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Resumo

Aqui, é demonstrado como um modelo de traumatismo cranioencefálico fechado acordado pode ser usado para examinar os efeitos do traumatismo cranioencefálico leve repetido (r-mTBI) na plasticidade sináptica no hipocampo. O modelo replica características importantes do r-mTBI em pacientes e é usado em conjunto com a eletrofisiologia in vitro .

Resumo

Lesões cerebrais traumáticas leves (TCEm) são um problema de saúde prevalente na América do Norte. Há uma pressão crescente para utilizar modelos ecologicamente válidos de TCEm de cabeça fechada no contexto pré-clínico para aumentar a traduzibilidade para a população clínica. O modelo de lesão com cabeça fechada em vigília (ACHI) utiliza um impactor cortical controlado modificado para realizar o traumatismo cranioencefálico fechado, induzindo déficits comportamentais clinicamente relevantes sem a necessidade de craniotomia ou uso de anestésico.

Essa técnica normalmente não induz fatalidades, fraturas cranianas ou hemorragias cerebrais, e é mais consistente por ser uma lesão leve. De fato, a natureza leve do procedimento ACHI o torna ideal para estudos que investigam TCEm repetitivo (r-mTBI). Evidências crescentes indicam que o r-mTBI pode resultar em uma lesão cumulativa que produz sintomas comportamentais, alterações neuropatológicas e neurodegeneração. O r-mTBI é comum em jovens praticantes de esportes, e essas lesões ocorrem durante um período de robusta reorganização sináptica e mielinização, tornando a população mais jovem particularmente vulnerável às influências de longo prazo do r-mTBI.

Além disso, o r-mTBI ocorre em casos de violência por parceiro íntimo, uma condição para a qual há poucas medidas objetivas de rastreamento. Nesses experimentos, a função sináptica foi avaliada no hipocampo em ratos juvenis que haviam experimentado r-mTBI usando o modelo ACHI. Após as lesões, um fatiador de tecido foi utilizado para fazer cortes no hipocampo para avaliar a plasticidade sináptica bidirecional no hipocampo em 1 ou 7 dias após o r-mTBI. Em geral, o modelo ACHI fornece aos pesquisadores um modelo ecologicamente válido para estudar mudanças na plasticidade sináptica após mTBI e r-mTBI.

Introdução

O traumatismo cranioencefálico (TCE) é um importante problema de saúde, com ~2 milhões de casos no Canadá e nos Estados Unidos a cada ano 1,2. O TCE afeta todas as faixas etárias e gêneros e tem uma taxa de incidência maior do que qualquer outra doença, incluindo câncer de mama, AIDS, doença de Parkinson e esclerose múltipla3. Apesar da prevalência do TCE, sua fisiopatologia permanece pouco compreendida e as opções de tratamento são limitadas. Em parte, isso ocorre porque 85% de todos os TCEs são classificados como leves (mTBI), e acredita-se que o mTBI produza apenas mudanças comportamentais limitadas e transitórias, sem consequências neuropsiquiátricas de longoprazo4,5. Atualmente, reconhece-se que a recuperação do TCEm pode levar de semanas aanos5,6, precipitar quadros neurológicos mais graves4 e que mesmo repetidos impactos "subconcussivos" afetam o cérebro7. Isso é alarmante, pois atletas de esportes como hóquei/futebol têm >10 impactos subconcussivos na cabeça por jogo/sessão de treino7,8,9,10.

Os adolescentes têm a maior incidência de TCEm e, no Canadá, cerca de um em cada 10 adolescentes procura atendimento médico por concussão relacionada ao esporteanualmente 11,12. Na realidade, qualquer impacto subconcussivo da cabeça ou TCEm pode causar danos difusos ao cérebro, e isso também poderia criar um estado mais vulnerável para lesões subsequentes e/ou condições neurológicas mais graves 13,14,15,16,17. No Canadá, é reconhecido legalmente pela lei de Rowan que lesões prévias podem aumentar a vulnerabilidade do cérebro a novas lesões18, mas a compreensão mecanicista do r-mTBI permanece lamentavelmente inadequada. Está claro, no entanto, que o TCEm único e o r-mTBI podem afetar a capacidade de aprendizagem durante os anosescolares 19,20, ter resultados específicos por sexo 21,22,23,2 4 e prejudicar a capacidade cognitiva mais tarde na vida16,25,26. De fato, análises de coorte associam fortemente o r-mTBI no início da vida com demência mais tarde27,28. O r-mTBI também está potencialmente associado à encefalopatia traumática crônica (ETC), que é caracterizada pelo acúmulo de proteína tau hiperfosforilada e atrofia cortical progressiva e precipitada por inflamação significativa 27,29,30,31. Embora as ligações entre r-mTBI e CTE sejam atualmente controversas32, esse modelo permitirá que elas sejam exploradas em maior detalhe em um cenário pré-clínico.

O TCEm é frequentemente descrito como uma "lesão invisível", pois ocorre dentro de um crânio fechado e é difícil de detectar mesmo com técnicas modernas de imagem33,34. Um modelo experimental preciso de TCEm deve aderir a dois princípios. Primeiramente, deve-se recapitular as forças biomecânicas normalmente observadas na população clínica35. Em segundo lugar, o modelo deve induzir desfechos comportamentais heterogêneos, algo que também é altamente prevalente em populações clínicas36,37,38. Atualmente, a maioria dos modelos pré-clínicos tende a ser mais grave, envolvendo craniotomia, apoio cefálico estereotáxico, anestesia e impactos corticais controlados (ICC), que produzem danos estruturais significativos e déficits comportamentais mais extensos do que normalmente observados clinicamente33. Outra preocupação com muitos modelos pré-clínicos de concussão que envolvem craniotomias é que esse procedimento em si cria inflamação no cérebro, e isso pode exacerbar os sintomas de TCEm e neuropatologia de qualquer lesão subsequente39,40. A anestesia também introduz vários fatores de confusão complexos, incluindo a redução da inflamação 41,42,43, modulação da função microglial 44, liberação de glutamato45, entrada de Ca2+ através dos receptores NMDA 46, pressão intracraniana e metabolismo cerebral 47. A anestesia ainda introduz fatores de confusão, aumentando a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), a hiperfosforilação da tau e os níveis de corticosteroides, enquanto reduz a função cognitiva 48,49,50,51. Além disso, lesões difusas fechadas de cabeça representam a grande maioria dos TCEm clínicos52. Eles também permitem estudar melhor a multiplicidade de fatores que podem influenciar os desfechos comportamentais, incluindo sexo21, idade 53, intervalo interlesão15, gravidade54 e número de lesões23.

A direção das forças acelerativas/desacelerativas (verticais ou horizontais) também é uma consideração importante para os resultados comportamentais e moleculares. Pesquisas de Mychasiuk e colaboradores compararam dois modelos de TCEm difuso de cabeça fechada: queda de peso (forças verticais) e impacto lateral (forças horizontais)55. Tanto a análise comportamental quanto a molecular revelaram desfechos heterogêneos dependentes do modelo e do sexo após o TCEm. Assim, modelos animais que ajudam a evitar procedimentos cirúrgicos, ao mesmo tempo em que incorporam forças lineares e rotacionais, são mais representativos das condições fisiológicas sob as quais essas lesões normalmente ocorrem33,56. O modelo ACHI foi criado em resposta a essa necessidade, permitindo a indução rápida e reprodutível de TCEm em ratos, evitando procedimentos (i.e., anestesia) que sabidamente enviesam as diferenças entre ossexos 57.

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Protocolo

A aprovação para todos os procedimentos com animais foi fornecida pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Victoria em conformidade com as normas do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Todos os ratos machos Long-Evans foram criados internamente ou comprados (veja a Tabela de Materiais).

1. Condições de alojamento e de reprodução

  1. Permitir que os animais se aclimatem ao seu ambiente de alojamento por 1 semana antes do desmame no dia pós-natal (DPP) 21.
  2. Manter os ratos em alojamento de gaiola padrão a 22,5 °C ± 2,5 °C, com acesso ad libitum a comida e água, em um ciclo claro/escuro de 12 horas.
  3. Agrupe e abrigue os animais com dois ou três companheiros de ninhada pareados por sexo e atribua-os aleatoriamente a condições simuladas ou r-mTBI.
  4. Realize todos os procedimentos entre 7h30 e 23h30.

2. Configuração do procedimento de traumatismo cranioencefálico fechado acordado

  1. Posição a 2,75 pol. almofada de espuma de baixa densidade (100 cm x 15 cm x 7 cm) sob o pêndulo para permitir o movimento rotacional da cabeça.
    NOTA: A almofada de espuma tinha uma constante de mola de ~2.500 N/m, mas pode variar entre 3.100 e 5.600 N/m58. O nível de firmeza (baixa, média e alta) não se mostrou preditivo do desfecho da lesão59. A almofada de espuma é um material não consumível. Normalmente é substituído anualmente ou se sujo ou danificado.
  2. Ligue o dispositivo de impacto cortical modificado (Figura 1A) e ajuste a velocidade para 6 m/s.
    NOTA: Estas especificações são projetadas para provocar comprometimento neurológico agudo em ratos jovens e adolescentes que são análogos às características de um mTBI, mas tais parâmetros podem não ser adequados para animais mais velhos ou outras espécies (por exemplo, camundongos ou furões). Para uma revisão dos parâmetros ACHI comuns, consulte60.

3. Indução de TCEm

  1. Quando os ratos atingirem o PND 24, mova-os para a sala de procedimentos onde os procedimentos serão realizados. Certifique-se de que este quarto está separado do seu ambiente de alojamento normal.
  2. Coloque suavemente o rato em um cone de contenção, garantindo que o focinho e as narinas estejam próximos à pequena abertura do cone para permitir uma ventilação adequada. Use um grampo de cabelo plástico para manter o cone fechado na extremidade caudal para evitar o movimento uma vez que o rato é colocado no cone de retenção.
    1. Use escores de contenção para registrar a conformidade ou tolerância dos animais com o cone de contenção e o procedimento ACHI.
      NOTA: O escore de contenção pode ser utilizado como uma avaliação do estresse nos animais. Assim, critérios de exclusão podem ser desenvolvidos usando o escore de restrição para reduzir a variabilidade entre os sujeitos que surge devido a uma resposta excessiva ao estresse.
      1. Dê uma pontuação de 0 a 4 com base na disposição do animal de entrar no cone, seus movimentos e vocalizações. Dê uma pontuação de 0 se não houver resistência à contenção, enquanto uma pontuação de 1 corresponde ao animal girando de 1 a 2x e pouca ou nenhuma vocalização ou contorção. Dê uma pontuação de 2 se o animal virou 2-3x e exibe alguma vocalização ou esguicho. Dê uma pontuação de contenção de 3 se o animal virou 5-10x e exibe mais vocalizações e esguichos. Por fim, dê uma pontuação de 4 se o animal tiver virado mais de 10x com vocalizações frequentes e contorções.
        NOTA: Esta informação também está na própria folha de pontuação (Tabela Suplementar S1 e Tabela Suplementar S2).
  3. Enquanto o rato é contido, posicione manualmente o capacete (Figura 1B) sobre a linha média, com o disco de mira sobre o lobo parietal esquerdo (Figura 1C,D).
  4. Coloque o rato sobre a almofada de espuma e ajuste manualmente o pêndulo para a posição Estender. Abaixe manualmente a ponta do pêndulo para que ela entre em contato com o disco de mira no capacete. Ajuste manualmente o pêndulo para a posição Retract para fazer com que o pêndulo se retire 10 mm acima do capacete.
  5. Use o mostrador no braço estereotáxico para abaixar a ponta de impacto em 10 mm para que ele esteja novamente tocando o disco de mira no capacete. Vire o interruptor de impacto para que a cabeça do animal seja acelerada rapidamente por 10 mm a 6 m/s.
  6. Uma vez que o dispositivo tenha sido ativado, remova imediatamente o animal do cone de contenção e proceda à realização de um protocolo de avaliação neurológica imediata (NAP).
    OBS: Para os experimentos atuais, este protocolo foi repetido oito vezes no total em intervalos de 2 h.

4. Indução de lesão simulada

  1. Siga todos os procedimentos experimentais descritos acima na secção 3, mas coloque o rato adjacente ao caminho do pistão de impacto, para que não haja ferimentos.

5. Protocolo de avaliação neurológica

NOTA: O NAP pode ser usado para medir o nível de consciência, bem como o funcionamento cognitivo e sensório-motor.

  1. No início do estudo e imediatamente após a indução do TCEm ou lesão simulada, avaliar os ratos usando o NAP conforme descrito em56,61. Em uma mesa, coloque a gaiola de casa dos ratos e uma gaiola de recuperação espaçada de 100 cm entre si. Centralize uniformemente a viga de equilíbrio no topo de ambas as gaiolas. Além disso, coloque uma toalha dobrada ou amortecimento adicional sob a viga de equilíbrio.
  2. Se necessário, avalie o nível de consciência. Se os animais não responderem após o TCEm, avalie a apneia (cessação da respiração) e qualquer atraso no reflexo de retificação usando um cronômetro para registrar o tempo necessário para que o animal retome a respiração e/ou se ajeite de um decúbito dorsal para a posição prona.
    NOTA: A perda do reflexo de endireitamento e a apneia são raras com o modelo ACHI, mas ocasionalmente podem ser observadas em animais juvenis.
  3. Avaliar a função cognitiva e sensório-motora do rato utilizando a seguinte sequência de testes. Administrar esses testes rapidamente em sucessão, após a avaliação da consciência.
    NOTA: A soma desses quatro testes produz uma pontuação total de 12, se não houver déficits comportamentais observados. Déficits prejudicam essa pontuação.
    1. Resposta de sobressalto
      1. Coloque o rato na gaiola de recuperação vazia e bata palmas em voz alta (50 cm) sobre a gaiola. Registrar a resposta do animal ao ruído utilizando o seguinte sistema de pontuação:
        3 = Reação rápida de sobressalto ao som (por exemplo, movimento do ouvido/contrações, salto, congelamento do corpo inteiro).
        2 = Reação lenta ou leve reação de congelamento ao som.
        1 = Somente os movimentos de orelha observados.
        0 = Sem reação ao som.
    2. Extensão do membro
      1. Com o feixe (100 cm de comprimento x 2 cm de largura x 0,75 cm de espessura) posicionado horizontalmente sobre a casa do rato e gaiolas de recuperação, pegue o rato pela base da cauda e segure-o perto da viga. Certifique-se de que o rato está perto o suficiente para ser capaz de agarrá-lo facilmente. Avalie a capacidade do rato de estender ambos os membros até a trave com o seguinte sistema de pontuação:
        3 = Extensão total de ambos os membros anteriores e preensão da trave.
        2 = Apenas um membro está estendido.
        1 = Extensão intermitente ou retração dos membros torácicos.
        0 = Os membros anteriores estão moles/sem extensão.
    3. Caminhada do feixe
      1. Coloque o animal no centro da viga horizontal na marca de 50 cm voltada para sua gaiola de origem. Certifique-se de que o feixe esteja espaçado igualmente entre a gaiola de casa do rato e a gaiola de recuperação (colocada a ~80 cm de distância). Permita que o rato caminhe pela trave. Avalie a capacidade do rato de equilibrar e andar com o seguinte sistema de pontuação:
        3 = Atravessa com sucesso a viga com menos de dois deslizamentos de pé dentro de 10 s.
        2 = Anda a viga com sucesso, mas observam-se mais de dois deslizamentos nos pés.
        1 = Movimento não locomotor, movimento de natação.
        0 = Incapaz de caminhar ao longo da viga ou incapaz de se mover dentro de 10 s.
    4. Feixe rotativo
      1. Reposicione o rato no centro da viga, garantindo que o rato esteja equilibrado. Levante o feixe 80 cm acima de uma toalha ou superfície acolchoada e comece a girar manualmente o feixe a uma taxa de uma rotação por segundo por 4 s (um total de quatro rotações). Avalie a capacidade do rato de permanecer na viga enquanto ela gira com o seguinte sistema de pontuação:
        3 = Rato permanece na viga para as quatro rotações.
        2 = Rato cai na quarta rotação.
        1 = Rato cai na segunda ou terceira rotação.
        0 = Queda de rato durante a primeira rotação.
  4. Após a conclusão do NAP, devolva mTBI e ratos simulados para suas gaiolas domésticas. Repita conforme necessário para procedimentos de r-mTBI. Monitore o bem-estar dos animais após lesões com a Lista de Verificação de Monitoramento do lado da gaiola (Arquivo Suplementar 1). Se houver qualquer indício de anormalidade (qualquer escore que não seja N) durante a monitorização do lado da gaiola, um escore completo de dor deve ser obtido com a Escala de Dor e a Lista de Verificação de Monitorização Avançada após o Impacto da Cabeça (Arquivo Suplementar 2).

6. Preparo da fatia

NOTA: No presente estudo, a plasticidade sináptica foi avaliada em animais após r-mTBI em 1 ou 7 dias após mTBI. Nesses dias, os animais foram trazidos individualmente para o laboratório em gaiolas cobertas antes do sacrifício.

  1. Refrigerar (-20 °C) durante a noite todas as ferramentas cirúrgicas (Figura 2A) necessárias para fazer cortes no hipocampo: tesoura padrão, tesoura dissecante, pinças, rongeurs, espátulas e bloco de refrigeração.
    NOTA: A cola de tecido e a câmara de incubação não devem ser refrigeradas.
  2. Preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) contendo 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO 4, 25 mM NaHCO 3, 2 mM CaCl 2,1,3 mM MgCl 2 e 10 mM dextrose (300 ± 10 mOsm; pH 7,2-7,4).
    NOTA: A solução principal de aCSF deve ser continuamente borbulhada com carbogênio (95% O 2/5% CO2) durante a duração do protocolo.
  3. Antes da eutanásia do animal (passo 6.8), preparar 12,5 ml de agarose. Dissolver 0,25 g de agarose em 12,5 mL de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) por micro-ondas em um tubo cônico de 50 mL em incrementos de 10 s.
  4. Mantenha a agarose quente (42 °C) e agite numa placa de aquecimento para evitar que se solidifique.
  5. Montar uma estação de corte no gelo, incluindo uma placa de Petri e um copo pequeno (50 mL) preenchido com aCSF gelado (4 °C) e uma placa de Petri revirada com um pedaço de papel de filtro molhado por cima (Figura 2A). Borbulhar continuamente o aCSF no copo pequeno com carbogênio.
  6. Aqueça o banho-maria a 32 °C. Preencher a câmara de recuperação com aCSF e borbulhar continuamente com carbogênio (Figura 2B).
  7. Transportar o animal para a sala de experimentação.
  8. Anestesiar o animal utilizando isoflurano a 5% como inalante (até a ausência de reflexo de retirada) e depois decapitá-lo rapidamente com uma pequena guilhotina.
  9. Dissecar o cérebro do crânio na placa de Petri cheia de aCSF gelado (4 °C), mantendo o crânio submerso no aCSF para ajudar a resfriar rapidamente o tecido.
    NOTA: Este procedimento normalmente requer menos de 5 minutos, mas a velocidade de remoção do cérebro não é um fator crítico se o cérebro estiver submerso em aCSF refrigerado.
  10. Coloque o cérebro no pequeno copo de aCSF resfriado e carbogenado, para limpar e resfriar ainda mais a amostra.
  11. Mova o cérebro para a placa de Petri de cabeça para baixo e coloque-a sobre o papel de filtro. Use um bisturi afiado para remover o cerebelo e o córtex pré-frontal para "bloquear" o cérebro. Separe os dois hemisférios fazendo um corte na linha média do cérebro.
    NOTA: O seguinte protocolo é realizado um hemisfério de cada vez. É imperativo que o hemisfério que não está sendo preparado atualmente permaneça submerso no copo de aCSF carbogenado, gelado (4 °C).
  12. Para criar fatias transversais do hipocampo, coloque o hemisfério na superfície medial. Incline a lâmina de um bisturi a ~30° para dentro e remova uma fatia fina da superfície dorsal do cérebro para fornecer uma superfície plana para o cérebro a ser montado no pistão usado pelo fatiador. Vire o cérebro para a superfície dorsal e passe suavemente o tecido em papel de filtro seco para remover qualquer excesso de aCSF. Usando cola de cianoacrilato, fixe a superfície dorsal do cérebro ao pistão, deixando a superfície ventral ereta.
    NOTA: Certifique-se de que a cola não passe sobre a borda do pistão, pois isso fará com que ela adera ao tubo de metal usado para conter a agarose e impedir o movimento do pistão.
  13. Estenda o tubo externo do pistão sobre o cérebro e despeje a agarose líquida no tubo até que o cérebro esteja completamente coberto. Solidifique rapidamente a agarose apertando um bloco de refrigeração sobre o tubo do pistão (Figura 2A).
  14. Posicione o pistão na câmara da fatiadora e prenda a câmara com um parafuso. Fixe a lâmina e adicione aCSF gelado e oxigenado à câmara de fatiamento.
  15. Na segmentação de dados (Figura 2B), defina a velocidade de corte para 4, a oscilação para 6 e alterne o interruptor de fatiamento contínuo/simples para contínuo. Empurre começar a seccionar o cérebro a 400 μm.
  16. À medida que o cortador separa o cérebro, use uma pipeta de Pasteur de grande diâmetro para transferir cada corte para o banho de recuperação do aCSF oxigenado à medida que é seccionado (Figura 2C).
    NOTA: Como cada fatia é cortada, ela pode ser colocada sequencialmente nos diferentes poços do banho de recuperação. Esse protocolo geralmente produz entre seis e oito fatias, contendo o hipocampo para cada hemisfério. Um atlas62 de ratos pode ser usado para identificar a posição dorso-ventral de fatias individuais no cérebro de ratos.
  17. Deixe as fatias recuperarem a 32 °C durante 30 min e depois deixe recuperar durante mais 30 min à temperatura ambiente (23 °C).
  18. Repita essas etapas para criar fatias do segundo hemisfério.

7. Eletrofisiologia de campo

NOTA: Para adquirir registros de campo extracelular do giro denteado (GD), execute as seguintes etapas. Após a recuperação de 60 min, os cortes individuais do hipocampo estão prontos para registros de campo extracelular.

  1. Usando um puxador de micropipetas comercialmente disponível, puxar eletrodos de gravação (1-2 MΩ) de capilares de vidro borossilicato de 10 cm com diâmetro externo de 1,5 mm e diâmetro interno de 1,1 mm.
    NOTA: O eletrodo de gravação deve ter uma resistência de ~1 MΩ e as pontas devem ter ~1 mm de tamanho. A consistência nos parâmetros dos eletrodos é importante para bons registros.
  2. Ligue o computador e os equipamentos a serem utilizados para gravações: amplificador, digitalizador, estimulador, micromanipulador, regulador de temperatura, luz do microscópio e bomba de vácuo.
  3. Encha um copo com aCSF e conecte-o a um sistema de perfusão controlado por gravidade. Abra a válvula do aCSF no sistema de perfusão para iniciar um fluxo de aCSF através da câmara de perfusão. Manter um fluxo de aproximadamente um ou dois gotejamentos/s ou 2 mL/min. Carbogenato contínuo aCSF durante a duração dos registros eletrofisiológicos.
    NOTA: É imperativo manter uma taxa de gotejamento constante de aCSF carbogenado, durante os registros de campo. Também é imperativo que o eletrodo de referência esteja completamente submerso em aCSF.
  4. Use uma pipeta de Pasteur para transferir um corte hipocampal do banho de recuperação para a câmara de perfusão que é continuamente perfundida com aCSF carbogenado, mantida a 30 ± 0,5 °C. Orientar a fatia cerebral de modo que o giro denteado e a camada de células granulares sejam visíveis no campo de visão. Estabilize a fatia com pesos de fio dobrados. Inicie o software de computador para aquisição de dados.
    NOTA: Pode ser útil desligar a bomba de vácuo durante esta etapa para permitir a manipulação livre do tecido. Isso deve ser feito rapidamente, pois muita manipulação pode danificar o tecido. Além disso, a câmara de perfusão pode transbordar com aCSF se isso levar muito tempo. Assim que o tecido estiver devidamente orientado e estabilizado, ligue a bomba de vácuo.
  5. Use um microscópio vertical para visualizar o GD com óptica oblíqua. Posicionar um eletrodo estimulador bipolar concêntrico para ativar as fibras do caminho perfurante medial (MPP) no terço médio da camada molecular. Em seguida, posicione uma micropipeta de vidro, preenchida com aCSF no MPP (Figura 3A,B). Comece com os eletrodos mais afastados (ou seja, o eletrodo estimulador próximo ao CA3 e o eletrodo de gravação logo acima do geno do GD), pois tocar o tecido causará danos às fibras.
    NOTA: Idealmente, todos os registros devem ter os eletrodos colocados equidistantes da camada celular, a aproximadamente 200 μm de distância.
  6. Uma vez posicionados os eletrodos de estimulação e gravação, visualize as respostas do campo evocado usando um amplificador, um digitalizador e um software de gravação.
  7. Para encontrar um potencial pós-sináptico excitatório de campo adequado (fEPSP), estimule o tecido com pulsos de corrente de 0,12 ms a 0,2 Hz (a cada 5 s) quando o usuário é proficiente em encontrar respostas, ou a 0,067 Hz (a cada 15 s) para usuários menos proficientes para evitar superestimulação. Certifique-se de que o fEPSP tenha uma amplitude mínima de 0,7 mV com uma fibra transparente menor que o fEPSP.
    NOTA: É fundamental posicionar ambos os eletrodos equidistantes da camada celular para obter respostas de campo máximo e distantes o suficiente (ou seja, ~200 μm) para gerar uma pequena fibra voleio. Pequenos ajustes na posição dos eletrodos podem ajudar a aumentar a amplitude da resposta, embora estes devam ser mantidos ao mínimo para evitar danos teciduais.
  8. Determinar a amplitude máxima da fEPSP aumentando a intensidade da estimulação e, em seguida, definir a intensidade de simulação para que a fEPSP esteja a 70% da amplitude máxima.
    NOTA: A amplitude máxima é definida para 70% para estudos de depressão de longo prazo (LTD) e para 50% para estudos de potenciação de longo prazo (LTP). A amplitude máxima é determinada ajustando-se a força de estimulação até que a fEPSP não aumente mais em amplitude. Para uma fEPSP com amplitude máxima de 2 mV, o tamanho da resposta seria então ajustado para 1,4 mV para estudos de LTD e 1,0 mV para estudos de LTP, para dar espaço para a fEPSP deprimir ou potencializar (respectivamente).
  9. Estabelecer uma linha de base de pré-condicionamento estável por 20 min com pulsos de 0,12 ms entregues a 0,067 Hz. Para que as fatias sejam consideradas estáveis, procure <10% de variabilidade na inclinação inicial da fEPSP e que a inclinação da linha de melhor ajuste através das inclinações fEPSP plotadas seja <0,5. Prossiga com as próximas etapas da gravação quando os EPSPs forem verificados como estáveis por 20 min.
    NOTA: Vários antagonistas do receptor podem ser adicionados ao aCSF para bloquear ou melhorar LTD e LTP. Se forem necessários, certifique-se de que as fatias estão expostas a estes agentes farmacológicos durante este período de referência e de que os requisitos para registos estáveis são cumpridos. Para exemplos, ver63,64,65.
  10. Primeiro, determine mudanças nas propriedades sinápticas básicas usando estímulos de pulso pareado e construindo curvas de entrada-saída estímulo-resposta. Para o teste de pulso pareado, aplicar uma série de pulsos pareados com intervalo interpulso de 50 ms a 0,033 Hz. Para as curvas de entrada-saída, aplicar uma série (10) de intensidades crescentes de estímulo (0,0-0,24 ms) a 0,033 Hz para plotar a mudança no tamanho da resposta fEPSP.
  11. Para estudar a LTD que é primariamente dependente da ativação dos receptores CB164,66, empregamos um protocolo de 10 Hz (6.000 pulsos a 10 Hz). Este protocolo leva 10 minutos para ser administrado.
  12. Para gravações pós-condicionamento, retomar o uso de estimulação de pulso único (0,12 ms a uma frequência de 0,067 Hz) por mais 60 min.
  13. Após o registro do pós-condicionamento, administrar novamente os estímulos de pulso pareado, seguidos de uma curva de entrada-saída. Compare-os com registros de linha de base para observar alterações nas propriedades de liberação pré-sináptica e ajudar a avaliar a saúde da fatia para gravações de longo prazo.
  14. Durante a análise, seja conservador e siga os critérios de exclusão ao determinar se os dados de fatias individuais devem ser retidos no conjunto de dados de plasticidade sináptica. Excluir fatias que apresentem uma grande inclinação em uma linha de melhor ajuste das inclinações fEPSP durante a linha de base de pré-condicionamento (inclinação >0,5), instabilidade na linha de base de pré-condicionamento (>10% de mudança) e ou instabilidade no período de pós-condicionamento (inclinação >1,5 em 50-60 min de pós-condicionamento).

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Resultados

O modelo de traumatismo cranioencefálico fechado acordado é um método viável de indução de r-mTBI em ratos jovens. Ratos expostos ao r-mTBI com o modelo ACHI não apresentaram déficits comportamentais evidentes. Os indivíduos nesses experimentos não apresentaram latência para direita ou apneia em nenhum momento durante o procedimento de r-mTBI, indicando que este foi realmente um procedimento de TCE leve. Diferenças comportamentais sutis emergiram no PNA; Como descrito acima, os ratos foram pontuados em quatro...

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Discussão

A maioria das pesquisas pré-clínicas tem utilizado modelos de TCEm que não recapitulam as forças biomecânicas observadas na população clínica. Aqui, mostra-se como o modelo ACHI pode ser usado para induzir r-mTBIs em ratos juvenis. Esse modelo fechado de r-mTBI apresenta vantagens significativas em relação aos procedimentos mais invasivos. Primeiro, o IHAC normalmente não causa fraturas cranianas, hemorragias cerebrais ou mortes, o que seria contraindicação de TCE "leve" em populações clínicas

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos a todos os membros do Laboratório Christie da Universidade de Victoria, do passado e do presente, por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo. Este projeto foi apoiado com fundos dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR: FRN 175042) e NSERC (RGPIN-06104-2019). O gráfico do crânio da Figura 1 foi criado com o BioRender.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
3D-printed helment Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose Fisher Scientific (BioReagents)BP160500
Anesthesia chamberHome MadeN/APlexiglass Container
Automatic Heater ControllerWarner ElectricTC-324B
Axon DigidataMolecular Devices1440ALow-noise Data Acquisition System
Balance beam Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium ChlorideBio Basic Canada Inc. CD0050For aCSF
CameraDage MTINC-70
Carbogen tankPraxairMM OXCD5C-KCarbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex SoftwareMolecular DevicesClampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating MicrotomePrecisionaryVF 310-0Z
Concentric Bipolar ElectrodeFHC Inc.CBAPC75
Dextrose (D-Glucose)Fisher Scientific (Chemical)D16-3aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier  Getting Instruments, Inc. Model 4D
Disodium PhosphateFisher Scientific (Chemical)S373-500PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge BladeElectron Microscopy Sciences72002-10
Filter PaperWhatman 11001-055
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentP-1000
Hair Claw ClipCan be obtained from any department store
Home and Recovery CagesNormal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise EliminatorQuest Scientific 726300
Isoflurane USPFresenius KabiCP0406V2
Isotemp 215 Digital Water BathFisher Scientific 15-462-15
Leica Impact One CCI unitLeica BiosystemsTip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, maleCharles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad3" polyurethane foam sheet 
Magnesium ChlorideFisher Scientific (Chemical)M33-500aCSF
Male Long Evans RatsCharles River LaboratoriesAnimals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B AmplifierMolecular DevicesModel 700B
pH Test StripsVWR Chemicals BDHBDH83931.601
Potassium ChlorideFisher Scientific (Chemical)P217-500aCSF, PBS
Potassium PhosphateSigmaP9791-500GPBS
Push Button ControllerSiskiyou Corporation MC1000eFour-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample DiscsELITechGroupSS-033For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium BicarbonateFisher Scientific (Chemical)S233-500aCSF
Sodium ChlorideFisher Scientific (Chemical)S271-3For aCSF, PBS
Sodium PhosphateFisher Scientific (Chemical)S369-500aCSF
Soft Plastic Restraint ConesBraintree Scientificmodel DC-200
StopwatchMany lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament)Sutter InstrumentBF150-110-10Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright MicroscopeOlympusOlympus BX5OWI5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure OsmometerVaproModel 5600aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive3M1469SB
Vibraplane Vibration Isolation TableKinetic Systems9101-01-45

Referências

  1. Fu, T. S., Jing, R., McFaull, S. R., Cusimano, M. D. Health & economic burden of traumatic brain injury in the emergency department. Canadian Journal of Neurological Sciences. 43 (2), 238-247 (2016).
  2. Chen, C., Peng, J., Sribnick, E., Zhu, M., Xiang, H. Trend of age-adjusted rates of pediatric traumatic brain injury in US emergency departments from 2006 to 2013. International journal of environmental research and public health. 15 (6), 1171(2018).
  3. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models & Mechanisms. 6 (6), 1307-1315 (2013).
  4. Mayer, A. R., Quinn, D. K., Master, C. L. The spectrum of mild traumatic brain injury: a review. Neurology. 89 (6), 623-632 (2017).
  5. Kara, S., et al. Less than half of patients recover within 2 weeks of injury after a sports-related mild traumatic brain injury: a 2-year prospective study. Clinical Journal of Sport Medicine. 30 (2), 96-101 (2020).
  6. Chung, A. W., Mannix, R., Feldman, H. A., Grant, P. E., Im, K. Longitudinal structural connectomic and rich-club analysis in adolescent mTBI reveals persistent, distributed brain alterations acutely through to one year post-injury. arXiv. , (2019).
  7. Crisco, J. J., et al. Frequency and location of head impact exposures in individual collegiate football players. Journal of Athletic Training. 45 (6), 549-559 (2010).
  8. Wilcox, B. J., et al. Head impact exposure in male and female collegiate ice hockey players. Journal of Biomechanics. 47 (1), 109-114 (2014).
  9. Daniel, R. W., Rowson, S., Duma, S. M. Head impact exposure in youth football. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 976-981 (2012).
  10. Snowden, T., et al. Heading in the right direction: a critical review of studies examining the effects of heading in soccer players. Journal of Neurotrauma. 38 (2), 169-188 (2021).
  11. Zemek, R. L., et al. Annual and seasonal trends in ambulatory visits for pediatric concussion in Ontario between 2003 and 2013. The Journal of Pediatrics. 181, 222-228 (2017).
  12. Zhang, A. L., Sing, D. C., Rugg, C. M., Feeley, B. T., Senter, C. The rise of concussions in the adolescent population. Orthopaedic Journal of Sports Medicine. 4 (8), (2016).
  13. Broglio, S. P., Eckner, J. T., Paulson, H. L., Kutcher, J. S. Cognitive decline and aging: the role of concussive and subconcussive impacts. Exercise and Sport Sciences Reviews. 40 (3), 138(2012).
  14. Greco, T., Ferguson, L., Giza, C., Prins, M. Mechanisms underlying vulnerabilities after repeat mild traumatic brain injuries. Experimental Neurology. 317, 206-213 (2019).
  15. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  16. Snowden, T. M., Hinde, A. K., Reid, H. M., Christie, B. R. Does mild traumatic brain injury increase the risk for dementia? A systematic review and meta-analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 78 (2), 757-775 (2020).
  17. Guskiewicz, K. M., et al. Association between recurrent concussion and late-life cognitive impairment in retired professional football players. Neurosurgery. 57 (4), 719-726 (2005).
  18. McCradden, M. D., Cusimano, M. D. Staying true to Rowan's Law: how changing sport culture can realize the goal of the legislation. Canadian Journal of Public Health. 110 (2), 165-168 (2019).
  19. Carson, J. D., et al. Premature return to play and return to learn after a sport-related concussion: physician's chart review. Canadian Family Physician. 60 (6), 310-315 (2014).
  20. McClincy, M. P., Lovell, M. R., Pardini, J., Collins, M. W., Spore, M. K. Recovery from sports concussion in high school and collegiate athletes. Brain Injury. 20 (1), 33-39 (2006).
  21. Covassin, T., Savage, J. L., Bretzin, A. C., Fox, M. E. Sex differences in sport-related concussion long-term outcomes. International Journal of Psychophysiology. 132, 9-13 (2018).
  22. Frommer, L., et al. Sex differences in concussion symptoms of high school athletes. Journal of Athletic Training. 46 (1), 76-84 (2011).
  23. Wright, D., O'Brien, T., Shultz, S. R., Mychasiuk, R. Sex matters: Repetitive mild traumatic brain injury in adolescent rats. Annals of Clinical and Translational Neurology. 4 (9), 640-654 (2017).
  24. Stone, S., Lee, B., Garrison, J. C., Blueitt, D., Creed, K. Sex differences in time to return-to-play progression after sport-related concussion. Sports Health. 9 (1), 41-44 (2017).
  25. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'Grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: a systematic review. Journal of Athletic Training. 55 (2), 132-158 (2020).
  26. Montenigro, P. H., et al. Cumulative head impact exposure predicts later-life depression, apathy, executive dysfunction, and cognitive impairment in former high school and college football players. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 328-340 (2017).
  27. Lee, E. B., et al. Chronic traumatic encephalopathy is a common co-morbidity, but less frequent primary dementia in former soccer and rugby players. Acta Neuropathologica. 138 (3), 389-399 (2019).
  28. Di Virgilio, T. G., et al. Evidence for acute electrophysiological and cognitive changes following routine soccer heading. EBioMedicine. 13, 66-71 (2016).
  29. Cherry, J. D., et al. Microglial neuroinflammation contributes to tau accumulation in chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 1-9 (2016).
  30. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI: substrates of dementia. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 211(2013).
  31. Coughlin, J. M., et al. Neuroinflammation and brain atrophy in former NFL players: an in vivo multimodal imaging pilot study. Neurobiology of Disease. 74, 58-65 (2015).
  32. Wu, L., et al. Repetitive mild closed head injury in adolescent mice is associated with impaired proteostasis, neuroinflammation, and tauopathy. Journal of Neuroscience. 42 (12), 2418-2432 (2022).
  33. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  34. Sharp, D. J., Jenkins, P. O. Concussion is confusing us all. Practical Neurology. 15 (3), 172-186 (2015).
  35. Chen, Y., Huang, W., Constantini, S. The differences between blast-induced and sports-related brain injuries. Frontiers in Neurology. 4, 119(2013).
  36. Collins, M. W., Kontos, A. P., Reynolds, E., Murawski, C. D., Fu, F. H. A comprehensive, targeted approach to the clinical care of athletes following sport-related concussion. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 22 (2), 235-246 (2014).
  37. Hiploylee, C., et al. Longitudinal study of postconcussion syndrome: not everyone recovers. Journal of Neurotrauma. 34 (8), 1511-1523 (2017).
  38. Rabinowitz, A. R., Fisher, A. J. Person-specific methods for characterizing the course and temporal dynamics of concussion symptomatology: a pilot study. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  39. Shultz, S. R., et al. Tibial fracture exacerbates traumatic brain injury outcomes and neuroinflammation in a novel mouse model of multitrauma. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (8), 1339-1347 (2015).
  40. McDonald, S. J., Sun, M., Agoston, D. V., Shultz, S. R. The effect of concomitant peripheral injury on traumatic brain injury pathobiology and outcome. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 1-14 (2016).
  41. Statler, K. D., et al. Isoflurane exerts neuroprotective actions at or near the time of severe traumatic brain injury. Brain Research. 1076 (1), 216-224 (2006).
  42. Rowe, R. K., et al. Using anesthetics and analgesics in experimental traumatic brain injury. Lab Animal. 42 (8), 286-291 (2013).
  43. Luh, C., et al. Influence of a brief episode of anesthesia during the induction of experimental brain trauma on secondary brain damage and inflammation. PLoS One. 6 (5), 19948(2011).
  44. Madry, C., et al. Microglial ramification, surveillance, and interleukin-1β release are regulated by the two-pore domain K+ channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  45. Patel, P. M., Drummond, J. C., Cole, D. J., Goskowicz, R. L. Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to forebrain ischemia. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 82 (4), 996-1003 (1995).
  46. Gray, J. J., Bickler, P. E., Fahlman, C. S., Zhan, X., Schuyler, J. A. Isoflurane neuroprotection in hypoxic hippocampal slice cultures involves increases in intracellular Ca2+ and mitogen-activated protein kinases. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 102 (3), 606-615 (2005).
  47. Flower, O., Hellings, S. Sedation in traumatic brain injury. Emergency Medicine International. 2012, 637171(2012).
  48. Wagner, M., Ryu, Y. K., Smith, S. C., Mintz, C. D. Effects of anesthetics on brain circuit formation. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 26 (4), 358(2014).
  49. Leikas, J. V., et al. Brief isoflurane anesthesia regulates striatal AKT-GSK3β signaling and ameliorates motor deficits in a rat model of early-stage Parkinson′ s disease. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 456-463 (2017).
  50. Turek, Z., Sykora, R., Matejovic, M., Cerny, V. Anesthesia and the microcirculation. in Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. , Sage CA. Los Angeles, CA. 249-258 (2009).
  51. Yang, S., et al. Anesthesia and surgery impair blood-brain barrier and cognitive function in mice. Frontiers in Immunology. 8, 902(2017).
  52. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  53. Mannix, R., et al. Adolescent mice demonstrate a distinct pattern of injury after repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 495-504 (2017).
  54. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Säljö, A. Evaluation of three animal models for concussion and serious brain injury. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 213-226 (2012).
  55. Mychasiuk, R., Hehar, H., Candy, S., Ma, I., Esser, M. J. The direction of the acceleration and rotational forces associated with mild traumatic brain injury in rodents effect behavioural and molecular outcomes. Journal of Neuroscience Methods. 257, 168-178 (2016).
  56. Christie, B. R., et al. A rapid neurological assessment protocol for repeated mild traumatic brain injury in awake rats. Current Protocols in Neuroscience. 89 (1), 80(2019).
  57. Buchanan, F. F., Myles, P. S., Leslie, K., Forbes, A., Cicuttini, F. Gender and recovery after general anesthesia combined with neuromuscular blocking drugs. Anesthesia & Analgesia. 102 (1), 291-297 (2006).
  58. Zhang, L., Gurao, M., Yang, K. H., King, A. I. Material characterization and computer model simulation of low density polyurethane foam used in a rodent traumatic brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 93-98 (2011).
  59. Kikinis, Z., et al. Diffusion imaging of mild traumatic brain injury in the impact accelerated rodent model: A pilot study. Brain Injury. 31 (10), 1376-1381 (2017).
  60. Talty, C. -E., Norris, C., VandeVord, P. Defining experimental variability in actuator-driven closed head impact in rats. Annals of Biomedical Engineering. 50 (10), 1187-1202 (2022).
  61. Meconi, A., et al. Repeated mild traumatic brain injury can cause acute neurologic impairment without overt structural damage in juvenile rats. Plos One. 13 (5), (2018).
  62. Zilles, K. The Cortex of the Rat: a Stereotaxic Atlas. , Springer Science & Business Media. (2012).
  63. Fontaine, C. J., et al. Impaired bidirectional synaptic plasticity in juvenile offspring following prenatal ethanol exposure. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (10), 2153-2166 (2019).
  64. Fontaine, C. J., et al. Endocannabinoid receptors contribute significantly to multiple forms of long-term depression in the rat dentate gyrus. Learning & Memory. 27 (9), 380-389 (2020).
  65. Grafe, E. L., Wade, M. M., Hodson, C. E., Thomas, J. D., Christie, B. R. Postnatal choline supplementation rescues deficits in synaptic plasticity following prenatal ethanol exposure. Nutrients. 14 (10), 2004(2022).
  66. Peñasco, S., et al. Intermittent ethanol exposure during adolescence impairs cannabinoid type 1 receptor-dependent long-term depression and recognition memory in adult mice. Neuropsychopharmacology. 45 (2), 309-318 (2020).
  67. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  68. Long, R. P., et al. Repeated isoflurane exposures impair long-term potentiation and increase basal GABAergic activity in the basolateral amygdala. Neural Plasticity. 2016, (2016).
  69. Meehan, W. P., Mannix, R. C., O'Brien, M. J., Collins, M. W. The prevalence of undiagnosed concussions in athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (5), 339(2013).
  70. Moore, R. D., Lepine, J., Ellemberg, D. The independent influence of concussive and sub-concussive impacts on soccer players' neurophysiological and neuropsychological function. International Journal of Psychophysiology. 112, 22-30 (2017).
  71. Peltonen, K., et al. On-field signs of concussion predict deficits in cognitive functioning: Loss of consciousness, amnesia, and vacant look. Translational Sports Medicine. 3 (6), 565-573 (2020).
  72. Kontos, A. P., Sufrinko, A., Sandel, N., Emami, K., Collins, M. W. Sport-related concussion clinical profiles: clinical characteristics, targeted treatments, and preliminary evidence. Current Sports Medicine Reports. 18 (3), 82-92 (2019).
  73. Eisenberg, M. A., Meehan, W. P., Mannix, R. Duration and course of post-concussive symptoms. Pediatrics. 133 (6), 999-1006 (2014).
  74. Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
  75. Malkesman, O., Tucker, L. B., Ozl, J., McCabe, J. T. Traumatic brain injury-modeling neuropsychiatric symptoms in rodents. Frontiers in Neurology. 4, 157(2013).
  76. Shultz, S. R., MacFabe, D. F., Foley, K. A., Taylor, R., Cain, D. P. A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat: Support for an animal model of concussion. Behavioural Brain Research. 224 (2), 326-335 (2011).
  77. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  78. van Driel, K. S., Talling, J. C. Familiarity increases consistency in animal tests. Behavioural Brain Research. 159 (2), 243-245 (2005).
  79. Mouzon, B. C., et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model. Annals of Neurology. 75 (2), 241-254 (2014).
  80. Mannix, R., et al. Clinical correlates in an experimental model of repetitive mild brain injury. Annals of Neurology. 74 (1), 65-75 (2013).
  81. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 76, 248-257 (2019).
  82. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 30, 88-94 (2013).
  83. MacDougall, M. J., Howland, J. G. Acute stress, but not corticosterone, disrupts short-and long-term synaptic plasticity in rat dorsal subiculum via glucocorticoid receptor activation. Cerebral Cortex. 23 (11), 2611-2619 (2013).
  84. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  85. Ting, J. T., Feng, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience. Behavioural Brain Research. 255, 3-18 (2013).
  86. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  87. Trivino-Paredes, J. S., Nahirney, P. C., Pinar, C., Grandes, P., Christie, B. R. Acute slice preparation for electrophysiology increases spine numbers equivalently in the male and female juvenile hippocampus: a DiI labeling study. Journal of Neurophysiology. 122 (3), 958-969 (2019).
  88. Bowden, J. B., Abraham, W. C., Harris, K. M. Differential effects of strain, circadian cycle, and stimulation pattern on LTP and concurrent LTD in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 22 (6), 1363-1370 (2012).
  89. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  90. Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: a novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).

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