使用高分辨率呼吸测定法实时分析原代人视网膜色素上皮细胞中的生物能量学

摘要

人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）的代谢状态反映了它们的健康和功能。这里介绍的是一个优化的方案，用于使用高分辨率呼吸测定法检查H-RPE的实时代谢通量。

摘要

视网膜色素上皮细胞（RPE）的代谢功能障碍是视网膜疾病的关键致病驱动因素，例如年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）。由于RPE是高度代谢活跃的细胞，其代谢状态的改变反映了其健康和功能的变化。高分辨率呼吸测定法允许通过分别量化细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）对糖酵解和线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）两种主要生物能量途径进行实时动力学分析。以下是对原代人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）进行高分辨率呼吸测量的优化方案。该协议详细描述了产生RPE的生物能量谱所涉及的步骤，以确定其基础和最大OXPHOS和糖酵解能力。将H-RPE暴露于针对线粒体和糖酵解机制的不同药物注射中可产生确定的生物能量谱，从中可以计算出关键的代谢参数。该协议强调了与羰基氰对三氟甲氧基苯腙（FCCP）相比，BAM15作为解偶联剂的增强反应，以诱导RPE的最大呼吸能力。该方案可用于研究不同疾病条件下RPE的生物能量状态，并测试新药在恢复RPE基础代谢状态方面的功效。

引言

视网膜色素上皮细胞（RPE）作为单层色素上皮细胞存在，战略性地位于脉络膜毛细血管的光感受器和开窗内皮之间。RPE具有高度代谢活性，具有多种功能，包括（1）脱落的感光器盘的吞噬作用，（2）视觉色素的回收以维持视觉周期，（3）营养，代谢物，离子和水的运输，（4）光的吸收，（5）防止光氧化，（6）分泌支持视网膜完整性的基本因子，以及（7）形成外部血视网膜屏障¹.RPE的变性与代谢功能障碍和线粒体缺陷有关，导致致盲性眼部疾病，如年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）²。

两种关键的生物能量途径包括发生在细胞质中的糖酵解和在线粒体中发生的氧化磷酸化（OXPHOS）。在糖酵解过程中，一分子葡萄糖转化为两分子丙酮酸和两分子三磷酸腺苷（ATP）的净产量。与糖酵解相比，OXPHOS产生更高水平的ATP（每个葡萄糖分子~32-38个ATP分子）。值得注意的是，OXPHOS消耗氧气并需要功能性线粒体发生，而糖酵解发生在细胞质中并且不需要氧气。

在引入基于荧光或磷光的技术来检查线粒体呼吸之前，在配备克拉克型氧电极³的腔室中测量透化细胞悬液中的氧气水平。虽然Clark电极比基于荧光的呼吸测量法便宜得多，并且在非贴壁细胞中起作用，但它的通量相对较低，每次呼吸运行持续约15-20分钟，并且^{每个样品需要}更多的细胞3。因此，基于荧光的呼吸测量技术已在很大程度上取代了克拉克电极，并已成为代谢和线粒体研究领域的流行技术。

该协议描述了一种高通量，高分辨率，基于荧光的呼吸测量技术，该技术可动态测量活细胞的OXPHOS和糖酵解生物能量谱。由于 OXPHOS 的过程消耗氧气，因此 OXPHOS 的生物能量分布是通过绘制氧气消耗率 （OCR） 随时间的变化来生成的⁴。在该技术中，两个荧光团嵌入传感器盒套筒中，该套筒连接到发光的光纤束，激发荧光团。荧光团发射的变化由高灵敏度荧光传感器测量，并通过光纤束传输，以转换为OCR读数⁵。荧光基团被氧淬灭，从而能够测定测定培养基中的细胞外氧水平，称为氧通量或OCR。另一种荧光团是对质子外排变化敏感的pH传感器探针，其转化为细胞外酸化速率（ECAR）的量度。在测量过程中，带有嵌入荧光团的光纤束降低到细胞单层上方 200 μm，从而形成一个瞬态微室，可实现快速、实时的读数。一旦检测到氧气或质子水平变化10%，传感器就会向上抬起，允许更大体积的介质与瞬态微室介质混合，将OCR和ECAR值恢复到基线。每个传感器盒都配有四个端口，允许在测定过程中每孔连续施用多达四种化合物。可以在每个端口注射化合物之前和之后收集测量值，揭示有关细胞代谢状态的关键信息。

询问这两种不同的代谢途径可以产生关于暴露于不同致病刺激后RPE代谢状态的重要发现，因此可用于测试药物在恢复RPE⁶，^7，8代谢完整性方面的功效。高通量呼吸测定法的出现和特异性线粒体抑制剂的可用性刺激了更多的研究，以确定RPE的生物能量特征和识别疾病状态期间代谢和线粒体的缺陷⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，^12，13.高分辨率呼吸测量法强调了 RPE 代谢重编程在 AMD 和 PVR 等视网膜病变中的关键作用。参与AMD和PVR发病机制的两个关键细胞因子是转化生长因子-β2（TGFβ2）和肿瘤坏死因子-α（TNFα）。TGFβ2诱导上皮 - 间充质转化（EMT）伴随着线粒体功能障碍，OXPHOS抑制和RPE⁶中糖酵解能力的代偿性增加。最近，促炎细胞因子TNFα已被证明可诱导H-RPE⁷中基础OXPHOS的显着上调和糖酵解减少。富马酸二甲酯的施用显着抑制了 H-RPE 中 TNFα 诱导的炎症，并恢复了线粒体形态和基础生物能量特征⁷.由这两种生长因子引起的不同代谢谱激发了关于代谢重编程参与视网膜疾病的有趣机制问题。以下协议描述了使用高分辨率呼吸测定法评估 H-RPE 中的 OXPHOS 和糖酵解生物能量谱的步骤。

研究方案

1. 在细胞培养板中接种H-RPE

1. 在补充有 RPE 生长培养基补充剂（4 mM L-谷氨酰胺、25 ng/mL FGF-2、2% FBS、30 mg/mL 庆大霉素和 15 μg/mL 两性霉素）的人 RPE 培养基中的 T25 烧瓶中解冻 H-RPE。
2. 在加湿的培养箱中将细胞在37°C和5%CO₂ 下孵育。第二天刷新培养基，等待细胞达到至少80%汇合，然后以1:3的比例传代到T75烧瓶中。
3. 汇合后，使用由胰蛋白酶/ EDTA 0.025%溶液，胰蛋白酶中和溶液和HEPES缓冲盐水（pH 7.0-7.6）组成的传代培养试剂盒传代细胞。
   1. 用 3 mL HEPES 缓冲盐水轻轻冲洗 H-RPE。然后加入3mL胰蛋白酶/ EDTA并孵育（37°C和5%CO₂）5分钟（或直到细胞从烧瓶底部抬起，如在显微镜下观察到的那样）。用 3 mL 胰蛋白酶中和溶液中和胰蛋白酶/EDTA。
   2. 将细胞以200× g 离心3.5分钟以形成细胞沉淀。小心吸出并丢弃上清液。
4. 将细胞重悬于人RPE培养基中，终浓度为每孔每100μL20，000个细胞。
   1. 多次上下移液以确保细胞悬液均匀，使用多通道移液器轻松一致地移液到 96 孔细胞培养微孔板中。将移液器吸头放在孔顶部的圆形边缘下方，以获得均匀、均匀的细胞层。
      注意:由于细胞很好地粘附在微孔板上，因此不需要涂层。
   2. 确保将四个角孔留空细胞（仅 100 μL 培养基）以用作背景校正孔（图 1A）。
      注意:微孔板采用典型的96孔板设计;然而，每个孔的表面积为0.106cm²，比标准的96孔板小40%。在此细胞密度下，细胞应在第二天100%汇合。建议在测试处理之前先进行细胞密度优化实验，以确保基础OCR和ECAR读数分别约为50-100 pmol/min和10-20 mpH/min。
5. 将细胞培养板在室温（RT）下放置1小时，然后将其放回培养箱（5%CO₂，37°C，加湿），以帮助最大程度地减少边缘效应。边缘效应是由于蒸发¹⁴引起的96孔板外围边界孔中培养基体积的变化。
   注意:细胞将粘附过夜，并在第二天形成汇合的单层。H-RPE通过每2-3天刷新一半的生长培养基在平板中成熟至少1个月。
6. 在更换培养基之前，在显微镜下检查细胞以检查其形态和色素沉着水平。确保细胞与特征性的鹅卵石状形态汇合，并随着时间的推移获得色素沉着，如Shu等人的形态图像^所示7。

2. 运行检测的前一天

1. 通过在实用板的每个孔中填充 200 μL 去离子水，确保在测定前一天对传感器盒进行水合。
   注意:实用板的盖子包含荧光生物传感器，用于测量每个孔的氧气和pH值。传感器耦合到光纤波导，光纤波导以各种激发波长传输光，并通过滤光片将荧光信号传输到光电探测器。
2. 将传感器盒浸没在实用板中的水中，连同~20 mL校准品（预热以第二天使用）一起放入37°C加湿炉（不含CO₂）中过夜。
   注意:校准器是专为传感器盒校准而设计的专有解决方案，其成分可能与磷酸盐缓冲盐水（PBS）相似。墨盒水合的最短时间为4小时，但过夜水合获得最佳结果。
3. 确保仪器已打开并启动软件，以使仪器在过夜之间稳定至37°C（图2）。通常，即使不使用，仪器也可以保持打开状态。

3. 使用细胞外通量分析仪进行实时Mito压力测试

1. 在测定当天，在运行测定前至少45分钟用等体积的加热校准剂替换实用板中的水。
2. 通过添加添加剂，使用不含酚红的基础培养基制作Mito压力测试测定培养基，如 表1所示。将培养基加热至37°C，将pH调节至7.4，并使用管顶过滤装置对培养基进行真空过滤。对于运行整个板，制作~25 mL测定培养基。
3. 取出人RPE培养基并用180μL新鲜制备的测定培养基代替（步骤3.2）。在开始测定之前，将细胞培养板置于加湿的37°C烘箱（无CO₂）中1小时。
   注意:这对于对细胞板进行脱气很重要，允许CO₂ 扩散。由于细胞不再在其生长培养基中，也不再在装有CO₂的培养箱中，因此它们的活力会随着时间的推移而恶化，因此，应注意尽可能有效地进行测定。还应注意确保细胞培养板中没有气泡;如果有，请用移液管或针头弹出它们。
4. 每个传感器盒每个孔有四个试剂输送端口，用于在测定过程中将测试化合物注入细胞培养板的孔中（图1C，D）。根据 表2稀释相应测定培养基中的药物储备液，制备~3mL的10x药物溶液。例如，用溶解在Mito压力测试测定培养基中的25μM寡霉素加载端口A，使得当药物体积通过仪器注入孔中时，每个细胞暴露于的最终浓度为2.5μM。 将 20 μL 的 10x 药物原液移液到端口 A 中， 22 μL 移液到端口 B 中， 并将 25 μL 放入端口 C，以达到每个孔中指定的最终药物浓度。对于需要所有四个药物端口的方案，将 28 μL 移液到端口 D 中。
   注意:将药物移液到药物端口时，请参阅 图1B ，以了解端口A/B/C/D的正确方向。装载药物端口时，墨盒边缘的凹口应位于左下角。通过以一定角度移液进入每个药物端口，可以最大限度地减少气泡。如果存在任何气泡，应小心用移液管或针头弹出它们。
5. 在分析软件中打开 模板 选项卡，选择 Mito压力测试，然后填写 组定义。
   1. 输入有关 注射策略 的详细信息（在这种情况下，它被预先输入为Mito压力测试药物）。输入有关测定中不同实验组的详细信息（例如， 对照或处理）。输入检测培养基的详细信息（将不同的添加剂及其特定浓度添加到基础 检测培养基 中），最后添加 细胞类型。
   2. 单击下一个选项卡，板图，其中被检查的不同组将被分配到其在96孔板 图上的特定位置。完成此操作后，单击 "协议 "选项卡以查看默认 Mito 压力测试 协议的仪器协议。
      注意:默认的 Mito 压力测试 模板已准备就绪，但可以以任何方式修改以适应实验设计。例如，默认测量时间为 3 分钟，但如果需要，可以将其修改为 5 分钟。
6. 单击运行 检测 并将浸没在校准溶液中的传感器盒插入实用板。此过程大约需要 25 分钟。在此步骤中，每个生物传感器根据已知pH和氧气浓度的校准溶液中测量的传感器输出进行独立校准。
   1. 校准后，取出实用板并插入细胞培养板。
      注意:首先平衡细胞培养板，然后仪器开始混合测定培养基并测量OCR和ECAR值。此步骤大约需要 1.5 小时，并在仪器内进行，无需用户的任何干预。首先通过混合测定培养基3分钟，然后测量OCR和ECAR3分钟来建立OCR和ECAR的基线读数。该仪器执行三个混合和测量循环。
   2. 基线测量后，仪器自动将端口A药物溶液注入每个孔中。接下来是三个混合和测量循环（每个3分钟）。每次后续药物注射（端口B和C）后都会发生相同的模式。
7. 运行完成后，取出细胞培养板和传感器盒。出于质量控制目的，通过检查端口以检查没有残留药物，确保传感器盒中的所有药物端口都已注射。丢弃传感器盒和实用板，因为它们是一次性物品。
8. 在显微镜下检查细胞培养微孔板中的细胞，以确保仍然存在汇合的单层细胞。丢弃测定培养基，并在每个孔中用 60 μL 1x 裂解缓冲液替换。
   注意:裂解缓冲液由10倍裂解缓冲液制成，在去离子水中稀释至1倍，并加入1mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）。
9. 在使用BCA测定定量蛋白质含量之前，将板的边缘包裹在石蜡膜中以防止蒸发，并将其放入-80°C冰箱中以帮助细胞裂解过夜。
10. 对于数据分析，通过将 OCR 和 ECAR 值除以每个孔中的蛋白质微克来标准化所有数据。导出 Mito 压力测试报告生成器，该生成器利用 Excel 宏使用数据分析软件自动计算 Mito 压力测试参数。
    注意:这可用于确定基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力、质子泄漏、ATP 产生和非线粒体呼吸。 表 3 列出了这些计算的定义。

4. 使用细胞外通量分析仪进行实时糖酵解应激测试

1. 按照与Mito压力测试相同的步骤进行糖酵解应激测试，除了使用表 1 和 表2所示的不同测定培养基补充剂和药物注射剂。
2. 对于数据分析，请导出糖酵解压力测试报告生成器，该生成器利用 Excel 宏从数据分析软件自动计算糖酵解压力测试参数。
   注意:这可用于确定非糖酵解酸化、糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。 表 3 列出了这些计算的定义。

5. 支链氨基酸定量测定

注意:二辛可酸（BCA）蛋白质定量测定（也称为史密斯测定¹⁵）是一种基于铜的比色测定，用于确定样品中的总蛋白质含量。将OCR和ECAR数据标准化为每个孔中的微克蛋白质可确保每个孔中不同数量的细胞/蛋白质不会扭曲读数。BCA测定的机理基于两种化学反应。首先，蛋白质中的肽键将铜离子（Cu²+）还原为亚铜离子（Cu⁺），这是一种由较高温度（37至60°C）辅助的温度依赖性反应。如果有更多的肽键，则使Cu²⁺的量与溶液中的蛋白质含量成正比¹⁶。该反应导致颜色从绿色变为浓紫色溶液，在562nm¹⁶处具有峰吸光度。样品中的蛋白质含量越高，该波长下的吸光度就越高。该试剂盒的工作范围为 20-2，000 μg/mL。

1. BCA 检测试剂盒含有 1 mL 等分试样的 2 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA），可作为蛋白质浓度参考标准品。从未稀释的 2 mg/mL BSA 开始，在透明的平底 96 孔板中制备连续稀释液，随后通过在去离子水中稀释（例如，2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL 等）将浓度减半。使用已知浓度的蛋白质可以计算标准曲线，该曲线用于计算实验样品的蛋白质含量。为了提高计算的蛋白质含量测量的准确性，请在每次测定的实验样品旁边测量蛋白质浓度参考标准品的吸光度读数。
2. 将 25 μL 的每种 BSA 系列稀释液一式两份移液到 96 孔板中。
3. 将 25 μL 的 1x 裂解缓冲液一式两份移液到 96 孔板中作为空白。
4. 将细胞培养板解冻至室温，并将 25 μL 的每种细胞裂解物一式两份移液到 96 孔板中。
5. 以 50:1 比例的 BCA 试剂盒试剂 A:B 制备工作试剂.通过涡旋充分混合以去除工作试剂中的任何浊度，使其成为均匀的绿色溶液。向每个孔中加入 200 μL 工作试剂。
6. 通过将板盖在箔纸中来保护板免受光照，并在37°C烤箱中孵育20分钟。
7. 在96孔板读数器中测量562nm处的吸光度。
8. 对于数据分析，对所有重复值求平均值。从所有样品的测量中减去从1x裂解缓冲液孔中确定的空白吸光度水平。通过将每种BSA标准品的吸光度绘制为其已知浓度（以μg/mL为单位）来确定标准曲线。使用从标准曲线推导出的线性方程来确定实验样品的蛋白质浓度。

结果

该仪器在每次运行时同时测量 OCR 和 ECAR。对于 Mito 压力测试，参数计算基于 OCR 读数（图 3A），而对于糖酵解压力测试，参数计算基于 ECAR 读数（图 3B）。图 3 显示了 Mito 压力测试 OCR 曲线随时间变化的代表性图表（图 3C）和 H-RPE 条形图形式的参数计算（图 3D）。糖酵解应激测试表示为随时间变化的 ECAR 曲线（图 3E），参数计算显示在 H-RPE 的条形图中（图 3F）。

基底呼吸提供了对基础条件下细胞能量需求的理解¹⁷。第一次药物注射寡霉素（Oligo）是一种ATP合酶抑制剂，因此，第一次药物注射后OCR的任何减少都是ATP相关呼吸的量度¹⁸。随后的药物注射后任何剩余的基础呼吸都被视为质子泄漏，因为它不与ATP合成耦合。质子泄漏增加可能表明线粒体解耦增加，线粒体解偶联由生理上存在的解偶联蛋白调节，但也与肥胖、癌症、2 型糖尿病和心血管疾病等病理有关¹⁹.第二次注射是解偶联剂，如BAM15或FCCP，以确定线粒体的最大呼吸电位。解偶联剂使质子梯度崩溃并降低穿过线粒体内膜的质子动力。结果是电子通过电子传递链（ETC）不受抑制地流动，从而提高了耗氧速率并导致线粒体呼吸达到其最大容量²⁰。备用呼吸能力（SRC）是最大呼吸和基础呼吸之间的差异，表示细胞在受到挑战时对能量需求变化做出反应的能力，表明细胞适应性。重要的是，对于H-RPE中的Mito压力测试，BAM15在增强线粒体呼吸能力方面优于FCCP（图4A，B），因为与500nM或1μM FCCP相比，10μM BAM15的最大呼吸和备用呼吸能力显着更高。两种FCCP剂量之间均未观察到显着差异。第三次也是最后一次注射鱼藤酮和抗霉素A（Rot/AA）分别抑制ETC的线粒体复合物I和III，从而关闭线粒体呼吸;任何残留的OCR都是由于非线粒体来源²¹。

在糖酵解过程中，一个葡萄糖分子在没有氧气的情况下转化为两个乳酸分子。乳酸从细胞中挤出伴随着每个乳酸分子一个质子的外排，从而导致细胞外空间的酸化。介质中质子产生的通量是通过ECAR的变化来测量的。首先建立基础糖酵解水平，然后将葡萄糖注入没有葡萄糖的测定培养基中，以诱导糖酵解，从而提高ECAR水平²²。注射寡霉素以诱导"最高"的ECAR，因为它停止线粒体ATP的产生，从而迫使细胞通过糖酵解获得其ATP。最后，通过添加2DG来关闭糖酵解，2DG抑制己糖激酶，糖酵解²³的第一种酶。任何剩余的 ECAR 可能是由于其他酸化来源，例如 OXPHOS 期间 TCA 循环产生的 CO₂ ，并表示为非糖酵解 ECAR。糖酵解储备计算为存在葡萄糖的"最高"ECAR和ECAR之间的差异。糖酵解能力是糖酵解和糖酵解储备的总和。

图1:板和传感器盒的组件 。 （A） 显示了仪器、数据分析软件和协议设置界面。在96孔培养板布局中，细胞接种在蓝色孔中，四个角孔标记为黑色，因为它们用作仅包含培养基（而不含细胞）的背面校正孔。（B）传感器盒的每个孔有四个药物端口，可以装载药物A，B，C和D。根据 10x 药物储备制剂的计算列出要移液到每个端口的体积。（C） 传感器盒由传感器探头组成，传感器探头直接放置在填充校准剂的实用板中。 请点击此处查看此图的大图。

图2:测定的时间线。 将细胞接种在细胞培养板中。准备就绪后，该测定涉及为期 2 天的程序，然后使用 BCA 测定和随后的数据分析对蛋白质含量进行定量。 请点击此处查看此图的大图。

图3:水户压力测试和糖酵解压力测试的代表性图表。 原理图中描述了（a）Mito压力测试和（B）糖酵解压力测试参数的计算。（C） 显示了 H-RPE 的代表性耗氧量 （OCR） 曲线和 （D） 水户应力测试参数。（E） 显示了代表性的细胞外酸化速率 （ECAR） 曲线和 （F） H-RPE 的糖酵解应激测试参数。误差线是 SEM ±手段。 请点击此处查看此图的大图。

图4:BAM15与FCCP作为解偶联剂的比较。 H-RPE 上的 Mito 压力测试比较了使用 10 μM BAM15、500 nM FCCP 或 1 μM FCCP 诱导最大呼吸的功效，显示 （A） 耗氧率 （OCR） 曲线和 （B） Mito 压力测试参数。误差线是 SEM ±平均值。 **** p ≤ 0.0001;ns，不重要。 请点击此处查看此图的大图。

测试	葡萄糖（毫米）	谷氨酸最大值 （毫米）	丙酮酸钠	HEPES （mM）
水户压力测试	25	2	1	1
糖酵解应激测试	没有	0.5	没有	1

表1:添加到Mito和糖酵解应激测试的测定培养基中的补充剂浓度。

测试	端口 A	端口 B	端口 C
水户压力测试	寡霉素2.5μM	FCCP 500 nM 或 BAM15 10 μM	鱼藤酮 2 μM 和抗霉素 A 2 μM
糖酵解应激测试	葡萄糖 10 mM	寡霉素2μM	2-脱氧葡萄糖 50 mM

表2:用于Mito和糖酵解应激测试的药物端口注射浓度。 重要的是要注意，这些是将药物注射到每个孔中后细胞暴露于的最终浓度。装载药物端口时，药物的制备强度应提高 10 倍。

术语	定义
校准	校准器是用于校准传感器盒的解决方案。它的配方是专有的，其成分与PBS相似。
传感器盒	传感器盒包含嵌入在传感器盒套管中的两个荧光基团，它们连接到发光的光纤束，激发荧光团。一个荧光基团测量氧通量，另一个测量质子通量。每个传感器盒还配有 4 个端口，允许在测定过程中每孔顺序施用多达 4 种化合物。
实用板	实用板（也称为校准板）用于校准传感器。校准溶液放置在实用板中。
水户压力测试	Mito 压力测试是通过绘制 OCR 随时间的变化来提供线粒体呼吸生物能量谱的测定的名称。
糖酵解应激测试	糖酵解应激测试是通过绘制 ECAR 随时间的变化来提供糖酵解生物能量谱的测定的名称。
耗氧率	耗氧率是氧通量（pmol/min）的量度，表示线粒体代谢状态。
细胞外酸化率	细胞外酸化速率是质子外排（mpH / min）的量度，并指示糖酵解代谢状态。
波浪软件	Wave软件用于对测定和随后的数据分析进行编程
非线粒体耗氧量	注射鱼藤酮/抗霉素A后的最低速率测量
基础呼吸	（首次注射前的最后速率测量） – （非线粒体呼吸速率）
最大呼吸	（注射FCCP后的最大速率测量） – （非线粒体呼吸）
H+ （质子）泄漏	（寡霉素注射后的最低速率测量） – （非线粒体呼吸
可供使用量（ATP）生产	（寡霉素注射前的最后速率测量） – （寡霉素注射后的最小速率测量）
备用呼吸能力	（最大呼吸） – （基础呼吸）
备用呼吸能力百分比	（最大呼吸） / （基础呼吸） × 100
耦合效率	ATP产生率）/（基础呼吸率）×100
糖酵解	（寡霉素注射前的最大速率测量） – （葡萄糖注射前的最后速率测量）
糖酵解能力	（寡霉素注射后的最大速率测量） – （葡萄糖注射前的最后速率测量）
糖酵解储备	（糖酵解能力） – （糖酵解）
糖酵解储备 %	（糖酵解容量率）/（糖酵解） × 100
非糖酵解酸化	葡萄糖注射前的最后速率测量

表3:测定关键组分的定义列表。

讨论

这种用于H-RPE高分辨率呼吸测定的优化方案涉及使用BAM15作为解偶联器，而不是常用的FCCP。虽然以前关于RPE高分辨率呼吸测量的研究使用了FCCP⁹，^24，但与FCCP相比^，BAM15似乎诱导了H-RPE中最大呼吸水平的更强大的诱导。虽然FCCP和BAM15在细胞中使用都是安全的，但据报道，与FCCP或羰基氰化物-3-氯苯腙（CCCP）相比，BAM15在正常细胞中的副作用较少²⁵。Kenwood等人表明，BAM15使线粒体去极化而不影响质膜电位，从而在低细胞毒性下诱导持续的最大线粒体呼吸速率²⁶。另一方面，FCCP使线粒体和质膜去极化，并显示出更高的细胞毒性²⁶。

该方案中有几个关键步骤，包括确保细胞在微孔板的所有实验孔中正确接种在融合、均匀且均匀的单层 RPE 中。成熟的RPE高度依赖OXPHOS来产生能量，因此应让细胞成熟至少1个月，以确保RPE在测定过程中产生适当的基础和最大OCR读数。在将细胞培养板放入仪器之前，在加湿的烘箱（不含CO 2）中在37°C下对细胞培养板进行脱气1小时对于准确的ECAR读数至关重要，因为CO₂会影响测定培养基的pH值。重要的是要记住在检测前一天对传感器盒进行水合，以确保其在检测当天提供可靠的OCR和ECAR读数。应注意适当地重新配制待注射的药物，并将复原的药物储备分装成较小的体积进行长期储存，以尽量减少冻融循环。至关重要的是制备在相应测定培养基中稀释的10倍药物溶液（例如，在Mito压力测试测定培养基中稀释用于Mito应激测试），以考虑将药物注射到每个充满测定培养基的孔中的稀释度。随着每次随后的药物注射，每个孔中有更多的培养基，因此每次注射时加载的药物量增加，应注意遵循方案中规定的体积。重要的是在实验完成后进行质量检查，检查传感器盒以确保没有明显的残留药物，并在显微镜下观察细胞培养板以确保保持融合和均匀的细胞单层。

对该协议的修改包括在端口中注射不同的药物，并确定这些药物如何影响OCR和ECAR读数。一种流行的修改是在注射通常的 Mito 或糖酵解应激测试药物之前注射选择的实验药物作为端口 A。这种类型的方案提供了关于急性注射所选药物如何影响随后的OXPHOS和糖酵解参数的见解。其他修改包括检查不同的细胞类型;这需要对最佳接种细胞密度进行初步故障排除，并通过确保 OCR 的基础读数范围为 50-100 pmol/min 和 ECAR 的基础读数范围为 10-20 mpH/min 来优化测定培养基。需要通过观察OCR和ECAR对药物连续稀释的反应来确定每种新细胞类型注射药物的最佳浓度。

该方案的一个关键限制是细胞活力随着时间的推移而降低，因为细胞不在正常生长培养基的CO₂ 培养箱中，因此测定应在3-4小时内完成以确保最大的细胞活力。此外，随着时间的推移，暴露于注入每个孔的线粒体毒素会进一步降低细胞活力。测定完成后，必须裂解细胞以评估蛋白质含量以使OCR和ECAR读数正常化，因此不能收获相同的细胞用于随后的分子生物学测定。

用于生物能量分析的Seahorse替代品包括Oroboros Oxygraph 2k（O2k）²⁷，BaroFuse^28，29和Resipher（Lucid Scientific）⁷。Oroboros O2k是一款封闭式双室呼吸计，采用S1克拉克型极谱法氧电极。虽然Oroboros O2k可对实时代谢通量进行高度灵敏的测量，但该设备是劳动密集型的，因为操作员需要手动注射每种药物³⁰。BaroFuse 是一种新型多通道微流体灌注系统，它使用气体压力实现多个平行灌注实验，并与氧气检测系统相连以测量 OCR。这种流动培养系统的优点是保持组织功能和活力，而海马则在较长时间的测定中细胞活力降低。Resipher 利用高灵敏度的光学氧传感器在培养箱中的 96 孔板中测量 OCR，从而能够在数周至数月内连续测量 OCR。值得注意的是，这些仪器不测量ECAR，因此Seahorse具有同时探索OXPHOS和糖酵解的优势。

询问 OXPHOS 和糖酵解的实时生物能量谱正在成为表征 RPE 健康和功能的关键因素。高分辨率呼吸测量法能够有效地比较正常和患病RPE的代谢状态，从而为筛查视网膜疾病（如AMD和PVR）的药物疗效开辟了新的途径。RPE高分辨率呼吸测量的未来方向包括优化方案，以检查在Transwell过滤器上生长的高极化RPE单层的生物能量分布。Calton等人（2016）通过切割在Transwell过滤器上生长的偏振RPE单层的三角形截面成功地实现了这一目标³¹。该方法的进一步扩展包括检查从不同视网膜退行性疾病患者中分离出的诱导多能干细胞衍生RPE（iPSC-RPE）的生物能量特征³²。探索参与AMD和PVR的致病细胞因子如何影响RPE代谢的动态性质可以揭示代谢脆弱性，从而为识别新的药物靶标提供信息。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Deoxy-D-glucose	Sigma	D8375-5G	Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile	VWR	229597	BCA Assay 96-well plate
Antimycin A from Streptomyces sp.	Sigma	A8674-25MG	Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)
BAM15	Sigma	SML1760-5MG	Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
BCA Assay	ThermoFisher	23225	To determine total protein content in each well
Calibrant Solution	Seahorse Bioscience	100840-000	Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge
Cell Lysis buffer 10x	Cell Signaling Technologies	9803S	Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use
D-(+)-Glucose solution	Sigma	G8644-100ML	Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)
DMSO, Cell culture grade	Sigma-aldrich	D4540-100ML	For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG
FCCP	Sigma	C2920-10MG	Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
GlutaMAX	Gibco	35050061	Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
HEPES solution	Sigma	H0887-100ML	Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells	Lonza	194987	Primary human fetal RPE cells
Oligomycin - CAS 1404-19-9 - Calbiochem	Sigma	495455-10MG	ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)
Parafilm	Bemis	PM996	To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor	Gold Biotechnology Inc	50-153-2823	Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL	Lonza	CC-5034	Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline
Rotenone	Sigma	R8875-1G	Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407)	Lonza	195409	Media for primary human fetal RPE cells
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent		High-Resolution Respirometry Instrument
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution
Sodium pyruvate solution	Sigma	S8636-100ML	Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size	Millipore-Sigma	SCGP00525	Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media
Synergy H1 Plate Reader	BioTek		Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay
XF base medium without phenol red	Agilent	103335-100	Base media for running the Seahorse assay