真菌β-葡聚糖的分离纯化作为胶质母细胞瘤的免疫治疗策略

摘要

本协议描述了四种不同真菌β-葡聚糖的纯化步骤和后续研究，作为增强小胶质细胞对胶质母细胞瘤细胞的抗肿瘤特性的潜在免疫调节分子。

摘要

开发针对胶质母细胞瘤的有效疗法的最大挑战之一是克服肿瘤微环境中的强免疫抑制。免疫疗法已成为使免疫系统对肿瘤细胞的反应的有效策略。胶质瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞（GAMs）是这种抗炎方案的主要驱动因素。因此，增强GAM的抗癌反应可能代表治疗胶质母细胞瘤患者的潜在联合辅助疗法。本着这种精神，真菌β-葡聚糖分子长期以来一直被称为有效的免疫调节剂。已经描述了它们刺激先天免疫活性和改善治疗反应的能力。这些调节特征部分归因于它们与模式识别受体结合的能力，有趣的是，模式识别受体在GAM中得到了极大的表达。因此，这项工作的重点是真菌β-葡聚糖的分离，纯化和随后的使用，以增强小胶质细胞对胶质母细胞瘤细胞的杀瘤反应。小鼠胶质母细胞瘤（GL261）和小胶质细胞（BV-2）细胞系用于测试从当前生物制药行业中大量使用的蘑菇中提取的四种不同真菌β-葡聚糖的免疫调节特性: Pleurotus ostreatus， Pleurotus djamor， 猴头菇和灵 芝。为了测试这些化合物，进行了共刺激测定以测量预活化的小胶质细胞条件培养基对胶质母细胞瘤细胞增殖和凋亡活化的影响。

引言

尽管在神经肿瘤学领域取得了新的成就，但胶质母细胞瘤患者的预期寿命仍然微不足道。针对脑肿瘤的金标准疗法基于手术、放疗和化疗的结合。然而，在过去十年中，免疫疗法已成为治疗不同类型癌症的有力策略¹。因此，利用身体对肿瘤细胞的免疫反应的可能性最近已成为肿瘤学的第四大支柱。

人们早就知道，该领域最大的挑战之一是克服肿瘤微环境中发现的强免疫抑制²。特别是，在胶质母细胞瘤的情况下，这是最常见和最具侵袭性的脑癌形式之一，揭示协调这种促肿瘤场景的关键途径，并找到可以抵消免疫系统抑郁反应的新化合物，可能为未来针对这种不治之症的治疗铺平道路。

大脑拥有自己的免疫系统细胞，最相关的细胞类型是小胶质细胞。这些细胞已被证明在不同的中心疾病中具有相当复杂的行为³。在原发性脑肿瘤（例如胶质母细胞瘤）的情况下，这些细胞向支持肿瘤细胞定植脑实质^的抗炎表型转移3。许多出版物增强了这些细胞在肿瘤进展过程中的主要作用。其中一个主要原因是胶质瘤相关的小胶质细胞和浸润巨噬细胞（GAMs）占肿瘤总量的三分之一，因此表明它们在脑肿瘤进展过程中的激活状态的明确影响4^，5。

本着这种精神，真菌β-葡聚糖被描述为触发有效免疫反应的有效分子，包括吞噬作用和促炎因子的产生，导致有害物质^的消除6^{，7，8，9，10}。真菌β-葡聚糖通常使用来自不同蘑菇部位的提取物进行研究。然而，特定效应的归属需要其纯化以避免歧义并能够理解诸如免疫调节剂之类的分子的作用机制⁸。

在这项工作中，可溶性β葡聚糖从四种不同蘑菇的子实体中纯化，通常用作食用蘑菇（Pleurotus ostreatus 和 Pleurotus djamor）和药用（灵芝 和 猴头菇）蘑菇。特别是，这四种蘑菇在食品和制药工业中有很大的用途，并且是在商业企业的环境友好型循环经济中生产的（见 材料表）。

为了为真菌β-葡聚糖在脑癌治疗中的未来使用奠定基础，明确的纯化策略和临床前研究深入研究它们与免疫系统细胞的假定相互作用对于评估其作为抗肿瘤介质的潜在作用至关重要。这项工作描述了回收所选蘑菇子实体中所含的可溶性β-葡聚糖所需的许多分离和纯化步骤。一旦成功纯化，小胶质细胞就会被激活以增强其炎症表型。小鼠胶质母细胞瘤细胞（GL261）涂有不同的小胶质细胞条件培养基，先前用这些提取物处理，然后评估其对肿瘤细胞行为的影响。有趣的是，我们实验室的初步研究（数据未显示）揭示了促炎小胶质细胞如何减缓肿瘤细胞迁移和侵袭特性，不仅在胶质母细胞瘤细胞中，而且在其他癌细胞系中。这项多学科工作可能为肿瘤学研究人员提供有用的工具，以测试能够增强许多不同类型肿瘤免疫反应的有前途的化合物。

研究方案

本协议中描述的四种不同的蘑菇变体是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 真菌β-葡聚糖的分离

1. 可溶性蘑菇多糖的提取和分离
   注意:可溶性蘑菇多糖（SMP）是根据 图1所示的示意性程序获得的。
   1. 在蒸馏水中轻轻冲洗新鲜的 P. ostreatus， P. djamor， H. erinaceus和 G. lucidum 子实体（约2，000克/蘑菇）五次。
   2. 在常规风干炉中在50±2°C下干燥子实体，直到达到恒定重量（~24小时）。
   3. 将干蘑菇在刀片磨机中研磨，从每个蘑菇中获得约200克粉末。
   4. 将 100 g 蘑菇粉 （MP）（P. ostreatus、P. djamor、H. erinaceus 和 G. 灵芝）悬浮在 1，000 mL 的 H₂O_d 中。然后，在121°C高压灭菌15分钟，最后在室温下放置30分钟。
   5. 将所得悬浮液在4°C下以6，000× g 离心10分钟。
   6. 将含有不溶性蘑菇多糖（IMP）的沉淀物在50±2°C下在空气干燥炉中干燥24小时。
   7. 弃去沉淀物并保留上清液。将上清液在旋转蒸发器中浓缩10次。
   8. 用乙醇（80%终浓度）在4°C下沉淀含有SMP的浓缩物过夜。
   9. 在4°C下以6，000× g 离心乙醇悬浮液15分钟，保留沉淀（沉淀），并用移液管弃去上清液。
   10. 用80%乙醇洗涤沉淀三次，然后将其溶解在H₂O_d （10% w / v）中。将pH调节至6.5 / 7，温度调节至37°C，并分别用2 U和4U的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理，以按照制造商的说明溶解α-葡聚糖（参见 材料表）。
   11. 用α-淀粉酶/葡糖淀粉酶处理后，将pH和温度分别调节至8.0和50°C，并用碱性酶（2.5U / g蛋白质）（见 材料表）处理以溶解蛋白质。
       注意:这种顺序酶处理可去除乙醇沉淀中与β-葡聚糖共沉淀的大多数α-葡聚糖和蛋白质。
   12. 水解后，将水解产物在4°C下以6，000× g 离心15分钟，并将干净的上清液浓缩物在旋转蒸发器中离心5次。再次用80%乙醇沉淀。
   13. 将所得沉淀溶解在H₂O_d 中，并使用纤维素管膜（12，000 Da截止膜;参见 材料表）在蒸馏水中透析24小时以除去低分子量分子。回收水溶性部分并将其冷冻干燥以产生可溶性β-葡聚糖（SβG）。
2. 糖和蛋白质测量
   1. 用苯酚-硫酸法测定每个馏分的总糖含量，使用葡萄糖作为标准^品8。
      注意:β-葡聚糖含量的定量也可以通过使用基于酶水解和氧化还原酶活性的β-葡聚糖测定试剂盒（蘑菇和酵母;见 材料表）来完成:即exo-1，3-β-葡聚糖酶，葡萄糖氧化酶，β-葡萄糖苷酶和过氧化物酶，随后形成醌亚胺。按照制造商的说明进行操作，稍作修改。
   2. 使用 18 MH 2 SO4 而不是 12 MH₂SO₄。
   3. 分别评估总葡聚糖和α-葡聚糖的含量。
   4. 按照凯氏定氮方案测量所得β-葡聚糖值作为总葡聚糖和α-葡聚糖（一式三份）值之间的差异。在某些情况下，蛋白质含量可以通过Lowry方法确定，使用白蛋白绘制校准曲线^11，12。
3. 紫外吸收光谱分析
   1. 通过扫描200-400nm区域的样品，使用紫外-可见分光光度计（参见材料表）获得SβG紫外（UV）光谱。
   2. 在H₂O_d中制备1.0mg / mL的每个SβG，将溶液转移到石英比色皿中，并在室温下扫描。
4. 分子量分布分析
   1. 使用配备折光率检测器和超水凝胶线性凝胶过滤柱（300 mm x 7.8 mm;图3）。
   2. 使用去离子水作为洗脱液，流速为0.5mL / ^min-1 ，并以葡聚糖（110，80和50kDa）作为标准品在40°C下进行测定（参见 材料表）。收集 5 mL 级分。
5. 傅里叶变换红外 （FTIR） 分析
   1. 在FTIR光谱仪上记录4000-500cm-1范围内的红外光谱（图4）。样品应事先与KBr混合以形成薄膜（标准FTIR程序;请参阅制造商的说明和材料表）。
6. 分子组成分析
   1. 按照标准程序¹²，通过高效薄层色谱（HPTLC）以及气相色谱与质谱联用（GC-MS）估计SβG的分子组成。

2. β-葡聚糖诱导的小胶质细胞刺激的 体外 研究

1. 小鼠胶质母细胞瘤和小胶质细胞在8孔室载玻片中的细胞培养
   注意:本协议特定于GL261（胶质母细胞瘤）和BV2（小胶质细胞）细胞系。然而，通过轻微的修改，这些步骤可能用于研究其他癌症和免疫细胞系。
   1. 准备Dulbecco改性鹰培养基（DMEM）完全培养基，改性L-谷氨酰胺，4.5 g / L D-葡萄糖，不含丙酮酸。加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（见 材料表）。将材料在37°C的水浴中预热15分钟。
   2. 将冷冻的BV2和GL261等分试样解冻到水浴（37°C）中2分钟，在它们完全解冻之前，将它们带入层流罩中，并将细胞接种到两个不同的无菌T25烧瓶中（每个细胞系一个）。
   3. 将T25烧瓶在37°C，5%CO₂ 下孵育，直到培养物汇合。
      注意:根据冷冻条件和冷冻保存时间，汇合前的时间可能会有所不同。这些细胞系通常需要 3 到 5 天才能在 T75 烧瓶中汇合。
   4. BV2细胞培养物汇合后，将其转移到0.6 x 10⁶ 细胞/孔的8孔室载玻片中。将8孔室载玻片在培养箱中保持24小时。
   5. 将小胶质细胞接种到8孔室载玻片中后，对GL261细胞重复相同的方案。
2. 用β-葡聚糖激活小胶质细胞
   1. 用四种不同的β-葡聚糖（P. ostreatus，P. djamor，G. lucidum和H. erinaceus）以0.2mg / mL浓度包被BV2细胞72小时。 一个实验条件必须保持未经处理（正常培养基），作为对照组。
   2. 72小时后用移液管收集上清液，并将剩余体积通过0.20μm注射器过滤器。然后，将上清液在-80°C冷冻至少24小时。
3. 用预活化的小胶质细胞条件培养基处理GL261
   1. 一旦GL261在8孔室载玻片中汇合80%，加入β-葡聚糖处理的小胶质细胞培养基（步骤2.2.2），终体积浓度为25%72小时（总体积:250μl/孔）。
   2. 孵育72小时后取出培养基并丢弃。
   3. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS;pH 7.4，0.1 M）洗涤细胞三次，持续5分钟。
   4. 通过在4°C下加入200μL4%多聚甲醛（PFA）固定细胞15分钟。
      注意:根据可能用于免疫荧光的不同抗体，固定方法可能与典型的4%PFA不同。基于酒精的固定剂在保存某些表位方面可能更有效。
4. 免疫荧光检查
   1. 用Triton X（PBST; 0.01%）用PBS洗涤样品10分钟三次。
   2. 除去PBST并在室温下加入牛血清白蛋白（BSA）封闭缓冲液10%在PBST中（表1）30分钟。
   3. 取出封闭缓冲液，每孔加入200 μL含有一抗混合物（1:500大鼠Ki-67单克隆抗体和1:500兔裂解半胱天冬酶-3抗体;参见 材料表）的PBS。在4°C孵育过夜。
   4. 在4°C孵育24小时后，将样品在室温下放置30分钟。
   5. 在摇床上用PBS洗涤孔三次10分钟（低速）。
   6. 取出PBS，用每孔200μL含有二抗（1:200驴抗大鼠IgG（H + L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488和1:200驴抗兔IgG（H + L）高度交叉吸附二抗Alexa Fluor 647;见 材料表）混合物的PBS混合物在室温下在黑暗中45分钟。
   7. 用PBS在多功能摇床上洗涤样品10分钟。
   8. 取出 PBS，每孔加入 200 μL 在 PBS （1:5，000） 中稀释的 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 1 分钟。
   9. 去除DAPI（见 材料表）并在PBS中洗涤细胞5分钟。
   10. 取下孔框，在每个孔上加入 50 μL PBS:甘油 （1:1），并盖上盖玻片。
   11. 用指甲油密封载玻片。
   12. 使用共聚焦显微镜系统以20倍采集图像（见 材料表）。

3. 肿瘤细胞增殖和凋亡的定量和分析

注意:为了测量不同β-葡聚糖对肿瘤细胞增殖和凋亡的潜在影响，在 ImageJ 软件中使用内部脚本来量化 Ki67（增殖）和 cCasp3（细胞凋亡）的正像素数¹³。

1. 打开图像J。单击 插件按钮。 点击之前安装在插件文件夹中的插件 Coloc2，最后选择要分析¹¹ 的图像。
   注意:此插件是在之前与Vasiliki Economopoulos博士（veconom@uwo.ca）联系后提供的。代替脚本，ImageJ和Fiji软件都有不同的共定位分析工具（参见 材料表），具有相似的属性。
2. 根据对照（未处理，仅限 DMEM）条件设置阈值。点击 OK 按钮。
   注意:为了避免背景和强度差异，所有图像必须在相同条件下拍摄。优选地，成像会议应在同一天进行，并且显微镜参数在图像中保持不变。
3. 确保弹出共定位像素的结果图像和提供高于阈值的像素百分比或原始数量的摘要窗口。根据对照（未处理）条件对结果进行归一化。
   注意:所有数据均以SEM平均值±给出。 使用图形和分析软件进行统计分析（见材料表）。使用具有Tukey多重比较检验的单因素方差分析。误差表示为平均值的标准误差（s.e.m.）（*p < 0.05，**p < 0.01）。

结果

成功纯化β-葡聚糖
表1总结了从毛竹、黄杨、灵芝和猴头孢子实体中获得的MP、SMP和SβG的质量。 从真菌中获得的MP、SMP和SβG的基本组成（总碳水化合物、β-葡聚糖和蛋白质）如表2所示。这些结果表明该方案如何允许在SMP中检索大量蛋白质含量。然而，用α-淀粉酶/葡糖淀粉酶和蛋白酶酶处理减少了蛋白质的量并增加了β-葡聚糖浓?...

讨论

这项工作描述了使用成熟的技术成功地从四种不同的真菌中分离、纯化和表征 SβG 的含量。结果表明，热水提取灰 霉、黄 杨、 灵芝 和猴头孢杆菌的SMPs后，用α-淀粉酶、葡萄糖苷酶和蛋白酶水解处理后，α-葡聚糖和蛋白质的含量降低，从而显著丰富了纯SβGs的含量。

尽管如此，我们观察到大多数真菌β葡聚糖在纯化过程中不溶于水。该研究的主要?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chamber slides	Thermo Fisher, USA	171080
Air-drying oven	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	protease
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
Blade mill	Retsch, Germany	SM100
Bovine Serum Albumin	MERK, Germany	A9418
Cellulose tubing membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
Centrifuge	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
Dextrans	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
FT-IR spectromete	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
Graphing and analysis software	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
Incubator	Eppedorf	Galaxy 170S
Mass Spectometer	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
Paraformaldehyde	MERK, Germany	P6148
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH meter	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
Phosphate-buffered saline	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Abcam, UK	ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal	Thermofisher, USA	MA5-14520
Rotary evaporator	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
UV-Visible spectrophotometer	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
Water bath	J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.	Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-glucans	Setas y Hongos del Sur, S.L.		Supplied the four variants of mushrooms