유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

요약

여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.

초록

점점 더 많은 증거에 따르면 B- 림프구는 심근 생리학 및 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 그러나 문헌은 심근 B 세포의 유병률에 대한 대조적 인 데이터를보고합니다. B 세포는 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포 중 하나이거나 존재하는 것으로 보고되었지만 골수 세포보다 유병률이 현저히 낮거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상 후 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명했지만, 한 그룹은 손상된 심근의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심근 B 세포의 유병률을 평가하기 위한 공유되고 재현 가능한 방법의 구현은 다양한 연구 그룹의 관찰을 조화시켜 B 세포 심근 상호 작용 연구의 발전을 촉진하는 데 중요합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 문헌에보고 된 겉보기에 대조적 인 관찰은 쥐의 심근 B 세포가 대부분 혈관 내피에 연결되어 있고 미세 혈관 내피에 연결되어 있다는 사실에서 비롯된 것 같습니다. 따라서 쥐의 심장에서 회수 된 B 세포의 수는 장기를 청소하는 데 사용되는 관류 조건과 사용 된 소화 방법에 절묘하게 민감합니다. 여기에서는 이 두 가지 중요한 변수를 특정 방식으로 설명하는 최적화된 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 쥐 심근 B 세포 수에 대한 재현 가능한 유세포 분석 기반 분석을 강화하고 연구원이 혈관 외 심근 B 세포와 혈관 내 심근 B 세포를 구별 할 수 있도록합니다.

서문

B-림프구는 적응^{면역 반응과} 선천성 면역 반응 모두에서 중요한 역할을 하는 고도로 전문화된 면역 세포입니다1. B 세포의 두 가지 주요 집단이 있습니다 : 배아 생활 동안 주로 생성되는 B1 세포의 작은 집단과 골수¹에서 성인 생활에서 생성되는 B2 세포의 우세한 집단. 골수에서 성숙 한 후 B 세포는 1 차 및 2 차 림프 기관으로 이동합니다. 거기에서 그들은 혈관과 림프관을 통해 이동하는 림프 기관 사이에서 지속적으로 재순환합니다². B 세포는 수용체로 기능하는 표면에 특정 항체를 발현합니다. B 세포가 수용체에 결합하는 항원을 만나면 활성화 신호가 트리거 될 수 있습니다. 활성화된 B 세포는 항원이 발견된 조직으로 이동하거나 골수로 돌아가 항체 생성 형질 세포로 성숙할 수 있습니다 ^3,4.

최근에, 심장에는 상당한 수의 B 세포 집단이 있다는 것이 인식되고 있다. 설치류를 대상으로 한 연구에 따르면 B 세포는 배아 발달 초기에 심장에 식민지화되며⁵, 심근 관련 B ....

프로토콜

이 원고에 설명 된 모든 실험은 존스 홉킨스 의과 대학의 IACUC의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 준비

1. 표 1에 설명된 대로 FACS 버퍼를 준비합니다.
2. 동물을 안락사시키기에 충분한_CO2 가 있는지 확인하십시오.
3. 해부 공간을 준비하십시오 (벤치 패드를 놓고 테이프와 해부 도구를 근처에 두십시오).
4. 15mL 튜브에 라벨을 붙이고 각 튜브에 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 3mL를 넣고(재료 표 참조) 얼음 위에 놓습니다(심장당 튜브 1개, 참조 그룹/유세포분석 대조군의 경우 추가 튜브 1개). 또한 작은(35mm) 페트리 접시에 HBSS를 채웁니다.
5. 온도 제어 셰이커를 켜고 37 ° C로 설정 한 다음 4 ° C의 온도에서 원심 분리기를 사전 냉각합니다.
6. 주사기 펌프를 준비하고 유속을 3mL/분으로 설정합니다. 20mL 주사기에 HBSS를 채우고 튜브 라인을 버퍼로 프라이밍한 다음 기포를 제거합니다.

2. 혈관내 B세포 염색(생체 내)<....

결과

수집이 완료되고 모든 이벤트가 수집되면 표준 유세포분석 관행에 따라 데이터를 분석해야 합니다. 분석의 초점은 각 실험의 개별 목표에 따라 다릅니다. 이 경우 혈관내 및 혈관외 B세포의 정량화를 추구하였으며, 조직 mg당 세포수로 표시하였다.

스펙트럼 세포분석기를 사용하는 경우 초기 게이팅으로 분석을 시작하여 면역 세포에 해당하는 범위에 있지 않은 크기의 파편을.......

토론

점점 더 많은 증거에 따르면 B 세포는 심근 생리학 및 심근 리모델링 / 부상에 대한 적응 7,8,9,10,11,12,13,36의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 유세포 분석은 모든 조직의 면역 세포 집단을 연구하는.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody	101222	BioLegend	100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	114-055-101	Quality Biological	0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips	11213810	USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips	11267810	USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430052	Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol	T48402	Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips	11208810	USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT953	ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style	352054	Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430290	Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	118-156-101	Quality Biological	Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63	5810759005	Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62	22638289	Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62	22638246	Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - Mouse	RWD-AICMV-100	Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody	115537	BioLegend	50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile	T9009	Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Collagenase 2	LS004176	Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer		Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I - 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight	13018-14	Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate	4033-CS150	McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	103208	BioLegend	200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody	103132	BioLegend	100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene	FB0875711YZ	Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets	Rotor A-4-62	Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long	CG-730-003	Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Syringe pump	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500	9371W13	Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119835	Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips	89259-946	Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"	82027-578	Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I	12620-946	Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	423102	BioLegend