使用轻度创伤性脑损伤的清醒闭合性头部损伤模型评估突触可塑性的变化

摘要

在这里，展示了如何使用清醒闭合性头部损伤模型来检查反复轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）对海马突触可塑性的影响。该模型在患者中复制了r-mTBI的重要特征，并与 体外 电生理学结合使用。

摘要

轻度创伤性脑损伤（mTBIs）是北美普遍存在的健康问题。在临床前环境中利用生态有效的闭头mTBI模型来提高临床人群的可转化性的压力越来越大。清醒闭头损伤 （ACHI） 模型使用改进的受控皮质撞击器来传递闭头损伤，无需开颅或使用麻醉剂即可诱导临床相关的行为缺陷。

这种技术通常不会引起死亡、颅骨骨折或脑出血，并且更符合轻度损伤。事实上，ACHI程序的温和性质使其成为研究重复性mTBI（r-mTBI）的理想选择。越来越多的证据表明，r-mTBI可导致累积性损伤，产生行为症状、神经病理改变和神经变性。r-mTBI在参加体育运动的年轻人中很常见，这些损伤发生在突触重组和髓鞘形成的时期，使年轻人群特别容易受到r-mTBI的长期影响。

此外，r-mTBI发生在亲密伴侣暴力的病例中，这种情况很少有客观的筛查措施。在这些实验中，使用ACHI模型评估了经历过r-mTBI的幼鼠海马的突触功能。受伤后，使用组织切片机制作海马切片，以评估r-mTBI后1天或7天海马体中的双向突触可塑性。总体而言，ACHI模型为研究人员提供了一个生态学上有效的模型来研究mTBI和r-mTBI后突触可塑性的变化。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是一个重大的健康问题，加拿大和美国每年有~200万例^1，2。TBI 影响所有年龄组和性别，发病率高于任何其他疾病，特别是包括乳腺癌、艾滋病、帕金森病和多发性硬化^{症 3}。尽管 TBI 患病率很高，但其病理生理学仍知之甚少，治疗选择有限。部分原因是85%的TBI被归类为轻度（mTBI），而mTBI以前被认为只产生有限和短暂的行为改变，没有长期的神经^{精神后果4，5}。现在人们认识到，mTBI恢复可能需要数周到⁵，⁶年，诱发更严重的神经系统疾病^4，甚至反复的"亚脑震荡"撞击也会影响大脑⁷。这是令人震惊的，因为曲棍球/>足球等运动的运动员每场比赛/练习赛有¹⁰ 次头部亚脑震荡冲击 7、⁸、^9、10。

青少年的mTBI发病率最高，在加拿大，每年约有十分之一的青少年会因运动相关的脑震荡而寻求医疗护理^11，12。实际上，任何亚脑震荡头部撞击或mTBI都会对大脑造成弥漫性损伤，这也可能为随后的伤害和/或更严重的神经系统疾病创造更脆弱的状态¹³，^14，15，^16，17。在加拿大，通过罗文定律在法律上承认，先前的损伤会增加大脑对进一步损伤的脆弱性¹⁸，但对r-mTBI的机制理解仍然严重不足。然而，很明显，单一和r-mTBI会影响学年的学习能力19，^20，具有性别特异性结果21，22，23，²⁴，并损害以后生活中的认知能力¹⁶，^25，26。事实上，队列分析将生命早期的r-mTBI与^27，28的后期痴呆密切相关。r-mTBI还可能与慢性创伤性脑病（CTE）有关，其特征是过度磷酸化tau蛋白的积累和进行性皮质萎缩，并由显着炎症诱发²⁷，²⁹，^30，31。尽管r-mTBI和CTE之间的联系目前存在争议³²，但该模型将允许在临床前环境中更详细地探索它们。

mTBI通常被描述为"看不见的损伤"，因为它发生在闭合的颅骨内，即使使用现代成像技术也很难检测到^33，34。mTBI的准确实验模型应遵循两个原则。首先，它应该概括通常在临床人群中观察到的生物力学力³⁵。其次，该模型应该诱导异质性行为结果，这在临床人群中也非常普遍³⁶，^37，38。目前，大多数临床前模型往往更严重，涉及开颅术、立体定位头枕、麻醉和控制皮质冲击（CCI），这些模型会产生明显的结构损伤和比临床上正常观察到的更广泛的行为缺陷³³。许多涉及开颅术的脑震荡临床前模型的另一个问题是，该程序本身会在大脑中产生炎症，这可能会加剧任何后续损伤引起的mTBI症状和神经病理学^39，40。麻醉还引入了几种复杂的混杂因素，包括减少炎症41，42，43，调节小胶质细胞功能⁴⁴，谷氨酸释放45，通过NMDA受体进入^Ca2+46，颅内压和脑代谢⁴⁷。麻醉通过增加血脑屏障 （BBB） 通透性、tau过度磷酸化和皮质类固醇水平进一步引入混杂，同时降低认知功能⁴⁸，⁴⁹，^50，51。此外，弥漫性闭头损伤占临床mTBI的绝大多数⁵²。它们还允许人们更好地研究可能影响行为结果的众多因素，包括性别²¹，年龄53，损伤间隔¹⁵，严重程度⁵⁴和受伤次数²³。

加速/减速力的方向（垂直或水平）也是行为和分子结果的重要考虑因素。Mychasiuk及其同事的研究比较了弥漫性闭头mTBI的两种模型:重量下降（垂直力）和横向冲击（水平力）⁵⁵。行为和分子分析均揭示了mTBI后异质的模型和性别依赖性结局。因此，有助于避免外科手术的动物模型，同时包含线性和旋转力，更能代表这些损伤通常发生的生理条件^33，56。ACHI模型是为了满足这一需求而创建的，允许在大鼠中快速和可重复地诱导mTBI，同时避免已知会偏向性别差异的程序（即麻醉）⁵⁷。

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研究方案

维多利亚大学动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会（CCAC）标准批准了所有动物程序。所有雄性Long-Evans大鼠都是在内部繁殖或购买的（见 材料表）。

1. 饲养和繁殖条件

1. 让动物适应其住房环境 1 周，然后在产后断奶日 （PND） 21.
2. 将大鼠保持在22.5°C±2.5°C的标准笼舍中， 随意获取食物 和水，在12小时的光照/黑暗循环中。
3. 将动物与两个或三个性别匹配的同窝伴侣分组和安置，并将它们随机分配到假或r-mTBI条件。
4. 在上午 7:30 至晚上 11:30 之间执行所有程序。

2. 清醒闭合性头部损伤程序的设置

1. 放置 2.75 英寸撞击器下方的低密度泡沫垫（100 cm x 15 cm x 7 cm），允许旋转头部移动。
   注意:泡沫垫的弹簧常数为 ~2，500 N/m，但可以在 3，100 和 5，600 N/m 之间变化⁵⁸.硬度水平（低、中、高）尚未显示可预测损伤结局⁵⁹.泡沫垫是一种非消耗性材料。它通常每年更换一次，或者如果弄脏或损坏。
2. 打开修改后的皮质冲击装置（图1A），并将速度设置为6 m / s。
   注意:这些规范旨在引起幼年和青少年大鼠的急性神经损伤，类似于mTBI的特征，但这些参数可能不适用于老年动物或其他物种（例如，小鼠或雪貂）。有关常见 ACHI 参数的回顾，请参阅⁶⁰。

3. 诱导mTBI

1. 当大鼠达到PND 24时，将它们移动到将进行手术的手术室。确保此房间与正常的住房环境分开。
2. 轻轻地将大鼠放在约束锥中，确保鼻子和鼻孔靠近锥体的小开口，以便充分通风。使用塑料发夹将锥体关闭在尾端，以防止将大鼠放入约束锥中后移动。
   1. 使用约束分数来记录动物对约束锥和 ACHI 程序的依从性或耐受性。
      注意:约束评分可用作动物压力的评估。因此，可以使用约束评分制定排除标准，以减少由于过度压力反应而引起的受试者之间的变异性。
      1. 根据动物进入锥体的意愿、它们的动作和发声给出 0 到 4 的分数。如果对约束没有阻力，则给 0 分，而 1 分对应于动物转身 1-2 倍并且几乎没有发声或蠕动。如果动物已经变成 2-3 倍并表现出一些发声或蠕动，则给 2 分。如果动物已经变成 5-10 倍并且表现出更多的发声和蠕动，则给予 3 分的约束分数。最后，如果动物的转身超过 10 倍，频繁发声和蠕动，则打 4 分。
         注意:此信息也在评分表本身（补充表S1 和 补充表S2）上。
3. 当大鼠被约束时，手动将头盔（图1B）放置在中线上，目标盘位于左顶叶上（图1C，D）。
4. 将大鼠放在泡沫垫上，手动将撞击器设置为伸展位置。手动降低撞击器尖端，使其与头盔上的瞄准盘接触。手动将冲击器设置为缩回位置，使撞击器在头盔上方 10 毫米处撤回。
5. 使用立体定位臂上的拨盘将冲击尖端降低 10 毫米，使其再次接触头盔上的瞄准盘。翻转 冲击 开关，使动物的头部以 6 m/s 的速度快速加速 10 毫米。
6. 激活设备后，立即将动物从约束锥中取出，并立即执行神经学评估方案 （NAP）。
   注意:对于当前的实验，该协议以2小时的间隔总共重复八次。

4.假损伤的诱导

1. 遵循上述第 3 节所述的所有实验程序，但将大鼠放置在冲击活塞路径附近，以免造成伤害。

5. 神经系统评估方案

注意:NAP可用于测量意识水平，以及认知和感觉运动功能。

1. 在基线和诱导mTBI或假损伤后立即，使用NAP评估大鼠，如^56，61中所述。在桌子上，将老鼠的家笼和一个相距 100 厘米的恢复笼子放在桌子上。将平衡木均匀地放在两个保持架的顶部。此外，在平衡木下方放置折叠毛巾或额外的缓冲物。
2. 如果需要，评估 意识水平。如果动物在mTBI后没有反应，通过使用秒表记录动物恢复呼吸和/或从仰卧位到俯卧位所需的时间，评估呼吸 暂停 （呼吸停止）和 纠正 反射的任何延迟。
   注意:ACHI模型很少出现扶正反射丧失和呼吸暂停，但偶尔可以在幼年动物中观察到。
3. 使用以下测试序列评估大鼠的 认知和感觉运动功能 。在意识评估后迅速连续进行这些测试。
   注意:如果没有观察到的行为缺陷，这四个测试的总和会产生满分 12 分的总分。赤字会减损这个分数。
   1. 惊吓反应
      1. 将大鼠放在空的恢复笼中，并在笼子上大声拍手（50厘米）。使用以下评分系统记录动物对噪音的反应:
         3 = 对声音的快速惊吓反应（例如，耳朵运动/抽搐、跳跃、全身冻结）。
         2 = 对声音反应缓慢或轻微冻结反应。
         1 = 仅观察到耳朵运动。
         0 = 对声音没有反应。
   2. 肢体伸展
      1. 将横梁（100 厘米长 x 2 厘米宽 x 0.75 厘米厚）水平放置在大鼠的家和恢复笼中，抓住老鼠的尾巴根部并将其握在横梁附近。确保老鼠离得足够近，以便能够轻松抓住它。使用以下评分系统评估大鼠将双肢伸展到横梁的能力:
         3 = 双前肢完全伸展并抓住横梁。
         2 = 只伸展一个肢体。
         1 = 前肢间歇性伸展或回缩。
         0 = 前肢跛行/无伸展。
   3. 横梁行走
      1. 将动物放在水平梁的中心，面向其家笼的 50 厘米标记处。确保光束在大鼠的家笼和恢复笼之间均匀间隔（相距~80厘米）。让老鼠走过横梁。使用以下评分系统评估大鼠的平衡和行走能力:
         3 = 在 10 秒内以不到两英尺的滑移成功穿过横梁。
         2 = 成功行走横梁，但观察到超过两脚滑倒。
         1 = 非机车运动，"游泳"运动。
         0 = 无法沿横梁行走或无法在 10 秒内移动。
   4. 旋转光束
      1. 将大鼠重新定位在横梁的中心，确保大鼠保持平衡。将光束抬到毛巾或软垫表面上方 80 厘米处，然后开始以每秒旋转一圈的速度手动旋转光束，持续 4 秒（总共旋转四次）。使用以下评分系统评估大鼠在旋转时保持在光束上的能力:
         3 = 老鼠在所有四次旋转中都留在光束上。
         2 = 老鼠落在第四次旋转时。
         1 = 老鼠落在第二次或第三次旋转时。
         0 = 老鼠在第一次旋转时掉落。
4. 完成NAP后，将mTBI和假鼠送回其家笼。根据需要重复 r-mTBI 程序。使用笼边监测清单（补充文件1）监测动物受伤后的健康状况。如果在笼边监测期间有任何异常迹象（任何评分不是N），则应使用头部撞击后的疼痛量表和高级监测清单（补充文件2）进行完整的疼痛评分。

6. 切片准备

注意:在目前的研究中，在mTBI后1天或7天评估r-mTBI后的动物的突触可塑性。在这些日子里，动物在献祭前被单独带到有盖笼子里的实验室。

1. 将制作海马切片所需的所有手术工具（图2A）冷藏（-20°C）过夜:标准剪刀，解剖剪刀，镊子，镊子，刮刀，刮刀和冷却块。
   注意:组织胶和培养室不应冷藏。
2. 制备含有125 mM NaCl，2.5 mM KCl，1.25 mM NaHPO 4，25 mM NaHCO₃，2 mM CaCl 2，1.3 mM MgCl 2和10 mM葡萄糖（300 ± 10 mOsm;pH 7.2-7.4）的人工脑脊液（aCSF）。
   注意:aCSF的主要溶液必须在方案期间连续用碳原（95%O 2 / 5% CO₂）鼓泡。
3. 在对动物实施安乐死（步骤6.8）之前，准备12.5mL琼脂糖。在 50 mL 锥形管中以 10 秒为增量微波，将 0.25 g 琼脂糖溶解在 12.5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 中。
4. 保持琼脂糖温暖（42°C）并在加热板中摇动以防止其凝固。
5. 在冰上设置切割站，包括一个培养皿和一个装满冰冷aCSF（4°C）的小烧杯（50mL）和一个翻倒的培养皿，上面有一张润湿的滤纸（图2A）。用碳原连续鼓泡小烧杯中的aCSF。
6. 将水浴加热至32°C。 用aCSF填充回收室，并用碳原连续鼓泡（图2B）。
7. 将动物运送到实验室。
8. 使用5%异氟醚作为吸入剂麻醉动物（直到缺乏戒断反射），然后使用小断头台迅速将其斩首。
9. 在装有冰冷（4°C）aCSF的培养皿中从颅骨中解剖大脑，将头骨浸没在aCSF中以帮助快速冷却组织。
   注意:此过程通常需要不到5分钟，但如果大脑浸没在冷冻的aCSF中，则脑切除的速度不是关键因素。
10. 将大脑放入冷藏和碳化aCSF的小烧杯中，以进一步清洁和冷却样品。
11. 将大脑移动到倒置的培养皿上，并将其放在滤纸上。使用锋利的手术刀去除小脑和前额叶皮层以"阻塞"大脑。通过切开大脑的中线来分隔两个半球。
    注意:以下协议一次执行一个半球。目前未准备好的半球必须浸没在冰冷（4°C）碳化aCSF的烧杯中。
12. 要创建横向海马切片，请将半球放在内侧表面上。将手术刀的刀片向内倾斜~30°，并从大脑的背面取下薄片，为大脑提供一个平坦的表面，以安装在切片机使用的活塞上。将大脑翻转到背表面，轻轻地将组织轻拍在干燥的滤纸上，以去除任何多余的aCSF。使用氰基丙烯酸酯胶水，将大脑的背表面附着在活塞上，使腹面直立。
    注意:确保胶水不会流过活塞的边缘，因为这会导致它粘附在用于容纳琼脂糖的金属管上并阻止活塞移动。
13. 将活塞的外管伸到大脑上，将液体琼脂糖倒入管中，直到大脑完全覆盖。通过在活塞管上夹紧冷却块来快速固化琼脂糖（图2A）。
14. 将活塞放入切片机的腔室中，并用螺钉固定腔室。固定刀片并将冰冷的含氧aCSF添加到切片机室中。
15. 在切片机（图2B）上，将切割速度设置为4，振荡设置为6，并将连续/单切片开关切换为连续。推动开始在400μm处开始切割大脑。
16. 当切片机切片大脑时，使用大直径巴斯德移液管将每个切片转移到切片的含氧aCSF恢复浴中（图2C）。
    注意:当每个切片被切割时，可以按顺序将其放置在回收浴的不同孔中。该协议通常产生六到八个切片，包含每个半球的海马体。大鼠图谱⁶² 可用于识别大鼠大脑中单个切片的背腹位置。
17. 让切片在32°C下恢复30分钟，然后在室温（23°C）下再恢复30分钟。
18. 重复这些步骤以从第二个半球创建切片。

7. 野外电生理学

注意:要从齿状回（DG）获取细胞外野记录，请执行以下步骤。在60分钟恢复后，单个海马切片已准备好进行细胞外野外记录。

1. 使用市售的微量移液器拉拔器，从外径为1.5 mm，内径为1.1 mm的10 cm硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出记录电极（1-2 MΩ）。
   注意:记录电极的电阻应为 ~1 MΩ，尖端尺寸应为 ~1 mm。电极参数的一致性对于良好的记录非常重要。
2. 打开用于记录的计算机和设备:放大器、数字化仪、刺激器、显微操纵器、温度调节器、显微镜灯和真空泵。
3. 用aCSF填充烧杯并将其连接到重力控制的灌注系统。打开灌注系统上的aCSF瓣膜，开始aCSF流经灌注室。保持大约 1 或 2 滴/秒或 2 毫升/分钟的流速。在电生理记录期间连续致碳化aCSF。
   注意:在现场记录期间，必须保持碳水化合物aCSF的恒定滴速。参比电极必须完全浸没在aCSF中。
4. 使用巴斯德移液管将海马切片从恢复浴转移到灌注室，灌注室连续灌注碳化aCSF并保持在30±0.5°C。 定向脑切片，使齿状回和颗粒细胞层在视野中可见。用弯曲的钢丝砝码稳定切片。启动计算机软件进行数据采集。
   注意:在此步骤中关闭真空泵以允许自由操作组织可能会有所帮助。这应该迅速完成，因为过多的操作会损坏组织。此外，如果这需要太多时间，灌注室可能会溢出aCSF。一旦组织正确定向并稳定，打开真空泵。
5. 使用正置显微镜用斜光学元件观察DG。定位同心双极刺激电极以激活分子层中间三分之一的内侧穿孔路径 （MPP） 纤维。然后，在MPP中放置一个充满aCSF的玻璃微量移液器（图3A，B）。从进一步分开的电极开始（即CA3附近的刺激电极和DG正上方的记录电极），因为触摸组织会对纤维造成损害。
   注意:最佳情况下，所有记录都应将电极与细胞层等距放置，相距约200μm。
6. 一旦刺激和记录电极被定位，使用放大器、数字化仪和记录软件可视化诱发场响应。
7. 要找到合适的场兴奋性突触后电位 （fEPSP），当用户精通寻找反应时，以 0.2 Hz（每 5 秒）以 0.12 ms 电流脉冲刺激组织，或者对于不太熟练的用户，以 0.067 Hz（每 15 秒）刺激组织以避免过度刺激。确保 fEPSP 的最小振幅为 0.7 mV，并且透明光纤凌空小于 fEPSP。
   注意:关键是将两个电极与电池层等距放置以获得最大的场响应，并且距离足够远（即~200μm）以产生小的光纤齐射。电极位置的小幅调整可能有助于增强响应幅度，但应将其保持在最低限度以避免组织损伤。
8. 通过增加刺激强度来确定最大 fEPSP 振幅，然后设置模拟强度，使 fEPSP 处于最大振幅的 70%。
   注意:长期抑郁 （LTD） 研究的最大振幅设置为 70%，长期增强 （LTP） 研究的最大振幅设置为 50%。最大振幅是通过调整刺激强度直到fEPSP不再增加振幅来确定的。对于最大幅度为2 mV的fEPSP，LTD研究的响应大小将调整为1.4 mV，LTP研究的响应大小调整为1.0 mV，以便fEPSP分别抑制或增强。
9. 建立稳定的预处理基线20分钟，以0.067 Hz提供0.12 ms脉冲。对于被视为稳定的切片，请查找 fEPSP 初始斜率中的 <10% 变异性，并且通过绘制的 fEPSP 斜率的最佳拟合线的斜率为 <0.5。当验证EPSP稳定20分钟时，继续记录的后续步骤。
   注意:可以将各种受体拮抗剂添加到aCSF中以阻断或增强LTD和LTP。如果需要，请确保切片在此基线期间暴露于这些药物，并满足稳定记录的要求。有关示例，请参阅⁶³，^64，65。
10. 首先，通过使用配对脉冲刺激和构建刺激-响应输入-输出曲线来确定基本突触特性的变化。对于配对脉冲测试，在 0.033 Hz 下应用一系列脉冲间隔为 50 ms 的配对脉冲。对于输入-输出曲线，在 0.033 Hz 下应用一系列 （10） 增加的激励强度 （0.0-0.24 ms） 以绘制 fEPSP 响应大小变化。
11. 要研究主要依赖于CB1受体⁶⁴，⁶⁶激活的LTD，请使用10 Hz协议（10 Hz时6^，000个脉冲）。此协议需要 10 分钟来管理。
12. 对于后处理记录，继续使用单脉冲刺激（0.12 ms，频率为 0.067 Hz）再持续 60 分钟。
13. 在后处理记录之后，再次施用配对脉冲刺激，然后是输入输出曲线。将这些与基线记录进行比较，以观察突触前释放特性的变化，并帮助评估切片的健康状况以进行长期记录。
14. 在分析过程中，在确定单个切片的数据是否应保留在突触可塑性数据集中时，应保守并遵守排除标准。排除在预处理基线（斜率 >0.5）、预处理基线不稳定（>10% 变化）和/或后处理期间不稳定（后处理 50-60 分钟内斜率 >1.5）中显示大斜率的切片。

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结果

清醒闭合头部损伤模型是在幼鼠中诱导r-mTBI的可行方法。使用ACHI模型暴露于r-mTBI的大鼠没有表现出明显的行为缺陷。这些实验中的受试者在r-mTBI手术过程中的任何时候都没有表现出右潜伏期或呼吸暂停，这表明这确实是一个轻微的TBI手术。在国家行动方案中确实出现了微妙的行为差异;如上所述，对大鼠的四个感觉运动任务（惊吓反应，肢体伸展，光束行走和旋转光束）进行评分，范围从0到3，其...

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讨论

大多数临床前研究都使用了mTBI模型，这些模型不能概括临床人群中观察到的生物力学力。在这里，展示了如何使用ACHI模型在幼年大鼠中诱导r-mTBI。这种封闭式 r-mTBI 模型比更具侵入性的手术具有显着优势。首先，ACHI通常不会导致颅骨骨折，脑出血或死亡，所有这些都是临床人群中"轻度"TBI的禁忌症⁶¹。其次，ACHI不需要使用开颅术，这很重要，因为已知它们会引起炎症反应，从而...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-printed helment			Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience)
Agarose	Fisher Scientific (BioReagents)	BP160500
Anesthesia chamber	Home Made	N/A	Plexiglass Container
Automatic Heater Controller	Warner Electric	TC-324B
Axon Digidata	Molecular Devices	1440A	Low-noise Data Acquisition System
Balance beam			Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride	Bio Basic Canada Inc.	CD0050	For aCSF
Camera	Dage MTI	NC-70
Carbogen tank	Praxair	MM OXCD5C-K	Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software	Molecular Devices	Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome	Precisionary	VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode	FHC Inc.	CBAPC75
Dextrose (D-Glucose)	Fisher Scientific (Chemical)	D16-3	aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier	Getting Instruments, Inc.	Model 4D
Disodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S373-500	PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade	Electron Microscopy Sciences	72002-10
Filter Paper	Whatman 1	1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Hair Claw Clip			Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages			Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator	Quest Scientific	726300
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath	Fisher Scientific	15-462-15
Leica Impact One CCI unit	Leica Biosystems		Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male	Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad			3" polyurethane foam sheet
Magnesium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	M33-500	aCSF
Male Long Evans Rats	Charles River Laboratories		Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices	Model 700B
pH Test Strips	VWR Chemicals BDH	BDH83931.601
Potassium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	P217-500	aCSF, PBS
Potassium Phosphate	Sigma	P9791-500G	PBS
Push Button Controller	Siskiyou Corporation	MC1000e	Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs	ELITechGroup	SS-033	For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific (Chemical)	S233-500	aCSF
Sodium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	S271-3	For aCSF, PBS
Sodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S369-500	aCSF
Soft Plastic Restraint Cones	Braintree Scientific	model DC-200
Stopwatch			Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges			For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament)	Sutter Instrument	BF150-110-10	Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope	Olympus	Olympus BX5OWI	5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer	Vapro	Model 5600	aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table	Kinetic Systems	9101-01-45