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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, se demuestra cómo se puede usar un modelo de lesión de cabeza cerrada despierta para examinar los efectos de la lesión cerebral traumática leve repetida (r-mTBI) en la plasticidad sináptica en el hipocampo. El modelo replica características importantes de r-mTBI en pacientes y se utiliza junto con la electrofisiología in vitro .

Resumen

Las lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI) son un problema de salud frecuente en América del Norte. Existe una creciente presión para utilizar modelos ecológicamente válidos de mTBI de cabeza cerrada en el entorno preclínico para aumentar la traducibilidad a la población clínica. El modelo de lesión de cabeza cerrada despierta (ACHI) utiliza un impactador cortical controlado modificado para administrar una lesión de cabeza cerrada, induciendo déficits de comportamiento clínicamente relevantes sin la necesidad de una craneotomía o el uso de un anestésico.

Esta técnica normalmente no induce muertes, fracturas de cráneo o hemorragias cerebrales, y es más consistente con ser una lesión leve. De hecho, la naturaleza leve del procedimiento ACHI lo hace ideal para estudios que investigan mTBI repetitivo (r-mTBI). La creciente evidencia indica que la r-mTBI puede resultar en una lesión acumulativa que produce síntomas de comportamiento, cambios neuropatológicos y neurodegeneración. La r-mTBI es común en los jóvenes que practican deportes, y estas lesiones ocurren durante un período de reorganización sináptica robusta y mielinización, lo que hace que la población más joven sea particularmente vulnerable a las influencias a largo plazo de la r-mTBI.

Además, la r-mTBI ocurre en casos de violencia de pareja, una condición para la cual hay pocas medidas objetivas de detección. En estos experimentos, la función sináptica se evaluó en el hipocampo en ratas jóvenes que habían experimentado r-mTBI utilizando el modelo ACHI. Después de las lesiones, se utilizó una cortadora de tejido para hacer cortes del hipocampo para evaluar la plasticidad sináptica bidireccional en el hipocampo a los 1 o 7 días después de la r-mTBI. En general, el modelo ACHI proporciona a los investigadores un modelo ecológicamente válido para estudiar los cambios en la plasticidad sináptica después de mTBI y r-mTBI.

Introducción

La lesión cerebral traumática (TBI) es un problema de salud significativo, con ~ 2 millones de casos en Canadá y los Estados Unidos cada año 1,2. La LCT afecta a todos los grupos de edad y géneros y tiene una tasa de incidencia mayor que cualquier otra enfermedad, en particular el cáncer de mama, el SIDA, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple3. A pesar de la prevalencia de TBI, su fisiopatología sigue siendo poco conocida, y las opciones de tratamiento son limitadas. En parte, esto se debe a que el 85% de todas las LCT se clasifican como leves (mTBI), y anteriormente se pensaba que la LCTm producía solo cambios de comportamiento limitados y transitorios sin consecuencias neuropsiquiátricas a largo plazo 4,5. Ahora se reconoce que la recuperación de mTBI puede tomar semanas a años5,6, precipitar condiciones neurológicas más graves4, y que incluso los impactos repetidos "sub-conmocionales" afectan el cerebro7. Esto es alarmante ya que los atletas en deportes como el hockey / fútbol tienen >10 impactos subconmocionales en la cabeza por juego / sesión de práctica 7,8,9,10.

Los adolescentes tienen la mayor incidencia de mTBI, y en Canadá, aproximadamente uno de cada 10 adolescentes buscará atención médica para una conmoción cerebral relacionada con el deporte anualmente11,12. En realidad, cualquier impacto subconmocional en la cabeza o mTBI puede causar daño difuso al cerebro, y esto también podría crear un estado más vulnerable para lesiones posteriores y / o afecciones neurológicas más graves 13,14,15,16,17. En Canadá, se reconoce legalmente a través de la ley de Rowan que las lesiones previas pueden aumentar la vulnerabilidad del cerebro a lesiones adicionales18, pero la comprensión mecanicista de r-mTBI sigue siendo lamentablemente inadecuada. Sin embargo, está claro que el TCE-m individual y el r-mTBI pueden afectar la capacidad de aprendizaje durante los años escolares 19,20, tener resultados específicos por sexo 21,22,23,2 4 y afectar la capacidad cognitiva más adelante en la vida16,25,26. De hecho, los análisis de cohortes asocian fuertemente la r-mTBI temprana en la vida con la demencia más adelante27,28. r-mTBI también está potencialmente asociado con la encefalopatía traumática crónica (CTE), que se caracteriza por la acumulación de proteína tau hiperfosforilada y atrofia cortical progresiva y precipitada por inflamación significativa 27,29,30,31. Aunque los vínculos entre r-mTBI y CTE son actualmente controvertidos32, este modelo permitirá explorarlos con mayor detalle en un entorno preclínico.

Un mTBI a menudo se describe como una "lesión invisible", ya que ocurre dentro de un cráneo cerrado y es difícil de detectar incluso con técnicas modernas de imagen33,34. Un modelo experimental preciso de mTBI debe adherirse a dos principios. En primer lugar, debe recapitular las fuerzas biomecánicas normalmente observadas en la población clínica35. En segundo lugar, el modelo debe inducir resultados conductuales heterogéneos, algo que también es altamente prevalente en poblaciones clínicas36,37,38. Actualmente, la mayoría de los modelos preclínicos tienden a ser más severos, involucrando craneotomía, sujeción estereotáxica de la cabeza, anestesia e impactos corticales controlados (CCI) que producen daño estructural significativo y déficits de comportamiento más extensos que los observados normalmente clínicamente33. Otra preocupación con muchos modelos preclínicos de conmoción cerebral que involucran craneotomías es que este procedimiento en sí mismo crea inflamación en el cerebro, y esto puede exacerbar los síntomas de mTBI y la neuropatología de cualquier lesión posterior39,40. La anestesia también introduce varios factores de confusión complejos, incluyendo la reducción de la inflamación 41,42,43, la modulación de la función microglial 44, la liberación de glutamato45, la entrada de Ca2+ a través de los receptores NMDA 46, la presión intracraneal y el metabolismo cerebral 47. La anestesia introduce aún más factores de confusión al aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE), la hiperfosforilación tau y los niveles de corticosteroides, al tiempo que reduce la función cognitiva 48,49,50,51. Además, las lesiones difusas de cabeza cerrada representan la gran mayoría de las mTBI clínicas52. También permiten estudiar mejor la multitud de factores que pueden influir en los resultados conductuales, incluidos el sexo21, la edad 53, el intervalo entre lesiones15, la gravedad54 y el número de lesiones23.

La dirección de las fuerzas acelerativas / desaceleradoras (verticales u horizontales) también es una consideración importante para los resultados conductuales y moleculares. La investigación de Mychasiuk y sus colegas han comparado dos modelos de mTBI difuso de cabeza cerrada: caída de peso (fuerzas verticales) e impacto lateral (fuerzas horizontales)55. Tanto los análisis conductuales como moleculares revelaron resultados heterogéneos dependientes del modelo y del sexo después de la LCTm. Así, los modelos animales que ayudan a evitar procedimientos quirúrgicos, incorporando fuerzas lineales y rotacionales, son más representativos de las condiciones fisiológicas bajo las cuales esas lesiones ocurren normalmente33,56. El modelo ACHI fue creado en respuesta a esta necesidad, permitiendo la inducción rápida y reproducible de mTBI en ratas, evitando procedimientos (es decir, anestesia) que se sabe que sesgan las diferencias de sexo57.

Protocolo

La aprobación para todos los procedimientos con animales fue proporcionada por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Victoria de conformidad con los estándares del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC). Todas las ratas Long-Evans macho fueron criadas internamente o compradas (ver la Tabla de Materiales).

1. Alojamiento y condiciones de cría

  1. Permita que los animales se aclimaten a su entorno de alojamiento durante 1 semana antes del destete en el día postnatal (PND) 21.
  2. Mantener a las ratas en jaulas estándar a 22,5 °C ± 2,5 °C, con acceso ad libitum a alimentos y agua, en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
  3. Agrupe y aloje a los animales con dos o tres compañeros de camada emparejados por sexo y asígnelos aleatoriamente a condiciones falsas o r-mTBI.
  4. Realice todos los procedimientos entre las 7:30 a.m. y las 11:30 p.m.

2. Configuración del procedimiento de lesión en la cabeza cerrada despierta

  1. Posición a 2.75 in. Almohadilla de espuma de baja densidad (100 cm x 15 cm x 7 cm) debajo del impactador para permitir el movimiento de rotación de la cabeza.
    NOTA: La almohadilla de espuma tenía una constante de resorte de ~ 2,500 N / m, pero puede variar entre 3,100 y 5,600 N / m58. El nivel de firmeza (bajo, medio y alto) no ha demostrado ser predictivo del resultado de la lesión59. La almohadilla de espuma es un material no consumible. Normalmente se reemplaza anualmente o si está sucio o dañado.
  2. Encienda el dispositivo de impacto cortical modificado (Figura 1A) y ajuste la velocidad a 6 m/s.
    NOTA: Estas especificaciones están diseñadas para provocar un deterioro neurológico agudo en ratas juveniles y adolescentes que son análogas a las características de un mTBI, pero tales parámetros pueden no ser adecuados para animales más viejos u otras especies (por ejemplo, ratones o hurones). Para una revisión de los parámetros comunes de ACHI, consulte60.

3. Inducción de mTBI

  1. Cuando las ratas alcancen PND 24, muévalas a la sala de procedimientos donde se realizarán los procedimientos. Asegúrese de que esta habitación esté separada de su entorno de vivienda normal.
  2. Coloque suavemente a la rata en un cono de sujeción, asegurándose de que el hocico y las fosas nasales estén cerca de la pequeña abertura del cono para permitir una ventilación adecuada. Use una pinza plástica para el cabello para mantener el cono cerrado en el extremo caudal para evitar el movimiento una vez que la rata se coloca en el cono de sujeción.
    1. Use puntajes de restricción para registrar el cumplimiento o la tolerancia de los animales con el cono de restricción y el procedimiento ACHI.
      NOTA: La puntuación de restricción se puede utilizar como una evaluación del estrés en los animales. Por lo tanto, los criterios de exclusión se pueden desarrollar utilizando la puntuación de restricción para reducir la variabilidad entre los sujetos que surge debido a una respuesta de estrés excesiva.
      1. Dé una puntuación de 0 a 4 basada en la disposición del animal para entrar en el cono, sus movimientos y vocalizaciones. Dé una puntuación de 0 si no hay resistencia a la sujeción, mientras que una puntuación de 1 corresponde con el animal girando 1-2x y poca o ninguna vocalización o retorcerse. Dé una puntuación de 2 si el animal ha girado 2-3x y exhibe algo de vocalización o retorcerse. Dé una puntuación de restricción de 3 si el animal ha girado 5-10x y exhibe más vocalizaciones y retorcerse. Finalmente, dé una puntuación de 4 si el animal ha girado más de 10 veces con vocalizaciones frecuentes y retorcerse.
        NOTA: Esta información también figura en la propia hoja de puntuación (cuadro suplementario S1 y cuadro suplementario S2).
  3. Mientras la rata está sujeta, coloque manualmente el casco (Figura 1B) sobre la línea media, con el disco objetivo sobre el lóbulo parietal izquierdo (Figura 1C, D).
  4. Coloque la rata en la almohadilla de espuma y ajuste manualmente el impactador a la posición Extender. Baje manualmente la punta del impactador para que entre en contacto con el disco de orientación del casco. Ajuste manualmente el impactador a la posición Retraer para que el impactador se retire 10 mm por encima del casco.
  5. Utilice el dial del brazo estereotáxico para bajar la punta del impacto en 10 mm para que vuelva a tocar el disco de orientación del casco. Gire el interruptor de impacto para que la cabeza del animal se acelere rápidamente durante 10 mm a 6 m/s.
  6. Una vez activado el dispositivo, retirar inmediatamente al animal del cono de sujeción y proceder a realizar un protocolo de evaluación neurológica inmediata (NAP).
    NOTA: Para los experimentos actuales, este protocolo se repitió ocho veces en total a intervalos de 2 h.

4. Inducción de lesión simulada

  1. Siga todos los procedimientos experimentales descritos anteriormente en la sección 3, pero coloque la rata adyacente a la trayectoria del pistón de impacto, de modo que no se produzca ninguna lesión.

5. Protocolo de evaluación neurológica

NOTA: La NAP se puede utilizar para medir el nivel de conciencia, así como el funcionamiento cognitivo y sensoriomotor.

  1. Al inicio e inmediatamente después de la inducción de la lesión mTBI o lesión simulada, evaluar las ratas utilizando la NAP como se describe en56,61. Sobre una mesa, coloque la jaula de la casa de las ratas y una jaula de recuperación separada 100 cm. Centra uniformemente la viga de equilibrio en la parte superior de ambas jaulas. Además, coloque una toalla doblada o amortiguación adicional debajo de la barra de equilibrio.
  2. Si es necesario, evalúe el nivel de conciencia. Si los animales no responden después de la LCTm, evalúe la apnea (cese de la respiración) y cualquier retraso en el reflejo de enderezamiento utilizando un cronómetro para registrar el tiempo que tarda el animal en reanudar la respiración y / o enderezarse de un decúbito supino a la posición prona.
    NOTA: La pérdida del reflejo de enderezamiento y la apnea son raras con el modelo ACHI, pero ocasionalmente se pueden observar en animales juveniles.
  3. Evalúe la función cognitiva y sensoriomotora de la rata utilizando la siguiente secuencia de pruebas. Administrar estas pruebas rápidamente en sucesión después de la evaluación de la conciencia.
    NOTA: La suma de estas cuatro pruebas arroja una puntuación total de 12, si no hay déficits de comportamiento observados. Los déficits restan valor a esta puntuación.
    1. Respuesta de sobresalto
      1. Coloque la rata en la jaula de recuperación vacía y aplauda en voz alta (50 cm) sobre la jaula. Registre la respuesta del animal al ruido utilizando el siguiente sistema de puntuación:
        3 = reacción rápida de sobresalto al sonido (p. ej., movimiento/contracciones del oído, salto, todo el cuerpo se congela).
        2 = reacción lenta o reacción de congelación leve al sonido.
        1 = Sólo se observan movimientos del oído.
        0 = Sin reacción al sonido.
    2. Extensión de la extremidad
      1. Con la viga (100 cm de largo x 2 cm de ancho x 0,75 cm de grosor) colocada horizontalmente a través de la casa de la rata y las jaulas de recuperación, levante a la rata por la base de la cola y sosténgala cerca de la viga. Asegúrese de que la rata esté lo suficientemente cerca como para poder agarrarla fácilmente. Evalúe la capacidad de la rata para extender ambas extremidades hacia la viga con el siguiente sistema de puntuación:
        3 = Extensión completa de ambas extremidades anteriores y agarra la viga.
        2 = Sólo se extiende una extremidad.
        1 = extensión o retracción intermitente de las extremidades anteriores.
        0 = Las extremidades anteriores están flojas/sin extensión.
    3. Paseo de viga
      1. Coloque al animal en el centro de la viga horizontal en la marca de 50 cm frente a su jaula doméstica. Asegúrese de que el haz esté espaciado equitativamente entre la jaula doméstica de la rata y la jaula de recuperación (colocada a ~ 80 cm de distancia). Permita que la rata camine a través de la viga. Evalúe la capacidad de la rata para equilibrarse y caminar con el siguiente sistema de puntuación:
        3 = Camina con éxito a través de la viga con menos de dos pies deslizándose dentro de 10 s.
        2 = Camina con éxito la viga, pero se observan deslizamientos de más de dos pies.
        1 = Movimiento no locomotor, movimiento de "natación".
        0 = Incapaz de caminar a lo largo de la viga o incapaz de moverse dentro de 10 s.
    4. Haz giratorio
      1. Reposicione la rata en el centro de la viga, asegurándose de que la rata esté equilibrada. Levante la viga 80 cm por encima de una toalla o superficie acolchada y comience a girar manualmente la viga a una velocidad de una rotación por segundo durante 4 s (un total de cuatro rotaciones). Evalúe la capacidad de la rata para permanecer en la viga mientras gira con el siguiente sistema de puntuación:
        3 = La rata permanece en la viga durante las cuatro rotaciones.
        2 = La rata cae en la cuarta rotación.
        1 = La rata cae en la segunda o tercera rotación.
        0 = Caída de rata durante la primera rotación.
  4. Al finalizar la siesta, devuelva la mTBI y las ratas simuladas a sus jaulas domésticas. Repita según sea necesario para los procedimientos de r-mTBI. Supervise el bienestar de los animales después de las lesiones con la Lista de verificación de monitoreo del lado de la jaula (Archivo complementario 1). Si hay alguna indicación de anomalía (cualquier puntuación que no sea N) durante la monitorización del lado de la jaula, se debe tomar una puntuación completa del dolor con la Escala de dolor y la Lista de verificación de monitorización avanzada después del impacto en la cabeza (Archivo complementario 2).

6. Preparación de la rebanada

NOTA: En el estudio actual, la plasticidad sináptica se evaluó en animales después de r-mTBI a los 1 o 7 días después de mTBI. En estos días, los animales fueron llevados individualmente al laboratorio en jaulas cubiertas antes del sacrificio.

  1. Refrigere (-20 °C) durante la noche todas las herramientas quirúrgicas (Figura 2A) necesarias para hacer rodajas de hipocampo: tijeras estándar, tijeras de disección, fórceps, rongeurs, espátulas y bloque de enfriamiento.
    NOTA: El pegamento tisular y la cámara de incubación no deben refrigerarse.
  2. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (LCR) que contenga 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaHPO 4, 25 mM de NaHCO 3, 2 mM de CaCl 2,1,3 mM de MgCl 2 y 10 mM de dextrosa (300 ± 10 mOsm; pH 7,2-7,4).
    NOTA: La solución principal de aCSF debe ser burbujeada continuamente con carbógeno (95% O 2/5% CO2) durante la duración del protocolo.
  3. Antes de sacrificar al animal (paso 6.8), prepare 12,5 ml de agarosa. Disuelva 0,25 g de agarosa en 12,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) en el microondas en un tubo cónico de 50 ml en incrementos de 10 s.
  4. Mantener la agarosa caliente (42 °C) y agitar en una placa calefactora para evitar que se solidifique.
  5. Instale una estación de corte en hielo, que incluya una placa de Petri y un vaso de precipitados pequeño (50 ml) lleno de aCSF helado (4 °C) y una placa de Petri volcada con un trozo de papel de filtro humedecido en la parte superior (Figura 2A). Burbujee continuamente el aCSF en el vaso de precipitados pequeño con carbogen.
  6. Calentar el baño maría a 32 °C. Llene la cámara de recuperación con aCSF y burbujee continuamente con carbógeno (Figura 2B).
  7. Transporta al animal a la sala experimental.
  8. Anestesiar al animal usando isoflurano al 5% como inhalante (hasta la falta de un reflejo de abstinencia) y luego decapitarlo rápidamente usando una pequeña guillotina.
  9. Diseccionar el cerebro del cráneo en la placa de Petri llena de aCSF helada (4 °C), sosteniendo el cráneo sumergido en el aCSF para ayudar a enfriar rápidamente el tejido.
    NOTA: Este procedimiento normalmente requiere menos de 5 minutos, pero la velocidad de extracción del cerebro no es un factor crítico si el cerebro está sumergido en aCSF refrigerado.
  10. Coloque el cerebro en el vaso pequeño de aCSF refrigerado y carbogenado para limpiar y enfriar aún más la muestra.
  11. Mueva el cerebro a la placa de Petri invertida y colóquelo en el papel de filtro. Use un bisturí afilado para extirpar el cerebelo y la corteza prefrontal para "bloquear" el cerebro. Separe los dos hemisferios haciendo un corte en la línea media del cerebro.
    NOTA: El siguiente protocolo se realiza un hemisferio a la vez. Es imperativo que el hemisferio que no se está preparando actualmente permanezca sumergido en el vaso de precipitados de aCSF carbogenado helado (4 °C).
  12. Para crear cortes transversales del hipocampo, coloque el hemisferio en la superficie medial. Incline la hoja de un bisturí a ~ 30 ° hacia adentro y retire una rebanada delgada de la superficie dorsal del cerebro para proporcionar una superficie plana para que el cerebro se monte en el pistón utilizado por la cortadora. Voltea el cerebro sobre la superficie dorsal y aplica suavemente el tejido sobre papel de filtro seco para eliminar cualquier exceso de aCSF. Usando pegamento de cianoacrilato, fije la superficie dorsal del cerebro al pistón, dejando la superficie ventral en posición vertical.
    NOTA: Asegúrese de que el pegamento no corra sobre el borde del pistón, ya que esto hará que se adhiera al tubo de metal utilizado para contener la agarosa y evitar el movimiento del pistón.
  13. Extienda el tubo exterior del pistón sobre el cerebro y vierta la agarosa líquida en el tubo hasta que el cerebro esté completamente cubierto. Solidifique rápidamente la agarosa sujetando un bloque de enfriamiento sobre el tubo del pistón (Figura 2A).
  14. Coloque el pistón en la cámara de la cortadora y asegure la cámara con un tornillo. Asegure la cuchilla y agregue aCSF oxigenado y helado a la cámara de corte.
  15. En la segmentación de datos (Figura 2B), ajuste la velocidad de corte a 4, la oscilación a 6 y cambie el interruptor de corte continuo/simple a continuo. Arranque para comenzar a seccionar el cerebro a 400 μm.
  16. A medida que la cortadora secciona el cerebro, use una pipeta Pasteur de gran diámetro para transferir cada rebanada al baño de recuperación de aCSF oxigenado a medida que se secciona (Figura 2C).
    NOTA: A medida que se corta cada rebanada, se puede colocar secuencialmente en los diferentes pocillos del baño de recuperación. Este protocolo generalmente produce entre seis y ocho cortes, que contienen el hipocampo para cada hemisferio. Se puede usar un atlas62 de ratas para identificar la posición dorsal-ventral de cortes individuales en el cerebro de la rata.
  17. Deje que las rodajas se recuperen a 32 °C durante 30 min y luego déjelas recuperar durante 30 min adicionales a temperatura ambiente (23 °C).
  18. Repita estos pasos para crear sectores del segundo hemisferio.

7. Electrofisiología de campo

NOTA: Para adquirir grabaciones de campo extracelular del giro dentado (DG), realice los siguientes pasos. Después de la recuperación de 60 minutos, los cortes individuales del hipocampo están listos para las grabaciones de campo extracelular.

  1. Utilizando un extractor de micropipetas disponible comercialmente, extraiga electrodos de registro (1-2 MΩ) de capilares de vidrio de borosilicato de 10 cm con un diámetro exterior de 1,5 mm y un diámetro interior de 1,1 mm.
    NOTA: El electrodo de grabación debe tener una resistencia de ~1 MΩ y las puntas deben tener un tamaño de ~1 mm. La consistencia en los parámetros del electrodo es importante para una buena grabación.
  2. Encienda la computadora y el equipo que se utilizará para las grabaciones: el amplificador, el digitalizador, el estimulador, el micromanipulador, el regulador de temperatura, la luz del microscopio y la bomba de vacío.
  3. Llene un vaso de precipitados con aCSF y conéctelo a un sistema de perfusión controlado por gravedad. Abra la válvula aCSF en el sistema de perfusión para comenzar un flujo de aCSF a través de la cámara de perfusión. Mantenga un caudal de aproximadamente uno o dos goteos/s o 2 mL/min. Carbogenato continuo aCSF durante la duración de los registros electrofisiológicos.
    NOTA: Es imperativo mantener una tasa de goteo constante de aCSF carbogenado durante las grabaciones de campo. También es imperativo que el electrodo de referencia esté completamente sumergido en aCSF.
  4. Utilice una pipeta Pasteur para transferir una rodaja del hipocampo del baño de recuperación a la cámara de perfusión que se perfunde continuamente con aCSF carbogenado y se mantiene a 30 ± 0,5 °C. Oriente el corte cerebral de modo que el giro dentado y la capa de células granulares sean visibles en el campo de visión. Estabilice la rebanada con pesos de alambre doblados. Inicie el software de la computadora para la adquisición de datos.
    NOTA: Puede ser útil apagar la bomba de vacío durante este paso para permitir la manipulación libre del tejido. Esto debe hacerse rápidamente ya que demasiada manipulación puede dañar el tejido. Además, la cámara de perfusión puede desbordarse con aCSF si esto lleva demasiado tiempo. Una vez que el tejido esté orientado y estabilizado correctamente, encienda la bomba de vacío.
  5. Utilice un microscopio vertical para visualizar el DG con óptica oblicua. Coloque un electrodo estimulante bipolar concéntrico para activar las fibras de la ruta perforante medial (MPP) en el tercio medio de la capa molecular. Luego, coloque una micropipeta de vidrio, llena con aCSF en el MPP (Figura 3A, B). Comience con los electrodos más separados (es decir, el electrodo estimulante cerca de CA3 y el electrodo de grabación justo por encima del genu del DG), ya que tocar el tejido causará daño a las fibras.
    NOTA: Óptimamente, todas las grabaciones deben tener los electrodos colocados equidistantes de la capa celular, aproximadamente a 200 μm de distancia.
  6. Una vez que los electrodos de estimulación y grabación estén colocados, visualice las respuestas de campo evocadas utilizando un amplificador, un digitalizador y un software de grabación.
  7. Para encontrar un potencial postsináptico excitatorio de campo adecuado (fEPSP), estimule el tejido con pulsos de corriente de 0,12 ms a 0,2 Hz (cada 5 s) cuando el usuario sea competente para encontrar respuestas, o a 0,067 Hz (cada 15 s) para usuarios menos competentes para evitar la sobreestimulación. Asegúrese de que el fEPSP tenga una amplitud mínima de 0,7 mV con una descarga de fibra transparente que sea más pequeña que la fEPSP.
    NOTA: Es fundamental colocar ambos electrodos equidistantes de la capa celular para obtener respuestas de campo máximas y lo suficientemente separados (es decir, ~ 200 μm) para generar una pequeña descarga de fibra. Pequeños ajustes en la posición del electrodo pueden ayudar a mejorar la amplitud de la respuesta, aunque estos deben mantenerse al mínimo para evitar daños tisulares.
  8. Determine la amplitud máxima de fEPSP aumentando la intensidad de estimulación y luego establezca la intensidad de simulación para que la fEPSP esté en el 70% de la amplitud máxima.
    NOTA: La amplitud máxima se establece en 70% para estudios de depresión a largo plazo (LTD) y en 50% para estudios de potenciación a largo plazo (LTP). La amplitud máxima se determina ajustando la fuerza de estimulación hasta que el fEPSP ya no aumenta en amplitud. Para una fEPSP con una amplitud máxima de 2 mV, el tamaño de respuesta se ajustaría a 1,4 mV para estudios LTD y 1,0 mV para estudios LTP, para dejar espacio para que la fEPSP se deprima o potencie (respectivamente).
  9. Establezca una línea base de preacondicionamiento estable durante 20 min con pulsos de 0,12 ms entregados a 0,067 Hz. Para que los cortes se consideren estables, busque una variabilidad del <10% en la pendiente inicial del fEPSP y que la pendiente de la línea de mejor ajuste a través de las pendientes fEPSP trazadas sea de <0.5. Continúe con los siguientes pasos de la grabación cuando se verifique que los EPSP son estables durante 20 minutos.
    NOTA: Se pueden agregar varios antagonistas de receptores al aCSF para bloquear o mejorar LTD y LTP. Si es necesario, asegúrese de que los cortes estén expuestos a estos agentes farmacológicos durante este período de referencia y que se cumplan los requisitos para registros estables. Para ver ejemplos, véanse63,64,65.
  10. Primero, determinar los cambios en las propiedades sinápticas básicas mediante el uso de estímulos de pulso pareado y mediante la construcción de curvas de entrada-salida de estímulo-respuesta. Para la prueba de pulso pareado, aplique una serie de pulsos pareados con un intervalo interpulso de 50 ms a 0,033 Hz. Para las curvas de entrada-salida, aplique una serie (10) de intensidades de estímulo crecientes (0,0-0,24 ms) a 0,033 Hz para trazar el cambio de tamaño de la respuesta fEPSP.
  11. Para estudiar LTD que depende principalmente de la activación de los receptores CB164,66, emplee un protocolo de 10 Hz (6.000 pulsos a 10 Hz). Este protocolo tarda 10 minutos en administrarse.
  12. Para grabaciones posteriores al acondicionamiento, reanude el uso de estimulación de pulso único (0,12 ms a una frecuencia de 0,067 Hz) durante 60 minutos adicionales.
  13. Después de la grabación posterior al acondicionamiento, administre nuevamente los estímulos de pulso pareado, seguidos de una curva de entrada-salida. Compare estos con los registros de referencia para observar alteraciones en las propiedades de liberación presináptica y ayudar a evaluar la salud del corte para registros a largo plazo.
  14. Durante el análisis, sea conservador y cumpla con los criterios de exclusión al determinar si los datos de los cortes individuales deben conservarse en el conjunto de datos de plasticidad sináptica. Excluya los cortes que muestran una pendiente grande en una línea de mejor ajuste de las pendientes fEPSP durante la línea de base de preacondicionamiento (pendiente >0.5), inestabilidad en la línea base de preacondicionamiento (>10% de cambio) o inestabilidad en el período de postacondicionamiento (pendiente >1.5 en 50-60 min de postacondicionamiento).

Resultados

El modelo de lesión de cabeza cerrada despierta es un método viable para inducir r-mTBI en ratas jóvenes. Las ratas expuestas a r-mTBI con el modelo ACHI no mostraron déficits de comportamiento manifiestos. Los sujetos en estos experimentos no exhibieron latencia a la derecha o apnea en ningún momento durante el procedimiento r-mTBI, lo que indica que este fue de hecho un procedimiento de TBI leve. Surgieron sutiles diferencias de comportamiento en el NAP; Como se describió anteriormente, las ratas fueron calificad...

Discusión

La mayoría de las investigaciones preclínicas han utilizado modelos de mTBI que no recapitulan las fuerzas biomecánicas observadas en la población clínica. Aquí, se muestra cómo se puede usar el modelo ACHI para inducir r-mTBI en ratas jóvenes. Este modelo cerrado de r-mTBI tiene ventajas significativas sobre los procedimientos más invasivos. En primer lugar, el ACHI normalmente no causa fracturas de cráneo, hemorragias cerebrales o muertes, todo lo cual sería contraindicación de una LCT "leve" en poblaciones...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Christie de la Universidad de Victoria, pasados y presentes, por sus contribuciones al desarrollo de este protocolo. Este proyecto fue apoyado con fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR: FRN 175042) y NSERC (RGPIN-06104-2019). El gráfico del cráneo de la Figura 1 se creó con BioRender.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3D-printed helment Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose Fisher Scientific (BioReagents)BP160500
Anesthesia chamberHome MadeN/APlexiglass Container
Automatic Heater ControllerWarner ElectricTC-324B
Axon DigidataMolecular Devices1440ALow-noise Data Acquisition System
Balance beam Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium ChlorideBio Basic Canada Inc. CD0050For aCSF
CameraDage MTINC-70
Carbogen tankPraxairMM OXCD5C-KCarbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex SoftwareMolecular DevicesClampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating MicrotomePrecisionaryVF 310-0Z
Concentric Bipolar ElectrodeFHC Inc.CBAPC75
Dextrose (D-Glucose)Fisher Scientific (Chemical)D16-3aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier  Getting Instruments, Inc. Model 4D
Disodium PhosphateFisher Scientific (Chemical)S373-500PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge BladeElectron Microscopy Sciences72002-10
Filter PaperWhatman 11001-055
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentP-1000
Hair Claw ClipCan be obtained from any department store
Home and Recovery CagesNormal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise EliminatorQuest Scientific 726300
Isoflurane USPFresenius KabiCP0406V2
Isotemp 215 Digital Water BathFisher Scientific 15-462-15
Leica Impact One CCI unitLeica BiosystemsTip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, maleCharles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad3" polyurethane foam sheet 
Magnesium ChlorideFisher Scientific (Chemical)M33-500aCSF
Male Long Evans RatsCharles River LaboratoriesAnimals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B AmplifierMolecular DevicesModel 700B
pH Test StripsVWR Chemicals BDHBDH83931.601
Potassium ChlorideFisher Scientific (Chemical)P217-500aCSF, PBS
Potassium PhosphateSigmaP9791-500GPBS
Push Button ControllerSiskiyou Corporation MC1000eFour-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample DiscsELITechGroupSS-033For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium BicarbonateFisher Scientific (Chemical)S233-500aCSF
Sodium ChlorideFisher Scientific (Chemical)S271-3For aCSF, PBS
Sodium PhosphateFisher Scientific (Chemical)S369-500aCSF
Soft Plastic Restraint ConesBraintree Scientificmodel DC-200
StopwatchMany lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament)Sutter InstrumentBF150-110-10Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright MicroscopeOlympusOlympus BX5OWI5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure OsmometerVaproModel 5600aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive3M1469SB
Vibraplane Vibration Isolation TableKinetic Systems9101-01-45

Referencias

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