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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous rapportons ici un protocole pour la quantification et la différenciation des lymphocytes B myocardiques en fonction de leur emplacement dans l’espace intravasculaire ou endothélial en utilisant la cytométrie de flux.

Résumé

Un nombre croissant de preuves montre que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et de l’adaptation myocardique aux blessures. Cependant, la littérature rapporte des données contrastées sur la prévalence des cellules B myocardiques. Il a été rapporté que les cellules B étaient à la fois parmi les cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs ou qu’elles étaient présentes, mais à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes, ou qu’elles étaient assez rares. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de cellules B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de cellules B du myocarde lésé. La mise en œuvre d’une méthode partagée et reproductible pour évaluer la prévalence des lymphocytes B myocardiques est essentielle pour harmoniser les observations des différents groupes de recherche et ainsi favoriser l’avancement de l’étude des interactions myocardiques des lymphocytes B. D’après notre expérience, les observations apparemment contrastées rapportées dans la littérature proviennent probablement du fait que les cellules B myocardiques murines sont principalement intravasculaires et connectées à l’endothélium microvasculaire. Par conséquent, le nombre de cellules B récupérées dans un cœur murin est extrêmement sensible aux conditions de perfusion utilisées pour nettoyer l’organe et à la méthode de digestion utilisée. Nous rapportons ici un protocole optimisé qui tient compte de ces deux variables critiques d’une manière spécifique. Ce protocole permet une analyse reproductible basée sur la cytométrie en flux du nombre de cellules B myocardiques murines et permet aux chercheurs de distinguer les cellules B myocardiques extravasculaires des cellules B intravasculaires.

Introduction

Les lymphocytes B sont des cellules immunitaires hautement spécialisées qui jouent un rôle important dans les réponses immunitaires adaptatives et innées1. Il existe deux populations principales de cellules B : une plus petite population de cellules B1 qui sont principalement produites au cours de la vie embryonnaire, et une population prépondérante de cellules B2 qui sont produites à l’âge adulte dans la moelle osseuse1. Après avoir mûri dans la moelle osseuse, les cellules B migrent vers les organes lymphoïdes primaires et secondaires. De là, ils recirculent continuellement entre les organes lymphoïdes voyageant à travers les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques2. Les cellules B expriment des anticorps spécifiques à leur surface, qui fonctionnent comme des récepteurs. Lorsque les cellules B rencontrent un antigène qui se lie à leur récepteur, un signal d’activation peut être déclenché. Les lymphocytes B activés migrent vers le tissu où l’antigène a été trouvé ou retournent dans la moelle osseuse où ils peuvent devenir des plasmocytes producteurs d’anticorps 3,4.

Récemment, il a été reconnu que le cœur abrite une population importante de cellules B. Des études chez les rongeurs ont montré que les lymphocytes B colonisent le cœur au début du développement embryonnaire5, et que les lymphocytes B associés au myocarde sont pour la plupart intravasculaires, des cellules B2 naïves adhérant à l’endothélium6,7, avec un faible pourcentagede cellules B17. Il existe encore de nombreuses zones d’incertitude, mais les données disponibles indiquent que les cellules B jouent un rôle important à la fois dans le cœur naïf et dans le contexte de l’adaptation myocardique aux blessures.

Des études sur le cœur murin naïf ont montré qu’au départ, les cellules B myocardiques sont principalement situées dans l’espace intravasculaire, adhèrent à l’endothélium (>95% des cellules B cardiaques murines se sont avérées être situées dans l’espace intravasculaire). On a constaté que ces cellules B avaient des schémas d’expression génique différents de ceux des cellules B circulantes isolées du sang périphérique. L’analyse des cœurs naïfs d’animaux déficients en lymphocytes B et de témoins syngéniques a révélé que les animaux dépourvus de lymphocytes B avaient des cœurs plus petits et une fraction d’éjection6 plus élevée. Toutes ces preuves suggèrent que les cellules B pourraient moduler la croissance myocardique et / ou la fonction myocardique, et que non seulement les cellules B interstitielles mais aussi intravasculaires pourraient être responsables de ces observations. Les cellules B ont également été trouvées pour moduler le phénotype des macrophages résidents du myocarde8.

Plusieurs études ont montré que les lymphocytes B jouent un rôle important dans le contexte de l’adaptation myocardique aux lésions 8,9,10,11,12,13. Les lymphocytes B s’accumulent transitoirement dans le cœur blessé, probablement par un mécanisme dépendant de CXCL13-CXCR511,13. À partir de là, les cellules B favorisent le remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes, dont le recrutement demonocytes médiés par les cytokines 9,12. En outre, les cellules B peuvent produire des anticorps contre les protéines cardiaques qui peuvent favoriser l’extension des lésions cardiaques et du remodelage cardiaque indésirable par plusieurs mécanismes 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Les cellules B peuvent également exercer des effets protecteurs sur le cœur blessé par la sécrétion d’IL-1010.

Alors que le nombre de groupes étudiant le rôle des cellules B dans le cœur naïf et blessé augmente, il devient de plus en plus important de définir des protocoles partagés pour quantifier et évaluer correctement les cellules B myocardiques et ainsi éviter les incohérences qui ont déjà commencé à apparaître dans la littérature. Jusqu’à présent, les cellules B ont en fait été signalées comme étant l’une des cellules immunitaires les plus répandues dans le cœur des rongeurs7 et présentes à une prévalence nettement inférieure à celle des cellules myéloïdes26,27, ou assez rares 28. De même, plusieurs groupes ont décrit que le nombre de lymphocytes B myocardiques augmente après une lésion myocardique ischémique aiguë 7,9,13, mais un groupe n’a signalé aucun changement dans le nombre de lymphocytes B du myocarde29 lésé. Les études sur les cellules immunitaires cardiaques donnent rarement des détails sur les conditions de perfusion et il n’y a pas de consensus sur les conditions de digestion. Étant donné que dans le cœur de rongeur, une grande proportion de cellules B sont intravasculaires et que l’extraction des cellules immunitaires du myocarde dépend fortement de la méthode de digestion utilisée, les différences rapportées dans la littérature pourraient être le résultat de différences dans la perfusion d’organes et la digestion tissulaire.

Présenté ici est une méthode détaillée pour la quantification basée sur la cytométrie de flux des cellules B myocardiques murines qui maximise le rendement de la récupération des cellules B en optimisant les conditions de perfusion et de digestion et permet la discrimination des cellules B myocardiques intravasculaires vs extravasculaires6. Ce protocole est une adaptation et une optimisation d’autres protocoles similaires qui distinguent les cellules immunitaires intravasculaires et interstitielles 28,30,31.

Dans ce protocole, nous normalisons la perfusion myocardique pour éliminer les cellules B flottant dans l’espace intravasculaire sans éliminer les cellules B biologiquement pertinentes adhérant à l’endothélium microvasculaire. De plus, en nous appuyant sur des protocoles antérieurs qui ont décrit l’utilisation de l’injection intraveineuse d’anticorps pour distinguer les cellules immunitaires intravasculaires des cellules immunitaires interstitielles32, et en tirant parti du fait que les cellules B expriment le marqueur de surface B22033, nous démontrons comment distinguer les cellules B myocardiques intravasculaires des cellules B extravasculaires par injection intravasculaire d’un anticorps spécifique B220 immédiatement avant le sacrifice animal et la perfusion cardiaque. Ce protocole est pertinent pour la recherche de tout scientifique intéressé à inclure l’analyse des cellules B myocardiques dans le cœur naïf et blessé. La mise en œuvre généralisée de ce protocole réduira les incohérences entre les groupes de recherche, permettra l’analyse des changements dans les pools de lymphocytes B myocardiques intravasculaires et extravasculaires, et renforcera ainsi l’avancement des découvertes dans le domaine de l’immunologie cardiaque.

En résumé, le protocole représente un flux de travail optimisé pour quantifier et analyser les cellules B myocardiques via la cytométrie en flux, tout en distinguant les cellules situées dans l’espace extravasculaire et l’espace intravasculaire.

Protocole

Toutes les expériences décrites dans ce manuscrit ont été réalisées avec l’approbation de l’IACUC à la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins.

1. Préparatifs

  1. Préparer le tampon FACS, tel que décrit dans le tableau 1.
  2. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de CO2 pour euthanasier les animaux.
  3. Préparez l’espace de dissection (placez le paillasse et placez le ruban adhésif et les outils de dissection à proximité).
  4. Étiqueter les tubes de 15 mL, mettre 3 mL de HBSS avec du calcium et du magnésium dans chaque tube (voir le tableau des matières) et les placer sur de la glace (un tube par cœur et un tube supplémentaire pour le groupe de référence/témoins de cytométrie en flux). Remplissez également les petites boîtes de Petri (35 mm) avec HBSS.
  5. Allumez l’agitateur à température contrôlée, réglez-le à 37 °C et prérefroidissez la centrifugeuse à une température de 4 °C.
  6. Préparez la pompe à seringue et réglez le débit à 3 mL/min. Remplissez une seringue de 20 ml avec HBSS, amorcez la ligne du tube avec un tampon et enlevez les bulles.

2. Coloration intravasculaire des lymphocytes B (in vivo)

  1. Pesez une souris mâle de 12 semaines de la souche C57BL/6J. Charger une seringue à insuline 3/10 cc avec 100 μL de dilution de l’anticorps B220 (1:10, dans PBS). Couvrir la seringue avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
  2. Anesthésiez une souris.
    1. Appliquer une injection intrapéritonéale de 2% de 2,2,2-tribromoéthanol avec une dose de 400 mg / kg et attendre 10-20 min.
      REMARQUE: Surveillez la respiration et les mouvements de la souris. Une fois que la souris cesse de bouger, stimulez la douleur en pinçant l’orteil; L’absence de réflexe de retrait indique une anesthésie adéquate.
    2. Si une anesthésie adéquate n’est pas obtenue au cours des 20 minutes, une dose supplémentaire d’anesthésique à 100 mg / kg peut être administrée, et une évaluation de la cinétique de la souris, du réflexe de sevrage et de la respiration doit être effectuée toutes les 5 minutes.
  3. Placez la souris sur le banc de laboratoire sur un banc incliné d’un côté, tirez doucement vers le bas la peau du dos et appuyez légèrement le corps contre le banc pour faire saillir l’œil.
  4. Injecter l’anticorps B220 dilué de l’étape 2.1 par injection rétroorbitale.
    1. Introduisez la seringue dans l’œil à 45° du plan sagittal de la tête de la souris. Injectez lentement la solution. Si une résistance est ressentie, retirez la seringue et entrez à nouveau. Attendez 2 min.
      REMARQUE: Un temps d’incubation prolongé compromettrait la capacité de discriminer les cellules B intravasculaires et extravasculaires, car cela donnerait le temps à l’anticorps injecté de diffuser à l’extérieur du système vasculaire.
  5. Euthanasier la souris conformément aux règlements de l’IACUC.
    1. Ouvrez le débit de CO2 dans la chambre d’euthanasie à un débit de 0,5 L/min, ou le débit recommandé en fonction de la taille de votre chambre.
    2. Placez la souris dans la chambre pendant le temps recommandé, en vous assurant qu’elle ne respire plus. Retirez-le et effectuez une luxation cervicale comme méthode secondaire d’euthanasie.
    3. Une fois que la souris est euthanasiée, procédez rapidement au prélèvement d’organes et à la perfusion.

3. Collecte du cœur

  1. Ouverture de la poitrine.
    1. Tenez la peau de la souris avec une pince dans la région épigastrique. Faites une ouverture de 2 mm dans la peau à l’aide de ciseaux et utilisez la pince pour décoller la peau afin de révéler la couche de fascia, une couche translucide brillante, de la poitrine et de l’abdomen. Couper à l’épigastre à travers le fascia et le péritoine pour ouvrir la paroi abdominale et révéler le processus xiphoïde. Serrez le processus xiphoïde à l’aide d’une pince hémostatique.
    2. Avec les ciseaux, faites une coupe verticale à travers la paroi thoracique au niveau de la ligne mi-claviculaire de chaque côté et soulevez la paroi thoracique antérieure pour révéler le contenu du médiastin, en utilisant des pinces hémostatiques comme poids pour maintenir l’ouverture.
  2. Perfusion et extraction cardiaques.
    1. À l’aide d’une pince, enlevez tout tissu adipeux ou thymique entourant le cœur.
    2. Tenez fermement l’aorte par derrière à l’aide d’une pince. Introduire l’aiguille de la seringue (25 G) dans l’apex du cœur. Perfuse avec 3 mL de HBSS à un débit de 3 mL/min.
      REMARQUE: Surveillez la perfusion. Le foie devrait se remplir et le sang dans les vaisseaux coronaires devrait être entièrement enlevé. L’utilisation d’une pompe à seringue calibrée à 1 mL / minute est recommandée pour maintenir un débit constant.
    3. Coupez l’aorte à l’aide de ciseaux et sortez le cœur. Lavez le cœur dans la boîte de Petri avec HBSS pour éliminer tout sang restant. À l’aide de ciseaux et de pinces, retirez la graisse, le tissu conjonctif et le thymus, et séchez le cœur. Pesez le cœur isolé et notez le poids en milligrammes. Hacher le cœur à température ambiante en petits morceaux (1-2 mm) avec une lame.
      REMARQUE: Les cœurs de souris adultes peuvent peser entre 0,090 et 0,210 mg.
    4. Mesurer la masse de tissu cardiaque et placer 60 mg du cœur émincé à digérer dans un tube de 15 mL avec 3 mL de HBSS. Conserver le tissu cardiaque restant et le placer dans un tube étiqueté « Tissu témoin de référence »; Cela sera utilisé pour le contrôle de compensation du signal mort-vivant et de l’autofluorescence.

4. Digestion cardiaque et coloration cellulaire

  1. Ajouter des enzymes à chaque tube contenant du tissu haché (voir le tableau 1). Ajouter 0,5 μL / mg de DNase 1 (300 unités pour 60 mg de tissu cardiaque), 0,5 μL / mg de collagénase II (625 unités pour 60 mg de tissu cardiaque) et 0,2 μL / mg de hyaluronidase (50 unités pour 60 mg de tissu cardiaque) dans le tube.
  2. Placer la réaction de digestion dans l’agitateur pendant 30 min à 300 tr/min. Ajustez le rack du vibreur à environ 25° d’inclinaison.
  3. Ajouter 7 mL de HBSS à chacun des tubes de réaction de 15 mL et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C avec accélération et rupture réglées sur modérée ou lente. Décanter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille dans 5 mL de tampon de lyse ACK pour éliminer les globules rouges. Incuber dans le tampon de lyse ACK pendant 5 min à température ambiante.
  4. Ajouter 10 mL de PBS dans chaque tube, mélanger, puis filtrer dans un tube de 50 mL avec une crépine de 40 μm. Assurez-vous que tous les débris sont à l’intérieur de la chambre filtrante. Écrasez tous les débris sur le filtre avec un piston de seringue jusqu’à ce qu’il soit complètement suspendu dans la chambre filtrante.
  5. Ajouter le PBS à travers le filtre jusqu’à ce que le volume atteigne 25 mL par cœur; Cela permettra aux cellules suspendues de passer à travers le filtre. Ajouter 25 mL supplémentaires de PBS au tube de tissu témoin de référence et diviser le volume en différents tubes (25 mL chacun). Étiquetez l’un des tubes « Unstained » et l’autre comme « Live-dead ». Centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C.
    NOTE: À ce stade, préparer la dilution pour la coloration morte vivante (dilution: 1:500 dans 1x PBS).
  6. Décanter le surnageant, remettre en suspension la pastille dans le tube non coloré dans 100 μL de PBS et chacune des autres pastilles dans 100 μL de la dilution de la tache morte vivante. Incuber sur la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité, en recouvrant le seau à glace de papier d’aluminium.
  7. Ajouter 500 μL de tampon FACS à chaque échantillon et le transférer dans un tube FACS marqué à travers un filtre de 40 μm. Centrifuger les tubes FACS à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 500 μL de tampon FACS.
  8. Ajouter 50 μL de solution bloquante de Fc (voir tableau 1) dans chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et morts-vivants. Mélanger et incuber pendant 5 min.
  9. Ajouter 50 μL de solution de mélange d’anticorps (voir le tableau 1) dans chaque tube, à l’exception des tubes non colorés et morts-vivants, et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité, en recouvrant le seau à glace de papier d’aluminium.
  10. Ajouter 2 mL de tampon FACS dans chaque tube et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 300-500 μL de tampon FACS.

5. Cytométrie de flux

  1. Configurez les paramètres de contrôle des instruments.
    REMARQUE: Dans ce protocole, l’échantillon est analysé avec un cytomètre en flux Cytek Aurora à 4 lasers. Un autre cytomètre de flux approprié pourrait être utilisé pour détecter les marqueurs d’intérêt.
    1. Ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument (voir le tableau des matériaux). En haut de la fenêtre, sélectionnez l’onglet Acquisition et cliquez sur Nouveau +. Une fenêtre appelée Créer une nouvelle expérience s’affiche.
    2. Dans la section Bibliothèque, dans le champ Type à filtrer, tapez PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 et Zombie Aqua, cliquez sur Ajouter après avoir tapé chacun. Les noms fluorophores doivent être vus à droite. Cliquez ensuite sur Suivant pour passer à l’onglet Groupe .
    3. Dans l’onglet Groupe , cliquez sur le symbole avec un tube pour ajouter le cœur de l’analyse.
    4. Cliquez sur le groupe + Référence et une fenêtre s’affichera. Dans la colonne de balise fluorescente, sélectionnez Zombie Aqua, puis dans la colonne type de contrôle, sélectionnez Cellules, puis cliquez sur Enregistrer.
    5. Cliquez sur l’onglet Marqueurs > suivant ; Un tableau s’affichera avec les noms des fluorophores. Tapez le marqueur de cellule correspondant dans la première ligne de chaque colonne fluorophore et tapez Entrée: CD45 pour PerCP-Cy5.5; CD19 pour BV421; CD11b pour Alexa Fluor 700; B220 pour l’EP; et mort-vivant pour Zombie Aqua.
    6. Cliquez deux fois sur Suivant pour accéder à l’onglet Acquisition . Dans Events to Record du groupe d’expériences, tapez 10 000 000 et dans le même champ pour la ligne du groupe de référence, tapez 200 000. Cliquez sur Enregistrer et ouvrir. Les autres paramètres doivent rester définis par défaut, Temps d’arrêt à 10 000 et Arrêt du volume à 3 000.
    7. En bas à gauche, cliquez sur Contrôle de l’instrument. Réglez la tension sur FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Ensuite, sélectionnez le contrôle d’acquisition. Pour l’option Débit (Débit), sélectionnez High (Élevé) dans le menu déroulant.
  2. Acquérir des échantillons de référence à l’aide d’un cytomètre et les démélanger dans un logiciel.
    1. Vortex le tube cardiaque non coloré et placez-le solidement sur l’orifice d’injection de l’échantillon (SIP). Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon, puis cliquez sur Démarrer dans le panneau Contrôle d’acquisition du logiciel du cytomètre et attendez que les événements soient enregistrés. Faites de même pour le tissu cardiaque coloré vivant.
    2. Sélectionnez le menu Unmix et définissez les commandes suivantes :
      1. Cochez les cases PE, PerCP-Cy5.5, BV421 et Alexa Fluor 700 dans la colonne de la bibliothèque. Assurez-vous que Zombie Aqua n’est pas coché dans la même colonne. En bas, cochez l’option Autofluorescence en tant que balise fluorescente.
      2. Cliquez sur Suivant pour passer à l’onglet Identifier les populations positives/négatives . Dans cet onglet, un graphique de FSC-A vs SSC-B-A sera affiché. Cliquez et faites glisser les points du polygone pour sélectionner une zone comprise entre 1,0 M et 4,0 M sur l’axe FSC-A et entre 0,2 M et 3,0 M sur l’axe SSC-B-A.
      3. Dans le tracé suivant à droite, V5-A sera affiché sur l’axe X. Déplacez les portes pour sélectionner la moitié du pic à l’extrême droite comme positif et une région sur le côté gauche du graphique comme négatif. Dans le graphique intitulé Groupe de référence - Non coloré, sélectionnez une population dans une fourchette similaire. Pour cela, le non coloré n’a pas de positif-négatif doit être défini.
  3. Acquérir des échantillons expérimentaux.
    1. Pour chaque tube contenant un échantillon pour une souris individuelle, vortex le tube et placez-le solidement sur le SIP. Assurez-vous que la flèche verte de l’indicateur pointe vers le bon échantillon, puis cliquez sur Démarrer dans le panneau Contrôle d’acquisition du logiciel du cytomètre et attendez que les événements soient enregistrés.
  4. Stratégie de contrôle.
    1. Sélectionnez l’onglet Feuille de calcul non mélangée par défaut . Créez un tracé FSC-A par rapport à SSC-A à l’aide de l’outil Tracé par points situé en haut. Sélectionnez des événements supérieurs à 0,4 M sur l’axe FSC-A et supérieurs à 0,8 M sur l’axe SSC-A à l’aide de l’outil de sélection Polygone. Double-cliquez dans cette sélection et un nouveau tracé s’affichera.
    2. Dans le tracé nouvellement créé, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étiquette de l’axe X et sélectionnez AF-A ; cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’étiquette de l’axe Y et sélectionnez Coloration vivante. Cliquez sur l’outil de sélection du rectangle en haut et sélectionnez tous les événements inférieurs à 105 sur l’axe mort-vivant qui correspondent au signal vivant-mort inférieur. Double-cliquez dans cette sélection et un nouveau tracé s’affichera.
    3. Dans le nouveau tracé, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner PerCP-Cy5.5-A pour l’axe X et SSC-A pour l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection de rectangle, sélectionnez les événements supérieurs à 104 sur l’axe PerCP-Cy5.5-A qui correspondent aux cellules CD45 positives. Double-cliquez sur la sélection et un nouveau tracé s’affichera.
    4. Sur le nouveau tracé, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner FSC-A pour l’axe X et FSC-H pour l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection Polygone, sélectionnez les événements qui suivent une tendance sur laquelle la valeur FSC-A et la valeur SSC-A sont identiques ; avec cela, les doublets cellulaires seront retirés et la population de la sélection sera appelée population CD45+. Double-cliquez sur la sélection pour afficher une nouvelle parcelle avec la population CD45+.
    5. À partir du diagramme de la population CD45+, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner BV421 sur l’axe X par rapport à SSC-A sur l’axe Y. À l’aide de l’outil de sélection Polygone, sélectionnez la population à droite sur l’axe BV421 . Il s’agit de la population de cellules B. Double-cliquez deux fois dans cette population pour créer deux nouveaux graphiques avec la population de cellules B.
      1. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour configurer le premier tracé de cellules B avec PE-A sur l’axe X et BV421-A sur l’axe Y. La population de droite correspond aux cellules B intravasculaires, et la population de gauche représente les cellules B interstitielles. Utilisez l’outil de sélection Polygone pour effectuer une sélection des deux.
      2. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour configurer le deuxième tracé de cellules B avec Alexa Fluor 700-A sur l’axe X et SSC-A sur l’axe Y. La population de gauche correspond aux cellules CD11b- et les événements de droite (le cas échéant) correspondent aux cellules CD11b+.
      3. Cliquez avec le bouton droit sur chaque sélection, puis cliquez sur Propriétés de la porte. Cliquez sur Nombre et % Parent pour afficher les tailles et les pourcentages. Consigner le nombre d’événements et les pourcentages pour une analyse plus approfondie des données.

Résultats

Une fois l’acquisition terminée et tous les événements collectés, les données doivent être analysées conformément à la pratique standard de cytométrie en flux. L’objet de l’analyse variera en fonction de l’objectif individuel de chaque expérience. Dans ce cas, la quantification des cellules B intravasculaires et extravasculaires a été poursuivie, et elle a été exprimée en nombre de cellules par mg de tissu.

Lors de l’utilisation d’un cytomètre spectral, il est reco...

Discussion

Un nombre croissant de preuves indique que les cellules B jouent un rôle important dans le contexte de la physiologie myocardique et du remodelage/adaptation myocardique aux blessures 7,8,9,10,11,12,13,36. La cytométrie en flux est un excellent outil pour...

Déclarations de divulgation

Luigi Adamo est co-fondateur de i-Cordis, LLC, une société axée sur le développement de molécules immunomodulatrices pour le traitement de l’insuffisance cardiaque, avec un intérêt particulier pour les dérivés du médicament modulateur des cellules B pirfenidone. Les autres auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

Remerciements

Cette étude a été financée par les subventions NHLBI 5K08HLO145108-03 et 1R01HL160716-01 accordées à Luigi Adamo.

Le cytomètre en flux Aurora utilisé pour développer cette étude a été financé par la subvention NIH S10OD026859. Nous reconnaissons le soutien du JHU Ross Flow Cytometry Core.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody101222BioLegend100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, BlueQBIAP303Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1605-0000SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP114-055-101Quality Biological0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1615-5500SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips11213810USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips11267810USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430052Corning
1-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT951ECT Manufacturing
2,2,2-TribromoethanolT48402Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips11208810USA Scientific
3-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT953ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style352054Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430290Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer118-156-101Quality BiologicalOsmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-635810759005Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-6222638289Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-6222638246Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007UPC 109153Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - MouseRWD-AICMV-100Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL309626BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-PackCMD 2613Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody115537BioLegend50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterileT9009Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940 CD USPEAirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mLUX-34502-46Cole-Parmer
Collagenase 2LS004176Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barbY992611-AGAirGas USA
Cytek Aurora Flow CytometerCytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CPM-08-12AirGas USA
DNase I - 40,000 UD4527Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller4430000018Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E30100606Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge5810REppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettesEppendorf
FlowJo 10.8.1BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)Z740287Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076gibco1x
HyaluronidaseH3506Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight13018-14Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL302831BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940M1-940-PGAirGas USA
McKesson Underpads, Moderate4033-CS150McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable BalanceNV2201Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]10010023gibco1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody103208BioLegend200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody103132BioLegend100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile PolystyreneFB0875711YZFisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02M08-1AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck IlluminatorLED-6WAmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)305122BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)553141BD Becton, Dickinson and Company Biosciences0.5 mg/mL
R 4.1.1The R Foundation
Razor Blades9501250000Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inletY12244A320-AGAirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular bucketsRotor A-4-62Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister86.1254.001Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tapeL8394Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EAMTLL230-6005Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' LongCG-730-003Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mLZ683566Millipore Sigma
Syringe pump55-1199 (95-240)Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM105009371W13Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119835Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119827Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.T8913 (Millipore Sigma)Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2SI-0236Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips89259-946Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"82027-578Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I12620-946Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit423102BioLegend

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