE、PerCP-Cy5.5、BV421 和 Alexa Fluor 700 的复选框。确保在同一列中取消选中僵尸水。在底部，选中选项 自发荧光作为荧光标签.
      2. 单击 下一步 进入识别 阳性/负总体 选项卡。在此选项卡中，将显示 FSC-A 与 SSC-B-A 的图。单击并拖动多边形的点，以在 FSC-A 轴上选择 1.0 M 到 4.0 M 之间的区域，在 SSC-B-A 轴上选择 0.2 M 到 3.0 M 之间的区域。
      3. 在右侧的下一个图中，V5-A 将显示在 X 轴上。移动门以选择最右侧的一半峰值为正，将图左侧的区域选为负。在标题为参考组 - 未染色的图中，选择类似范围内的总体。为此，必须设置未染色的无正阴性。
3. 获取实验样品。
   1. 对于每个包含单个小鼠样品的试管，涡旋试管并将其牢固地放置在SIP上。确保绿色指示箭头指向正确的样品，然后单击细胞仪软件采集控制面板中的"开始"，并等待记录事件。
4. 门控策略。
   1. 选择 "默认未混合工作表 "选项卡。使用顶部的 点图工具 创建 FSC-A 与 SSC-A 图。使用 多边形选择工具在 FSC-A 轴上选择高于 0.4 M 的事件，在 SSC-A 轴上选择高于 0.8 M 的事件。双击此选择，将显示一个新图。
   2. 从新创建的绘图中，右键单击 X 轴标签 并选择 AF-A;右键单击 Y 轴标签 ，然后选择 活死染色。单击顶部的 矩形选择工具 ，然后选择活死轴上低于 10^{5 的所有} 事件，这些事件对应于较低的活 死信号。双击此选择，将显示一个新图。
   3. 在新图中，右键单击以选择 PerCP-Cy5.5-A 作为 X 轴， SSC-A 作为 Y 轴。使用 矩形选择工具，在 PerCP-Cy5.5-A 轴上选择与 CD45 阳性细胞对应的高于 10^{4 的事件} 。双击选择，将显示一个新图。
   4. 在新图上，右键单击以选择 FSC-A 作为 X 轴， FSC-H 作为 Y 轴。使用 面选择工具选择遵循 FSC-A 值和 SSC-A 值相同的趋势的事件;这样，细胞双联体将被移除，选择中的群体将被称为CD45 +群体。双击选择以显示包含 CD45+ 群体的新图。
   5. 从 CD45+ 群体图中，右键单击以在 X 轴上选择 BV421 ，在 Y 轴上选择 SSC-A。使用 多边形选择工具，选择 BV421 轴上右侧的人口。这是B细胞群。在此群体中双击两次以创建两个包含 B 细胞群体的新图。
      1. 右键单击以设置第一个 B 单元图，其中 PE-A 在 X 轴上， BV421-A 在 Y 轴上。右侧的群体对应于血管内 B 细胞，左侧的群体代表间质 B 细胞。使用 面选择工具 对两者进行选择。
      2. 右键单击以设置第二个B细胞图，X轴上为 Alexa Fluor 700-A ，Y轴上为 SSC-A 。左侧的群体对应于CD11b-细胞，右侧的事件（如果有的话）对应于CD11b +细胞。
      3. 右键单击每个选择，然后单击"门属性"。单击计数和父级百分比以显示大小和百分比。记录事件数和百分比以进行进一步的数据分析。

结果

采集完成并收集所有事件后，应根据标准流式细胞术实践分析数据。分析的重点将根据每个实验的个别目标而有所不同。在这种情况下，进行血管内和血管外B细胞的定量，并将其表示为每毫克组织的细胞数。

使用光谱细胞仪时，建议从初始设门开始分析，以去除大小不在免疫细胞对应范围内的碎片，然后去除活死染色+信号。这允许检测对应于白细胞的CD45阳性细胞的清洁群?...

讨论

越来越多的证据表明，B细胞在心肌生理学和心肌重塑/适应损伤的背景下起着重要作用⁷，⁸，⁹，¹⁰，^11，12，^13，36。流式细胞术是研究任何组织中免疫细胞群的绝佳工具，几乎是任何专注于心脏中B?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody	101222	BioLegend	100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	114-055-101	Quality Biological	0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips	11213810	USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips	11267810	USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430052	Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol	T48402	Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips	11208810	USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT953	ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style	352054	Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430290	Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	118-156-101	Quality Biological	Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63	5810759005	Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62	22638289	Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62	22638246	Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - Mouse	RWD-AICMV-100	Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody	115537	BioLegend	50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile	T9009	Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Collagenase 2	LS004176	Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer		Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I - 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight	13018-14	Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate	4033-CS150	McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	103208	BioLegend	200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody	103132	BioLegend	100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene	FB0875711YZ	Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets	Rotor A-4-62	Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long	CG-730-003	Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Syringe pump	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500	9371W13	Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119835	Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips	89259-946	Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"	82027-578	Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I	12620-946	Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	423102	BioLegend