Quantificazione e analisi basate sulla citometria a flusso delle cellule B miocardiche

Riepilogo

Qui riportiamo un protocollo per la quantificazione e la differenziazione dei linfociti B miocardici in base alla loro posizione nello spazio intravascolare o endoteliale utilizzando la citometria a flusso.

Abstract

Un numero crescente di prove dimostra che i linfociti B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e dell'adattamento miocardico alle lesioni. Tuttavia, la letteratura riporta dati contrastanti sulla prevalenza delle cellule B del miocardio. È stato riportato che le cellule B sono tra le cellule immunitarie più diffuse nel cuore dei roditori o per essere presenti, ma con una prevalenza marcatamente inferiore rispetto alle cellule mieloidi, o per essere piuttosto rare. Allo stesso modo, diversi gruppi hanno descritto che il numero di cellule B miocardiche aumenta dopo il danno miocardico ischemico acuto, ma un gruppo non ha riportato cambiamenti nel numero di cellule B del miocardio danneggiato. L'implementazione di un metodo condiviso e riproducibile per valutare la prevalenza delle cellule B miocardiche è fondamentale per armonizzare le osservazioni di diversi gruppi di ricerca e quindi promuovere l'avanzamento dello studio delle interazioni miocardiche a cellule B. Sulla base della nostra esperienza, le osservazioni apparentemente contrastanti riportate in letteratura derivano probabilmente dal fatto che le cellule B miocardiche murine sono per lo più intravascolari e collegate all'endotelio microvascolare. Pertanto, il numero di cellule B recuperate da un cuore murino è squisitamente sensibile alle condizioni di perfusione utilizzate per pulire l'organo e al metodo di digestione utilizzato. Qui riportiamo un protocollo ottimizzato che tiene conto di queste due variabili critiche in modo specifico. Questo protocollo consente l'analisi riproducibile basata sulla citometria a flusso del numero di cellule B miocardiche murine e consente ai ricercatori di distinguere le cellule B miocardiche extravascolari da quelle intravascolari.

Introduzione

I linfociti B sono cellule immunitarie altamente specializzate che svolgono un ruolo importante nelle risposte immunitarie adattative e innate¹. Ci sono due popolazioni principali di cellule B: una popolazione più piccola di cellule B1 che sono per lo più prodotte durante la vita embrionale e una popolazione preponderante di cellule B2 che vengono prodotte nella vita adulta nel midollo osseo¹. Dopo la maturazione nel midollo osseo, le cellule B migrano verso gli organi linfoidi primari e secondari. Da lì ricircolano continuamente tra gli organi linfoidi che viaggiano attraverso i vasi sanguigni e i vasi linfatici

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti con l'approvazione della IACUC presso la Johns Hopkins University School of Medicine.

1. Preparativi

1. Preparare il buffer FACS, come descritto nella tabella 1.
2. Assicurati che ci sia abbastanza CO₂ per l'eutanasia degli animali.
3. Preparare lo spazio di dissezione (posizionare il cuscinetto da banco e posizionare il nastro e gli strumenti di dissezione nelle vicinanze).
4. Etichettare i tubi da 15 ml, mettere 3 ml di HBSS con calcio e magnesio in ogni provetta (vedere Tabella dei mat....

Risultati

Una volta completata l'acquisizione e raccolti tutti gli eventi, i dati devono essere analizzati secondo la pratica standard della citometria a flusso. Il focus dell'analisi varierà a seconda dell'obiettivo individuale di ciascun esperimento. In questo caso, è stata perseguita la quantificazione delle cellule B intravascolari ed extravascolari ed è stata espressa come numero di cellule per mg di tessuto.

Quando si utilizza un citometro spettrale, si consiglia di iniziare l'analisi con un ga.......

Discussione

Un numero crescente di evidenze indica che le cellule B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e del rimodellamento/adattamento miocardico alle lesioni 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometria a flusso è uno strumento eccellente p.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody	101222	BioLegend	100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	114-055-101	Quality Biological	0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips	11213810	USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips	11267810	USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430052	Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol	T48402	Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips	11208810	USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT953	ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style	352054	Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430290	Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	118-156-101	Quality Biological	Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63	5810759005	Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62	22638289	Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62	22638246	Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - Mouse	RWD-AICMV-100	Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody	115537	BioLegend	50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile	T9009	Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Collagenase 2	LS004176	Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer		Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I - 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight	13018-14	Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate	4033-CS150	McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	103208	BioLegend	200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody	103132	BioLegend	100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene	FB0875711YZ	Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets	Rotor A-4-62	Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long	CG-730-003	Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Syringe pump	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500	9371W13	Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119835	Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips	89259-946	Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"	82027-578	Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I	12620-946	Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	423102	BioLegend