膠芽腫の免疫療法戦略としての真菌β-グルカンの単離精製

要約

本プロトコールは、膠芽腫細胞に対するミクログリアの抗腫瘍特性を増強する可能性のある免疫調節分子としての4つの異なる真菌β−グルカンの精製ステップおよびその後の研究を記載する。

要約

膠芽腫に対する効果的な治療法を開発する上での最大の課題の1つは、腫瘍微小環境内の強力な免疫抑制を克服することです。免疫療法は、腫瘍細胞に対する免疫系の反応を変えるための効果的な戦略として浮上しています。神経膠腫関連マクロファージおよびミクログリア(GAM)は、このような抗炎症シナリオの主要な推進力である。したがって、GAMにおける抗癌反応を増強することは、膠芽腫患者を治療するための潜在的な補助療法を表す可能性がある。その静脈では、真菌βグルカン分子は強力な免疫調節剤として長い間知られています。自然免疫活性を刺激し、治療反応を改善するそれらの能力が記載されている。これらの調節機能は、興味深いことにGAMで大きく発現しているパターン認識受容体に結合する能力に部分的に起因しています。したがって、この研究は、膠芽腫細胞に対するミクログリアの殺腫瘍応答を増強するための真菌β-グルカンの単離、精製、およびその後の使用に焦点を当てています。マウス神経膠芽腫(GL261)およびミクログリア(BV-2)細胞株は、現在のバイオ医薬品業界で頻繁に使用されているキノコから抽出された4つの異なる真菌βグルカン(ヒラタケ、 ヒラタケジャ モール、 ヘリシウムエリナセウス、および 霊芝)の免疫調節特性をテストするために使用されます。これらの化合物を試験するために、共刺激アッセイを実施して、膠芽腫細胞の増殖およびアポトーシス活性化に対する予め活性化されたミクログリア馴化培地の効果を測定した。

概要

神経腫瘍学の分野における新しい成果の出現にもかかわらず、膠芽腫患者の平均余命は依然としてわずかである。脳腫瘍に対するゴールドスタンダードの治療法は、手術、放射線療法、化学療法の融合に基づいています。しかし、過去10年間で、免疫療法はさまざまな種類の癌を治療するための強力な戦略として浮上しています¹。このように、腫瘍細胞に対する体の免疫応答を利用する可能性は、最近、腫瘍学の第4の柱となっています。

この分野での最大の課題の1つは、腫瘍微小環境内に見られる強力な免疫抑制を克服することであることは長い間知られていました²。特に、脳腫瘍の最も一般的で攻撃的な形態の1つである膠芽腫の場合、そのような腫瘍促進シナリオを調整する重要な経路を解明し、免疫系の抑うつ反応を打ち消す可能性のある新しい化合物を見つけることは、この不治の病に対する将来の治療法への道を開く可能性があります。

脳はそれ自身の免疫系細胞を持っており、最も関連性の高い細胞型はミクログリアです。これらの細胞は、異なる中枢性疾患にわたってかなり複雑な挙動を有することが証明されている³。原発性脳腫瘍(例えば、膠芽腫)の場合、これらの細胞は、腫瘍細胞が脳実質^にコロニーを形成することを支持する抗炎症性表現型に向かってシフトする3。多数の出版物が、腫瘍の進行におけるこれらの細胞の主要な役割を強化している。この主な理由の1つは、神経膠腫関連ミクログリアと浸潤マクロファージ(GAM)が全腫瘍量の3分の1を占めているため、脳腫瘍の進行中の活性化状態の明確な影響を示唆しています^4,5。

その静脈において、真菌βグルカンは、食作用および炎症誘発因子産生を含む効果的な免疫応答を引き起こし、有害な物質の排除につながる強力な分子として説明されています^6,7,8,9,10。真菌βグルカンは、一般に、さまざまなキノコの部分からの抽出物を使用して研究されてきました。しかしながら、特定の効果の帰属は、あいまいさを避け、免疫^調節剤8のような分子の作用機序を理解できるようにするために、その精製を必要とする。

この研究では、可溶性βグルカンは、食用(ヒラタケ および ヒラタケ)および薬用キノコ(霊芝 および ヘリシウムエリナセウス)として定期的に使用される4つの異なるキノコの子実体から精製されます。特に、これらの4つのキノコは、食品および製薬業界で非常に用途があり、営利企業の環境に優しい循環経済内で生産されました( 材料表を参照)。

脳腫瘍治療における真菌βグルカンの将来の使用の基礎を築くためには、明確に定義された精製戦略と免疫系細胞との推定相互作用を掘り下げた前臨床試験が、抗腫瘍メディエーターとしての潜在的な役割を評価するために不可欠です。この研究では、選択したキノコの子実体に含まれる可溶性βグルカンを回収するために必要な分離と精製の多数のステップについて説明しています。精製に成功すると、ミクログリア細胞が活性化され、炎症性表現型が増強されます。マウス神経膠芽腫細胞(GL261)を、これらの抽出物で処理した別のミクログリア馴化培地でコーティングし、腫瘍細胞の挙動に対するその効果を評価します。興味深いことに、私たちの研究室からのパイロット研究(データは示されていません)は、炎症誘発性ミクログリアが膠芽腫細胞だけでなく他の癌細胞株においても腫瘍細胞の移動と浸潤特性をどのように遅らせるかを明らかにしました。この学際的な研究は、腫瘍学研究者が多くの異なる種類の腫瘍における免疫応答を高めることができる有望な化合物をテストするための有用なツールを提供する可能性があります。

プロトコル

このプロトコルに記載されている4つの異なるキノコの変種は、商業的な情報源から入手しました( 材料表を参照)。

1.真菌β-グルカンの単離

1. 可溶性キノコ多糖類の抽出と単離
   注:可溶性キノコ多糖類(SMP)は、 図1に模式的に示される手順に従って得られた。
   1. 新鮮なオズトリタス菌、オズミガ原虫、エリナセウス菌、およびグルシダム子実体(約2,000 g /キノコ)を蒸留水で5回そっとすすぎます。
   2. 子実体を従来の風乾オーブンで50±2°Cで一定の重量に達するまで乾燥させます(~24時間)。
   3. 乾燥したキノコをブレードミルで粉砕し、各キノコから約200 gの粉末を得る。
   4. 100 gのキノコ粉末(MP)(P. ostreatus、 P. djamor、H. erinaceus、 およびG. lucidum)を1,000 mLのH₂O_dに懸濁します。その後、オートクレーブを121°Cで15分間、最後に室温で30分間放置した。
   5. 得られた懸濁液を6,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
   6. 不溶性キノコ多糖類(IMP)を含む沈殿物を50±2°Cの風乾オーブンで24時間乾燥させます。
   7. 沈殿物を捨て、上清を保管してください。上清をロータリーエバポレーターで10倍濃縮します。
   8. SMPを含む濃縮物をエタノール(最終濃度80%)で4°Cで一晩沈殿させます。
   9. エタノール懸濁液を6,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、ペレット(沈殿物)を保持し、上清をピペットで廃棄します。
   10. 沈殿物を80%エタノールで3回洗浄してから、H₂O_d (10%w / v)に溶解します。pHを6.5 / 7に、温度を37°Cに調整し、それぞれ2Uおよび4Uのα-アミラーゼおよびグルコアミラーゼで処理して、製造元の指示に従ってα-グルカンを可溶化します( 材料表を参照)。
   11. α-アミラーゼ/グルコアミラーゼで処理した後、pHと温度をそれぞれ8.0および50°Cに調整し、アルカラーゼ(2.5 U / gタンパク質)で処理してタンパク質を可溶化します( 材料表を参照)。
       注:この連続酵素処理は、エタノール沈殿中のβ-グルカンと共沈するほとんどのα-グルカンおよびタンパク質を除去します。
   12. 加水分解後、加水分解物を6,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、清浄な上清濃縮液をロータリーエバポレーターで5回遠心分離します。80%エタノールで再び沈殿させる。
   13. 得られた沈殿物を_H2Odに可溶化し、セルロースチューブ膜(12,000Daカットオフ膜;材料表参照)を用いて蒸留水中で24時間透析し、低分子量分子を除去した。水溶性部分を回収し、凍結乾燥して可溶性βグルカン(SβG)を生成します。
2. 糖とタンパク質の測定
   1. 各画分の全糖含量をフェノール硫酸法により測定し、標準物質⁸としてグルコースを用いた。
      注:β-グルカン含量の定量は、酵素加水分解および酸化還元酵素(すなわち、exo-1,3-β-グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ、およびペルオキシダーゼ)の活性に基づいて、β-グルカンアッセイキット(キノコおよび酵母;材料 表を参照)を使用して行うこともできます。製造元の指示に従ってください。
   2. 12 MH 2 SO 4の代わりに 18 MH₂SO₄ を使用してください。
   3. 総グルカンとαグルカンの含有量を別々に評価します。
   4. 得られたβグルカン値を、ケルダールプロトコルに従って、総グルカン値とαグルカン(トリプリケート)値の差として測定します。特定の場合において、タンパク質含量は、検量線¹¹、¹²をプロットするためにアルブミンを用いて^、Lowry法によって決定することができる。
3. 紫外吸収分光分析
   1. 200〜400 nm領域のサンプルをスキャンして、紫外可視分光光度計( 材料の表を参照)を使用してSβG紫外(UV)スペクトルを取得します(図2)。
   2. H₂O_d中の各SβGを1.0 mg/mL調製し、溶液を石英キュベットに移し、室温でスキャンします。
4. 分子量分布解析
   1. 屈折率検出器とウルトラヒドロゲルリニアゲルろ過カラム(300 mm x 7.8 mm;図3)。
   2. 0.5 mL/^min-1 の流速で溶離液として脱イオン水を使用し、標準物質としてデキストラン(110、80、および50 kDa)を使用して、40°Cでアッセイを実行します( 材料表を参照)。5 mLの画分を収集します。
5. フーリエ変換赤外(FTIR)解析
   1. FTIR分光計で4000〜500 ^cm-1の範囲の赤外スペクトル(図4)を記録します。サンプルは、フィルムを形成するために事前にKBrと混合する必要があります(標準のFTIR手順;製造元の指示と材料表を参照)。
6. 分子組成解析
   1. 標準的な手順に従って、高速薄層クロマトグラフィー(HPTLC)および質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー(GC-MS)によってSβGの分子組成を推定します¹²。

2. βグルカン誘発ミクログリア刺激の in vitro 研究

1. 8ウェルチャンバースライドでのマウス膠芽腫およびミクログリア細胞の細胞培養
   注:このプロトコルは、GL261(膠芽腫)およびBV2(ミクログリア)細胞株に特異的です。ただし、わずかな変更を加えることで、これらのステップを使用して他の癌および免疫細胞株を研究することができる可能性があります。
   1. L-グルタミン、4.5 g / L D-グルコース、およびピルビン酸を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)完全培地を準備します。10%のウシ胎児血清(FBS)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを追加します( 材料表を参照)。材料を37°Cの水浴中で15分間予熱します。
   2. 凍結したBV2およびGL261アリコートを水浴(37°C)に2分間解凍し、完全に解凍する直前にそれらを層流フードに運び、細胞を2つの異なる滅菌T25フラスコ(各細胞株に1つ)にプレートします。
   3. T25フラスコを37°C、5%_CO2 で培養物がコンフルエントになるまでインキュベートします。
      注意: 凍結条件と凍結保存時間に応じて、合流までの時間は異なる場合があります。これらの細胞株は通常、T75フラスコ内でコンフルエントに達するまでに3〜5日かかります。
   4. BV2細胞培養がコンフルエントになったら、0.6 x 10⁶ 細胞/ウェルの8ウェルチャンバースライドに移します。8ウェルチャンバースライドをインキュベーター内に24時間保持します。
   5. ミクログリア細胞を8ウェルチャンバースライドに播種したら、GL261細胞で同じプロトコルを繰り返します。
2. β-グルカンによるミクログリアの活性化
   1. BV2細胞を4つの異なるβグルカン(オズトリータス菌、 ジャモール原虫、 G.ルシダム、 エリナセウス菌)で0.2 mg/mLの濃度で72時間コーティングします。1つの実験条件は未処理のままでなければならず(正常培地)、対照群として機能する。
   2. 72時間後にピペットで上清を収集し、残りの容量を0.20μmのシリンジフィルターに通します。その後、上清を-80°Cで少なくとも24時間凍結します。
3. GL261の活性化ミクログリア馴化培地による治療
   1. GL261が8ウェルチャンバースライド内で80%コンフルエントになったら、βグルカン処理ミクログリア培地(ステップ2.2.2)を最終容量濃度25%で72時間加えます(総容量:250 μl/ウェル)。
   2. 72時間のインキュベーション後に培地を取り出し、廃棄する。
   3. 細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH 7.4, 0.1 M)で5分間3回洗浄します。
   4. 200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を4°Cで15分間添加して細胞を固定します。
      注:免疫蛍光に使用される可能性のあるさまざまな抗体に応じて、固定方法は一般的な4%PFAとは異なる場合があります。アルコールベースの固定剤は、特定のエピトープを保存するのにより効率的である可能性があります。
4. 免疫蛍光試験
   1. サンプルをトリトンX(PBST;0.01%)を含むPBSで10分間3回洗浄します。
   2. PBSTを除去し、ウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキングバッファーをPBST(表1)に10%加え、室温で30分間加えます。
   3. ブロッキングバッファーを除去し、一次抗体混合物(1:500ラットKi-67モノクローナル抗体および1:500ウサギ切断カスパーゼ-3抗体; 材料表参照)を含むPBSをウェルあたり200 μL加えます。4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 4°Cで24時間インキュベートした後、サンプルを室温で30分間放置します。
   5. ウェルをシェーカー(低速)上のPBSで10分間3回洗浄します。
   6. PBSを取り出し、二次抗体(1:200ロバ抗ラットIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488および1:200ロバ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647; 材料表参照)の混合物を含むPBSを1ウェルあたり200 μLに交換し、室温、暗所で45分間処理します。
   7. サンプルをPBSで多目的シェーカーで10分間洗浄します。
   8. PBSを取り出し、PBS(1:5,000)で1分間希釈した4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をウェルあたり200 μL加えます。
   9. DAPIを除去し( 材料の表を参照)、PBSで細胞を5分間洗浄します。
   10. ウェルフレームを取り外し、各ウェルに50 μLのPBS:グリセロール(1:1)を加え、カバーガラスで覆います。
   11. スライドをマニキュアで密封します。
   12. 共焦点顕微鏡システムを使用して20倍で画像を取得します( 材料表を参照)。

3. 腫瘍細胞の増殖とアポトーシスの定量と解析

注:腫瘍細胞の増殖とアポトーシスに対するさまざまなβグルカンの潜在的な影響を測定するために、ImageJソフトウェアで社内スクリプトを使用して、Ki67(増殖)とcCasp3(アポトーシス)の正のピクセル数を定量化しました¹³。

1. イメージ J を開きます。 [プラグイン] ボタンをクリックします。以前にプラグインフォルダにインストールされたプラグインである Coloc2をクリックし、最後に分析する画像を選択します¹¹.
   注:このプラグインは、Vasiliki Economopoulos博士(veconom@uwo.ca)との以前の接触の後に利用可能でした。スクリプトの代わりに、ImageJとFijiのソフトウェアには、同様の特性を持つ共局在解析用の異なるツールがあります( 材料表を参照)。
2. コントロール(未処理、DMEMのみ)の条件に従って閾値を設定します。OK ボタンをクリックします。
   注意: 背景と強度の不一致を避けるために、すべての画像を同じ条件で撮影する必要があります。好ましくは、イメージングセッションは同じ日に実行され、顕微鏡パラメータは画像間で変更されないべきである。
3. 共局在ピクセルの結果の画像と、しきい値を超えるピクセルの割合または生の数を示す概要ウィンドウがポップアップ表示されることを確認します。対照(未処理)条件に関して結果を正規化する。
   注:すべてのデータはSEM±平均値として与えられ、統計分析はグラフ作成および分析ソフトウェアを使用して実行されました(材料表を参照)。テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を使用しました。誤差は平均の標準誤差 (s.e.m.) (*p < 0.05, **p < 0.01) として表されます。

結果

β-グルカンの精製に成功
P. ostreatus、 P. djamor、 G. lucidum、および H. erinaceus の子実体から抽出および精製プロセス後に得られた MP、SMP、および SβG の質量を 表 1 にまとめた。真菌から得られたMP、SMP、およびSβGの基本組成(総炭水化物、βグルカン、およびタンパク質)を 表2に示します。これらの結果は、プロトコルがSMP中の大...

ディスカッション

この研究では、4つの異なる真菌からSβGの含有量を首尾よく分離、精製、および特性評価するための確立された技術の使用について説明しています。その結果、 P. ostreatus、 P. djamor、 G. lucidum、 H. erinaceusから得られたSMPを熱水抽出した後、α-アミラーゼ、グルコシダーゼ、プロテアーゼで加水分解処理した後、α-グルカンとタンパク質の含有量が減少し、純粋なSβG?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chamber slides	Thermo Fisher, USA	171080
Air-drying oven	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	protease
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
Blade mill	Retsch, Germany	SM100
Bovine Serum Albumin	MERK, Germany	A9418
Cellulose tubing membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
Centrifuge	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
Dextrans	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
FT-IR spectromete	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
Graphing and analysis software	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
Incubator	Eppedorf	Galaxy 170S
Mass Spectometer	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
Paraformaldehyde	MERK, Germany	P6148
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH meter	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
Phosphate-buffered saline	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Abcam, UK	ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal	Thermofisher, USA	MA5-14520
Rotary evaporator	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
UV-Visible spectrophotometer	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
Water bath	J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.	Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-glucans	Setas y Hongos del Sur, S.L.		Supplied the four variants of mushrooms