JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы сообщаем протокол количественной оценки и дифференцировки В-лимфоцитов миокарда на основе их расположения во внутрисосудистом или эндотелиальном пространстве с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Растущее количество доказательств показывает, что В-лимфоциты играют важную роль в контексте физиологии миокарда и адаптации миокарда к травмам. Однако в литературе приводятся контрастные данные о распространенности В-клеток миокарда. Сообщалось, что В-клетки являются одними из наиболее распространенных иммунных клеток в сердце грызунов или присутствуют, но с заметно более низкой распространенностью, чем миелоидные клетки, или довольно редки. Аналогичным образом, несколько групп описали, что количество В-клеток миокарда увеличивается после острого ишемического повреждения миокарда, но одна группа не сообщила об изменениях в количестве В-клеток поврежденного миокарда. Реализация общего, воспроизводимого метода оценки распространенности В-клеток миокарда имеет решающее значение для гармонизации наблюдений различных исследовательских групп и, таким образом, способствует продвижению изучения взаимодействий миокарда В-клеток. Основываясь на нашем опыте, кажущиеся контрастными наблюдения, о которых сообщается в литературе, вероятно, связаны с тем фактом, что мышиные В-клетки миокарда в основном внутрисосудистые и связаны с микрососудистым эндотелием. Поэтому количество В-клеток, извлеченных из мышиного сердца, чрезвычайно чувствительно к условиям перфузии, используемым для очистки органа, и к используемому методу пищеварения. Здесь мы сообщаем об оптимизированном протоколе, который учитывает эти две критические переменные определенным образом. Этот протокол обеспечивает воспроизводимый, основанный на проточной цитометрии анализ количества мышиных В-клеток миокарда и позволяет исследователям различать внесосудистые и внутрисосудистые В-клетки миокарда.

Введение

В-лимфоциты являются узкоспециализированными иммунными клетками, которые играют важную роль как в адаптивных, так и во врожденных иммунных реакциях1. Существует две основные популяции В-клеток: меньшая популяция клеток В1, которые в основном вырабатываются во время эмбриональной жизни, и преобладающая популяция клеток В2, которые производятся во взрослой жизни в костном мозге1. После созревания в костном мозге В-клетки мигрируют в первичные и вторичные лимфоидные органы. Оттуда они непрерывно рециркулируют между лимфоидными органами, проходящими через кровеносные сосуды, и лимфатическими сосудами2. В-клетки экспрессируют специфические антитела на своей поверхности, которые функционируют как рецепторы. Когда В-клетки сталкиваются с антигеном, который связывается с их рецептором, может быть запущен активирующий сигнал. Активированные В-клетки либо мигрируют в ткань, где был обнаружен антиген, либо возвращаются в костный мозг, где они могут созревать в плазматические клетки, продуцирующие антитела 3,4.

В последнее время было признано, что сердце содержит значительную популяцию В-клеток. Исследования на грызунах показали, что В-клетки колонизируют сердце на ранних стадиях эмбрионального развития5, и что В-клетки, ассоциированные с миокардом, в основном являются внутрисосудистыми, наивными B2-клетками, прилипшими к эндотелию 6,7, с небольшим процентом клеток B17. Есть еще много областей неопределенности, но имеющиеся данные указывают на то, что В-клетки играют важную роль как в наивном сердце, так и в контексте адаптации миокарда к травме.

Исследования на наивного мышиного сердца показали, что на исходном уровне В-клетки миокарда в основном располагаются во внутрисосудистом пространстве, прилипают к эндотелию (>95% мышиных сердечных В-клеток оказались расположенными во внутрисосудистом пространстве). Было обнаружено, что эти В-клетки имеют паттерны экспрессии генов, отличные от паттернов циркулирующих В-клеток, выделенных из периферической крови. Анализ наивных сердец у животных с дефицитом В-клеток и сингенного контроля показал, что животные, лишенные В-клеток, имели меньшие сердца и более высокую фракциювыброса 6. Все эти данные свидетельствуют о том, что В-клетки могут модулировать рост миокарда и / или функцию миокарда, и что не только интерстициальные, но и внутрисосудистые В-клетки могут быть ответственны за такие наблюдения. Было также обнаружено, что В-клетки модулируют фенотип резидентных макрофагов миокарда8.

Несколько исследований показали, что В-клетки играют важную роль в контексте адаптации миокарда к травме 8,9,10,11,12,13. В-клетки временно накапливаются в поврежденном сердце, вероятно, через CXCL13-CXCR5 зависимый механизм 11,13. Оттуда В-клетки способствуют неблагоприятному ремоделированию сердца с помощью нескольких механизмов, которые включают цитокин-опосредованный моноцит, рекрутирующий 9,12. Кроме того, В-клетки могут вырабатывать антитела против сердечных белков, которые могут способствовать расширению сердечных повреждений и неблагоприятному ремоделированию сердца с помощью нескольких механизмов 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . В-клетки также могут оказывать защитное воздействие на поврежденное сердце через секрецию IL-1010.

По мере роста числа групп, изучающих роль В-клеток в наивном и поврежденном сердце, становится все более и более важным определить общие протоколы для правильной количественной оценки и оценки В-клеток миокарда и, таким образом, избежать несоответствий, которые уже начали появляться в литературе. До сих пор сообщалось, что В-клетки являются одними из наиболее распространенных иммунных клеток в сердце грызунов7 и присутствуют с заметно более низкой распространенностью, чем миелоидные клетки26,27 или довольно редко28. Аналогичным образом, несколько групп описали, что количество В-клеток миокарда увеличивается после острого ишемического повреждения миокардана 7,9,13, но одна группа сообщила об отсутствии изменений в количестве В-клеток поврежденного миокарда29. Исследования сердечных иммунных клеток редко дают подробную информацию об условиях перфузии, и нет единого мнения об условиях пищеварения. Поскольку в сердце грызунов большая часть В-клеток является внутрисосудистой, а извлечение иммунных клеток из миокарда сильно зависит от используемого метода пищеварения, различия, о которых сообщается в литературе, могут быть результатом различий в перфузии органов и переваривании тканей.

Здесь представлен подробный метод количественной оценки В-клеток мышиного миокарда на основе проточной цитометрии, который максимизирует выход восстановления В-клеток за счет оптимизации условий перфузии и пищеварения и позволяет различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки миокарда6. Этот протокол является адаптацией и оптимизацией других подобных протоколов, которые различают внутрисосудистые и интерстициальные иммунные клетки 28,30,31.

В этом протоколе мы стандартизируем перфузию миокарда для устранения В-клеток, плавающих во внутрисосудистом пространстве, без удаления биологически значимых В-клеток, прилипших к микрососудистому эндотелию. Более того, основываясь на предыдущих протоколах, которые описывали использование внутривенного введения антител для различения внутрисосудистых и интерстициальных иммунных клеток32, и используя тот факт, что В-клетки экспрессируют поверхностный маркер B22033, мы демонстрируем, как различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки миокарда посредством внутрисосудистой инъекции B220-специфического антитела непосредственно перед жертвоприношением животных и сердечной перфузией. Этот протокол актуален для исследований любого ученого, заинтересованного во включении анализа В-клеток миокарда в наивное и травмированное сердце. Широкое внедрение этого протокола уменьшит несоответствия между исследовательскими группами, позволит анализировать изменения во внутрисосудистых и внесосудистых пулах В-клеток миокарда и, таким образом, будет способствовать продвижению открытий в области иммунологии сердца.

Таким образом, протокол представляет собой оптимизированный рабочий процесс для количественной оценки и анализа В-клеток миокарда с помощью проточной цитометрии и в то же время различения клеток, расположенных во внесосудистом пространстве и внутрисосудистом пространстве.

протокол

Все эксперименты, описанные в этой рукописи, были выполнены с одобрения IACUC в Медицинской школе Университета Джона Хопкинса.

1. Препараты

  1. Подготовьте буфер FACS, как описано в таблице 1.
  2. Убедитесь, что есть достаточно CO2 для усыпления животных.
  3. Подготовьте пространство для рассечения (поместите коврик для скамейки и поместите ленту и инструменты для рассечения рядом).
  4. Маркируйте пробирки объемом 15 мл, поместите 3 мл HBSS с кальцием и магнием в каждую трубку (см. Таблицу материалов) и поместите их на лед (одна трубка на сердце и дополнительная для контрольной группы / проточной цитометрии). Кроме того, наполните небольшие (35 мм) чашки Петри HBSS.
  5. Включите шейкер с контролируемой температурой, установите его на 37 °C и предварительно охладите центрифугу при температуре 4 °C.
  6. Подготовьте шприцевой насос и установите расход на 3 мл/мин. Заполните шприц объемом 20 мл HBSS, загрунтуйте линию трубки буфером и удалите пузырьки.

2. Внутрисосудистое окрашивание В-клеток (in vivo)

  1. Взвесьте 12-недельного самца мыши штамма C57BL/6J. Нагрузите инсулиновый шприц объемом 3/10 куб. см 100 мкл разведения антител B220 (1:10, в PBS). Накройте шприц алюминиевой фольгой для защиты от света.
  2. Обезболить одну мышь.
    1. Применяют внутрибрюшинную инъекцию 2% 2,2,2-трибромэтанола в дозе 400 мг/кг и ждут 10-20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за дыханием и движением мыши. Как только мышь перестанет двигаться, стимулируйте боль, защемляя палец ноги; отсутствие рефлекса отмены указывает на адекватную анестезию.
    2. Если адекватная анестезия не достигается в течение 20 мин, можно вводить дополнительную дозу анестетика в 100 мг/кг, а также каждые 5 мин следует проводить оценку кинетики мыши, рефлекса отмены и дыхания.
  3. Положите мышь на лабораторную скамью на подставку, наклоненную в одну сторону, осторожно потяните вниз кожу спины и слегка прижмите тело к скамье, чтобы глаз выступал.
  4. Вводят разбавленное антитело B220 со стадии 2.1 путем ретроорбитальной инъекции.
    1. Введите шприц в глаз под углом 45° от сагиттальной плоскости головы мыши. Медленно вводят раствор. Если сопротивление ощущается, снимите шприц и войдите снова. Подождите 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное время инкубации поставит под угрозу способность различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки, поскольку это даст время введенному антителу диффундировать за пределы сосудистой системы.
  5. Усыплите мышь в соответствии с правилами IACUC.
    1. Откройте поток CO2 в камеру эвтаназии со скоростью 0,5 л/мин или рекомендуемой скоростью потока в зависимости от размера вашей камеры.
    2. Поместите мышь в камеру на рекомендуемое время, убедившись, что она больше не дышит. Удалить его и выполнить вывих шейки матки как вторичный метод эвтаназии.
    3. Как только мышь будет усыплена, быстро приступайте к извлечению органов и перфузии.

3. Коллекция сердца

  1. Открытие грудной клетки.
    1. Держите кожу мыши щипцами в эпигастральной области. Сделайте 2-миллиметровое отверстие в коже с помощью ножниц и используйте щипцы, чтобы очистить кожу, чтобы раскрыть слой фасций, блестящий полупрозрачный слой, груди и живота. Разрезать эпигастрий через фасцию и брюшину, чтобы открыть брюшную стенку и выявить мечевидный отросток. Зажмите мечевидный отросток с помощью гемостатических щипцов.
    2. Ножницами сделайте вертикальный разрез через стенку грудной клетки на уровне средней ключичной линии с каждой стороны и поднимите переднюю стенку грудной клетки, чтобы выявить содержание средостения, используя гемостатические щипцы в качестве веса для поддержания отверстия.
  2. Перфузия и экстракция сердца.
    1. Используя щипцы, удалите любой жир или ткань тимуса, окружающую сердце.
    2. Надежно удерживайте аорту сзади с помощью щипцов. Вводят шприцевую иглу (25 г) в верхушку сердца. Перфюсировать с 3 мл HBSS со скоростью 3 мл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за перфузией. Печень должна заполняться, а кровь в коронарных сосудах должна быть полностью удалена. Для поддержания устойчивого потока рекомендуется использовать шприцевой насос, откалиброванный до 1 мл/мин.
    3. Вырежьте аорту ножницами и выньте сердце. Вымойте сердце в чашке Петри с HBSS, чтобы удалить оставшуюся кровь. С помощью ножниц и щипцов удалите жир, соединительную ткань и тимус, высушите сердце. Взвесьте изолированное сердце и отметьте вес в миллиграммах. Измельчите сердце при комнатной температуре на мелкие кусочки (1-2 мм) лезвием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сердца взрослых мышей могут весить от 0,090 до 0,210 мг.
    4. Измерьте массу сердечной ткани и поместите 60 мг измельченного сердца для переваривания в пробирку объемом 15 мл с 3 мл HBSS. Сохранить оставшуюся ткань сердца и поместить в трубку с надписью «Эталонная контрольная ткань»; это будет использоваться для управления компенсацией для живого мертвого сигнала и автофлуоресценции.

4. Сердечное пищеварение и окрашивание клеток

  1. Добавьте ферменты в каждую пробирку, содержащую измельченную ткань (см. таблицу 1). Добавьте в трубку 0,5 мкл/мг ДНКазы 1 (300 единиц на 60 мг сердечной ткани), 0,5 мкл/мг коллагеназы II (625 единиц на 60 мг сердечной ткани) и 0,2 мкл/мг гиалуронидазы (50 единиц на 60 мг сердечной ткани).
  2. Поместите реакцию пищеварения в шейкер на 30 мин при 300 об/мин. Отрегулируйте стойку шейкера примерно на 25° наклона.
  3. Добавьте 7 мл HBSS в каждую из реакционных трубок 15 мл и центрифугу при 250 x g в течение 5 мин при 4 °C с ускорением и разрывом, установленными на умеренный или медленный. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте каждую гранулу в 5 мл буфера лизиса ACK для удаления эритроцитов. Инкубировать в буфере лизиса ACK в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Добавьте 10 мл PBS в каждую трубку, перемешайте, а затем отфильтруйте в трубку объемом 50 мл с сетчатым фильтром 40 мкм. Убедитесь, что весь мусор находится внутри фильтрующей камеры. Разбивайте любой мусор на фильтре шприцевым плунжером до тех пор, пока он полностью не будет полностью взвешен в камере фильтра.
  5. Добавляйте PBS через фильтр до тех пор, пока объем не достигнет 25 мл на сердце; это позволит взвешенным ячейкам проходить через фильтр. Добавьте дополнительные 25 мл PBS в контрольную тканевую трубку Reference и разделите объем на разные трубки (по 25 мл каждая). Пометьте одну из трубок «Неокрашенная», а другую как «Живой-мертвый». Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе подготовьте разведение для живого мертвого пятна (разбавление: 1:500 в 1x PBS).
  6. Декантируйте супернатант, повторно суспендируйте гранулу в неокрашенной трубке в 100 мкл PBS и каждую из других гранул в 100 мкл разведения живого мертвого пятна. Инкубировать на льду в течение 30 мин в темноте, покрывая ведро со льдом алюминиевой фольгой.
  7. Добавьте 500 мкл буфера FACS к каждому образцу и передайте его в маркированную трубку FACS через фильтр 40 мкм. Центрифугируйте трубки FACS при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 500 мкл буфера FACS.
  8. Добавьте 50 мкл блокирующего раствора Fc (см. Таблицу 1) в каждую трубку, за исключением неокрашенных и живых мертвых трубок. Перемешать и инкубировать в течение 5 мин.
  9. Добавляют 50 мкл раствора смеси антител (см. Таблицу 1) в каждую пробирку, за исключением неокрашенных и живо-мертвых трубок, и инкубируют в течение 30 мин в темноте, покрывая ведро со льдом алюминиевой фольгой.
  10. Добавьте 2 мл буфера FACS в каждую трубку и центрифугу при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалить супернатант и повторно суспендировать в 300-500 мкл буфера FACS.

5. Проточная цитометрия

  1. Настройка параметров управления прибором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе образец анализируется с помощью 4 лазеров Cytek Aurora проточного цитометра. Другой подходящий проточный цитометр может быть использован для обнаружения маркеров, представляющих интерес.
    1. Откройте программное обеспечение управления прибором (см. Таблицу материалов). В верхней части окна выберите вкладку Приобретение и нажмите на кнопку Новый +. Отобразится окно Создать новый эксперимент .
    2. В разделе Библиотека в поле Тип для фильтрации введите PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 и Zombie Aqua, нажав кнопку Добавить после ввода каждого из них. Названия флуорофоров должны быть видны справа. Затем нажмите кнопку Далее , чтобы перейти на вкладку Группа .
    3. На вкладке Группа щелкните символ с трубкой, чтобы добавить сердце для анализа.
    4. Нажмите на группу + Ссылка , и появится окно. В столбце флуоресцентных тегов выберите Zombie Aqua, а в столбце тип элемента управления выберите Ячейки, а затем нажмите кнопку Сохранить.
    5. Нажмите далее > вкладке Маркеры ; отобразится таблица с названиями флуорофоров. Введите соответствующий маркер ячейки в первой строке каждого столбца флуорофора и введите Enter: CD45 для PerCP-Cy5.5; CD19 для BV421; CD11b для Alexa Fluor 700; B220 для ПЭ; и живые мертвецы для Zombie Aqua.
    6. Дважды нажмите кнопку Далее , чтобы перейти на вкладку Приобретение . В поле События для записи экспериментальной группы введите 10 000 000, а в том же поле для строки ссылочной группы введите 200 000. Нажмите кнопку Сохранить и открыть. Остальные параметры должны оставаться по умолчанию: время остановки равно 10 000 и остановка громкости до 3 000.
    7. В левом нижнем углу нажмите на Управление приборами. Установите напряжение на FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Затем выберите Элемент управления получением. Для параметра Скорость потока выберите Высокий в раскрывающемся меню.
  2. Приобретайте эталонные образцы с помощью цитометра и разминируйте в программном обеспечении.
    1. Вихрь неокрашенной сердечной трубки и надежно поместите ее на порт для инъекций образца (SIP). Убедитесь, что зеленая стрелка индикатора указывает на правильный образец, затем нажмите кнопку Пуск на панели управления получением программного обеспечения цитометра и дождитесь записи событий. Сделайте то же самое для живой мертвой ткани сердца.
    2. Выберите меню Unmix и установите следующие элементы управления:
      1. Установите флажки PE, PerCP-Cy5.5, BV421 и Alexa Fluor 700 в столбце из библиотеки. Убедитесь, что Zombie Aqua не отмечен в том же столбце. В нижней части проверьте опцию Автофлуоресценция в качестве флуоресцентной метки.
      2. Нажмите кнопку Далее , чтобы перейти на вкладку Определение положительных и отрицательных групп населения . На этой вкладке отобразится график FSC-A против SSC-B-A. Щелкните и перетащите точки многоугольника, чтобы выбрать область от 1,0 М до 4,0 М по оси FSC-A и от 0,2 М до 3,0 М по оси SSC-B-A.
      3. На следующем графике справа V5-A будет отображаться по оси X. Переместите ворота, чтобы выбрать половину пика справа как положительную, а область в левой части графика как отрицательную. На участке под названием Reference Group - Unstained выберите популяцию в аналогичном диапазоне. Для этого должно быть установлено незапятнанное отсутствие положительно-отрицательного.
  3. Приобретайте экспериментальные образцы.
    1. Для каждой трубки, содержащей образец для отдельной мыши, вихрьте трубку и надежно поместите ее на SIP. Убедитесь, что зеленая стрелка индикатора указывает на правильный образец, затем нажмите кнопку Пуск на панели управления приобретением программного обеспечения цитометра и дождитесь записи событий.
  4. Стратегия гейтинга.
    1. Выберите вкладку Несмешанный лист по умолчанию . Создайте график FSC-A и SSC-A с помощью инструмента «Точечная диаграмма» сверху. Выделите события выше 0,4 М на оси FSC-A и выше 0,8 М на оси SSC-A с помощью инструмента выделения «Полигон». Дважды щелкните в этом выделении, и отобразится новый график.
    2. На вновь созданном графике щелкните правой кнопкой мыши на метке оси X и выберите AF-A; Щелкните правой кнопкой мыши метку оси Y и выберите Живое мертвое пятно. Нажмите на инструмент выбора прямоугольника сверху и выберите все события ниже 105 на оси live-dead, которые соответствуют нижнему сигналу live-dead. Дважды щелкните в этом выделении, и отобразится новый график.
    3. На новом графике щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать PerCP-Cy5.5-A для оси X и SSC-A для оси Y. С помощью инструмента «Прямоугольное выделение» выделите события выше 104 на оси PerCP-Cy5.5-A, соответствующие положительным ячейкам CD45. Дважды щелкните по выделению, и отобразится новый график.
    4. На новом графике щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать FSC-A для оси X и FSC-H для оси Y. С помощью инструмента выделения «Полигон» выберите события, следующие за трендом, по которому значения FSC-A и SSC-A совпадают; при этом клеточные дублеты будут удалены, а популяция в отборе будет называться популяцией CD45+. Дважды щелкните по выделению, чтобы отобразить новый график с населением CD45+.
    5. На графике населения CD45+ щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать BV421 по оси X и SSC-A по оси Y. С помощью инструмента «Выделение полигонов» выделите популяцию справа по оси BV421 . Это популяция В-клеток. Дважды щелкните в этой популяции, чтобы создать два новых участка с популяцией В-клеток.
      1. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы настроить первый график B-ячейки с PE-A по оси X и BV421-A по оси Y. Популяция справа соответствует внутрисосудистым В-клеткам, а популяция слева представляет собой интерстициальные В-клетки. Используйте инструмент выделения «Полигон» для выделения обоих элементов.
      2. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы настроить второй график B-cell с Alexa Fluor 700-A на оси X и SSC-A на оси Y. Популяция слева соответствует CD11b-клеткам, а события справа (если таковые имеются) соответствуют клеткам CD11b+.
      3. Щелкните правой кнопкой мыши каждый выбор и выберите Свойства ворот. Нажмите Count и % Parent , чтобы отобразить размеры и проценты. Запишите количество событий и проценты для дальнейшего анализа данных.

Результаты

После завершения сбора и сбора всех событий данные должны быть проанализированы в соответствии со стандартной практикой проточной цитометрии. Фокус анализа будет варьироваться в зависимости от индивидуальной цели каждого эксперимента. В этом случае проводилась количественная оценк...

Обсуждение

Растущее количество доказательств указывает на то, что В-клетки играют важную роль в контексте физиологии миокарда и ремоделирования миокарда / адаптации к травме 7,8,9,10,11,12,13,36....

Раскрытие информации

Луиджи Адамо является соучредителем i-Cordis, LLC, компании, ориентированной на разработку иммуномодулирующих молекул для лечения сердечной недостаточности, с особым интересом к производным В-клеточного модулирующего препарата пирфенидона. У остальных авторов нет конфликтов, которые можно было бы объявить.

Благодарности

Это исследование финансировалось грантами NHLBI 5K08HLO145108-03 и 1R01HL160716-01, присужденными Луиджи Адамо.

Проточный цитометр Aurora, используемый для разработки этого исследования, финансировался грантом NIH S10OD026859. Мы признаем поддержку ядра проточной цитометрии JHU Ross.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody101222BioLegend100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, BlueQBIAP303Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1605-0000SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP114-055-101Quality Biological0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1615-5500SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips11213810USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips11267810USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430052Corning
1-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT951ECT Manufacturing
2,2,2-TribromoethanolT48402Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips11208810USA Scientific
3-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT953ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style352054Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430290Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer118-156-101Quality BiologicalOsmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-635810759005Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-6222638289Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-6222638246Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007UPC 109153Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - MouseRWD-AICMV-100Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL309626BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-PackCMD 2613Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody115537BioLegend50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterileT9009Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940 CD USPEAirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mLUX-34502-46Cole-Parmer
Collagenase 2LS004176Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barbY992611-AGAirGas USA
Cytek Aurora Flow CytometerCytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CPM-08-12AirGas USA
DNase I - 40,000 UD4527Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller4430000018Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E30100606Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge5810REppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettesEppendorf
FlowJo 10.8.1BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)Z740287Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076gibco1x
HyaluronidaseH3506Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight13018-14Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL302831BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940M1-940-PGAirGas USA
McKesson Underpads, Moderate4033-CS150McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable BalanceNV2201Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]10010023gibco1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody103208BioLegend200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody103132BioLegend100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile PolystyreneFB0875711YZFisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02M08-1AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck IlluminatorLED-6WAmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)305122BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)553141BD Becton, Dickinson and Company Biosciences0.5 mg/mL
R 4.1.1The R Foundation
Razor Blades9501250000Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inletY12244A320-AGAirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular bucketsRotor A-4-62Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister86.1254.001Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tapeL8394Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EAMTLL230-6005Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' LongCG-730-003Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mLZ683566Millipore Sigma
Syringe pump55-1199 (95-240)Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM105009371W13Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119835Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119827Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.T8913 (Millipore Sigma)Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2SI-0236Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips89259-946Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"82027-578Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I12620-946Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit423102BioLegend

Ссылки

  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
  3. Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
  4. Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
  5. Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
  6. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
  7. Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
  8. Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
  9. Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
  10. Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
  11. Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
  12. Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
  13. Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
  14. Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
  15. Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
  16. Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
  17. Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
  18. Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
  19. Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
  20. Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
  21. Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
  22. Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
  23. Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
  24. Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
  25. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  26. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  27. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  28. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  29. Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
  30. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  31. Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
  32. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  33. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  34. Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
  35. Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
  36. Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
  37. Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены