Isolement et purification du β-glucane fongique comme stratégie d’immunothérapie pour le glioblastome

Résumé

Le présent protocole décrit les étapes de purification et les études ultérieures de quatre β-glucanes fongiques différents en tant que molécules immunomodulatrices potentielles qui améliorent les propriétés antitumorales de la microglie contre les cellules de glioblastome.

Résumé

L’un des plus grands défis dans le développement de thérapies efficaces contre le glioblastome est de surmonter la forte suppression immunitaire dans le microenvironnement tumoral. L’immunothérapie est apparue comme une stratégie efficace pour retourner la réponse du système immunitaire contre les cellules tumorales. Les macrophages et microglies associés aux gliomes (GAM) sont les principaux moteurs de tels scénarios anti-inflammatoires. Par conséquent, l’amélioration de la réponse anticancéreuse dans les GAM peut représenter un traitement coadjuvant potentiel pour traiter les patients atteints de glioblastome. Dans cette veine, les molécules fongiques β-glucane sont connues depuis longtemps comme de puissants modulateurs immunitaires. Leur capacité à stimuler l’activité immunitaire innée et à améliorer la réponse au traitement a été décrite. Ces caractéristiques modulatrices sont en partie attribuées à leur capacité à se lier aux récepteurs de reconnaissance de formes, qui, fait intéressant, sont grandement exprimés dans les GAM. Ainsi, ce travail est axé sur l’isolement, la purification et l’utilisation ultérieure de β-glucanes fongiques pour améliorer la réponse tumoricide de la microglie contre les cellules de glioblastome. Les lignées cellulaires de glioblastome de souris (GL261) et de microglie (BV-2) sont utilisées pour tester les propriétés immunomodulatrices de quatre β-glucanes fongiques différents extraits de champignons fortement utilisés dans l’industrie biopharmaceutique actuelle: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus et Ganoderma lucidum. Pour tester ces composés, des tests de co-stimulation ont été effectués pour mesurer l’effet d’un milieu conditionné par la microglie pré-activé sur la prolifération et l’activation de l’apoptose dans les cellules de glioblastome.

Introduction

Malgré l’avènement de nouvelles réalisations dans le domaine de la neuro-oncologie, l’espérance de vie des patients atteints de glioblastome reste maigre. Les thérapies de référence contre les tumeurs cérébrales sont basées sur la fusion de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie. Cependant, au cours de la dernière décennie, l’immunothérapie est apparue comme une stratégie puissante pour traiter différents types de cancer¹. Ainsi, la possibilité d’exploiter la réponse immunitaire de l’organisme contre les cellules tumorales est récemment devenue le quatrième pilier de l’oncologie.

On sait depuis longtemps que l’un des plus grands défis dans le domaine est de surmonter la forte immunosuppression trouvée dans le microenvironnement tumoral². En particulier, dans le cas du glioblastome, l’une des formes les plus courantes et les plus agressives de cancer du cerveau, démêler les voies clés qui orchestrent de tels scénarios pro-tumoraux et trouver de nouveaux composés qui pourraient contrecarrer la réponse déprimante du système immunitaire pourrait ouvrir la voie à de futures thérapies contre cette maladie incurable.

Le cerveau possède ses propres cellules du système immunitaire, et le type de cellule le plus pertinent est la microglie. Il a été prouvé que ces cellules ont un comportement assez complexe à travers différentes maladies centrales³. Dans le cas des tumeurs cérébrales primaires (par exemple, le glioblastome), ces cellules sont déplacées vers un phénotype anti-inflammatoire qui soutient les cellules tumorales pour coloniser le parenchyme cérébral³. De nombreuses publications ont renforcé le rôle majeur de ces cellules au cours de la progression tumorale. L’une des principales raisons en est que les microglies associées au gliome et les macrophages infiltrés (GAM) représentent un tiers de la masse tumorale totale, suggérant ainsi l’influence sans équivoque de leurs états d’activation au cours de la progression tumorale^{cérébrale 4,5}.

Dans cette veine, les β-glucanes fongiques ont été décrits comme des molécules puissantes déclenchant des réponses immunitaires efficaces, y compris la phagocytose et la production de facteurs pro-inflammatoires, conduisant à l’élimination des agents pernicieux 6,7,8,9,10. Les β-glucanes fongiques ont généralement été étudiés en utilisant des extraits de différentes parties de champignons. Cependant, l’attribution d’effets spécifiques nécessite sa purification pour éviter les ambiguïtés et pouvoir comprendre le mécanisme d’action de telles molécules comme les agents immunomodulateurs⁸.

Dans ce travail, les β-glucanes solubles sont purifiés à partir de la fructification de quatre champignons différents, régulièrement utilisés comme champignons comestibles (Pleurotus ostreatus et Pleurotus djamor) et comme champignons médicinaux (Ganoderma lucidum et Hericium erinaceus). En particulier, ces quatre champignons sont très utilisés dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique et ont été produits dans le cadre d’une économie circulaire respectueuse de l’environnement dans une entreprise commerciale (voir le tableau des matériaux).

Afin de jeter les bases de l’utilisation future des β-glucanes fongiques dans les thérapies du cancer du cerveau, des stratégies de purification bien définies et des études précliniques approfondissant leur interaction présumée avec les cellules du système immunitaire sont essentielles pour évaluer leur rôle potentiel en tant que médiateurs antitumoraux. Ce travail décrit les nombreuses étapes d’isolement et de purification nécessaires pour récupérer les β-glucanes solubles contenus dans les fructifications du champignon sélectionné. Une fois purifiées avec succès, les cellules microgliales sont activées pour améliorer leur phénotype inflammatoire. Les cellules de glioblastome de souris (GL261) sont recouvertes d’un milieu différent conditionné par la microglie, préalablement traité avec ces extraits, puis son effet sur le comportement des cellules tumorales est évalué. Fait intéressant, des études pilotes de notre laboratoire (données non montrées) ont révélé comment la microglie pro-inflammatoire peut ralentir la migration des cellules tumorales et les propriétés d’invasion non seulement dans les cellules de glioblastome, mais aussi dans d’autres lignées cellulaires cancéreuses. Ce travail multidisciplinaire peut fournir un outil utile aux chercheurs en oncologie pour tester des composés prometteurs capables de stimuler la réponse immunitaire dans de nombreux types de tumeurs.

Protocole

Les quatre variantes différentes de champignons décrites dans ce protocole ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Isolement des β-glucanes fongiques

1. Extraction et isolement des polysaccharides solubles des champignons
   NOTE: Les polysaccharides solubles de champignons (SMP) ont été obtenus selon la procédure schématiquement illustrée à la figure 1.
   1. Rincer doucement les fructifications fraîches de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus et G. lucidum (environ 2 000 g/champignon) dans de l’eau distillée cinq fois.
   2. Sécher les corps des fruits à 50 ± 2 °C dans une étuve de séchage à air conventionnelle jusqu’à ce qu’un poids constant soit atteint (~24 h).
   3. Broyer les champignons séchés dans un moulin à lames, en obtenant environ 200 g de poudre de chaque champignon.
   4. Suspendre 100 g de poudre de champignons (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus et G. lucidum) dans 1 000 mL de_H2Od. Ensuite, autoclaver à 121 °C pendant 15 min, et enfin laisser à température ambiante pendant 30 min.
   5. Centrifuger la suspension obtenue à 6 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   6. Sécher le précipité contenant des polysaccharides de champignons insolubles (IMP) à 50 ± 2 °C dans une étuve de séchage à l’air pendant 24 h.
   7. Jeter le précipité et conserver le surnageant. Concentrer le surnageant 10 fois dans un évaporateur rotatif.
   8. Précipiter le concentré contenant des SMP avec de l’éthanol (concentration finale de 80 %) à 4 °C pendant une nuit.
   9. Centrifuger la suspension d’éthanol à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C, retenir la pastille (précipiter) et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
   10. Laver le précipité trois fois avec de l’éthanol à 80% avant de le dissoudre dans H₂O_d (10% p/v). Ajuster le pH à 6,5/7 et la température à 37 °C, et traiter avec 2 u et 4 U de α-amylase et de glucoamylase, respectivement, pour solubiliser les α-glucanes en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   11. Après le traitement par α-amylase/glucoamylase, ajuster le pH et la température à 8,0 et 50 °C, respectivement, et traiter avec de l’alcalase (2,5 U/g de protéines) (voir le tableau des matières) pour solubiliser les protéines.
       REMARQUE: Ce traitement enzymatique séquentiel élimine la plupart des α-glucanes et des protéines qui coprécipitent avec les β-glucanes dans la précipitation de l’éthanol.
   12. Après hydrolyse, centrifuger l’hydrolysat à 6 000 x g pendant 15 min à 4 °C et le surnageant propre concentré cinq fois dans un évaporateur rotatif. Précipiter à nouveau avec de l’éthanol à 80%.
   13. Solubiliser le précipité résultant dans_H2Odet dialyser dans de l’eau distillée pendant 24 h à l’aide de membranes de tubes en cellulose (membranes de coupure de 12 000 Da; voir le tableau des matériaux) pour éliminer les molécules de faible poids moléculaire. Récupérer la partie soluble dans l’eau et la lyophiliser pour produire des β-glucanes solubles (SβGs).
2. Mesure du sucre et des protéines
   1. Mesurer la teneur totale en sucre de chaque fraction par la méthode de l’acide phénol-sulfurique, en utilisant le glucose comme norme⁸.
      NOTE: La quantification de la teneur en β-glucane peut également être effectuée à l’aide de la trousse de dosage du β-glucane (champignon et levure; voir le tableau des matériaux), basée sur l’hydrolyse enzymatique et l’activité des oxydoréductases: à savoir l’exo-1,3-β-glucanase, la glucose oxydase, la β-glucosidase et la peroxydase, avec formation ultérieure de la quinoneimine. Suivez les instructions du fabricant, avec de légères modifications.
   2. Utilisez 18 MH 2 SO4 au lieu de 12 MH₂SO₄.
   3. Évaluer séparément la teneur en glucanes totaux et en α-glucanes.
   4. Mesurez les valeurs de β-glucane résultantes comme la différence entre les valeurs de glucane total et de α-glucane (triplicate) selon le protocole de Kjeldahl. Dans certains cas, la teneur en protéines peut être déterminée par la méthode de Lowry, en utilisant l’albumine pour tracer la courbe d’étalonnage^11,12.
3. Analyse par spectroscopie d’absorption ultraviolette
   1. Obtenir les spectres ultraviolets (UV) SβG à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible (voir le tableau des matériaux) en balayant les échantillons dans la région de 200 à 400 nm (Figure 2).
   2. Préparer 1,0 mg/mL de chaque SβG dans_{H2O, transférer} la solution dans une cuvette de quartz et scanner à température ambiante.
4. Analyse de la distribution du poids moléculaire
   1. Estimer l’homogénéité des SβG et le poids moléculaire des polymères par chromatographie d’exclusion granulométrique (SEC) à l’aide d’un système de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) (voir Tableau des matériaux) équipé d’un détecteur d’indice de réfraction et d’une colonne de filtration linéaire sur gel ultra-hydrogel (300 mm x 7,8 mm; Graphique 3).
   2. Effectuer l’essai à 40 °C en utilisant de l’eau désionisée comme éluant à un débit de 0,5 mL/^min-1 et des dextranes (110, 80 et 50 kDa) comme étalons (voir le tableau des matériaux). Recueillir une fraction de 5 mL.
5. Analyse infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)
   1. Enregistrer les spectres infrarouges (Figure 4) sur un spectromètre FTIR dans la plage de 4000-500 ^cm-1. Les échantillons doivent être préalablement mélangés avec du KBr pour former des films (procédure IRTF standard; voir les instructions du fabricant et le tableau des matériaux).
6. Analyse de la composition moléculaire
   1. Estimer les compositions moléculaires des SβG par chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) ainsi que par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), en suivant les procédures standard¹².

2. Étude in vitro de la stimulation microgliale induite par le β-glucane

1. Culture cellulaire de cellules de glioblastome et de microglie de souris dans des lames de chambre à 8 puits
   REMARQUE: Ce protocole est spécifique pour les lignées cellulaires GL261 (glioblastome) et BV2 (microglie). Cependant, avec de légères modifications, ces étapes pourraient potentiellement être utilisées pour étudier d’autres lignées cellulaires cancéreuses et immunitaires.
   1. Préparer le milieu complet Eagle’s medium modifié (DMEM) de Dulbecco modifié avec du L-glutamine, 4,5 g/L de D-glucose et sans pyruvate. Ajouter 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matières). Préchauffer le matériau au bain-marie à 37 °C pendant 15 min.
   2. Décongeler les aliquotes BV2 et GL261 congelées dans un bain-marie (37 °C) pendant 2 min, et juste avant qu’elles ne décongèlent complètement, les transporter dans une hotte à flux laminaire et plaquer les cellules dans deux flacons T25 stériles différents (un pour chaque lignée cellulaire).
   3. Incuber les fioles T25 à 37 °C, 5% CO₂ jusqu’à ce que la culture soit confluente.
      NOTE: Selon les conditions de congélation et le temps de cryoconservation, le temps jusqu’à la confluence peut varier. Ces lignées cellulaires ont généralement besoin de 3 à 5 jours pour atteindre la confluence dans un flacon T75.
   4. Une fois que la culture cellulaire BV2 devient confluente, transférez-la dans des lames de chambre à 8 puits 0,6 x 10⁶ cellules / puits. Conservez les lames de chambre à 8 puits dans l’incubateur pendant 24 h.
   5. Une fois que les cellules microgliales sont plaquées dans les lames de chambre à 8 puits, répétez le même protocole avec les cellules GL261.
2. Activation de la microglie avec des β-glucanes
   1. Enduisez les cellules BV2 de quatre β-glucanes différents (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus) à une concentration de 0,2 mg/mL pendant 72 h. Une condition expérimentale doit rester non traitée (milieu normal), agissant comme groupe témoin.
   2. Recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette après 72 h et passer le volume restant à travers un filtre à seringue de 0,20 μm. Ensuite, congeler le surnageant à -80 °C pendant au moins 24 h.
3. Traitement du GL261 avec un milieu pré-activé conditionné par la microglie
   1. Une fois que le GL261 est confluent à 80 % dans les lames de la chambre à 8 puits, ajouter un milieu microglial traité au β-glucane (étape 2.2.2) à une concentration volumique finale de 25 % pendant 72 h (volume total : 250 μl/puits).
   2. Retirez le milieu après 72 h d’incubation et jetez-le.
   3. Laver les cellules avec une solution saline tampon phosphate (PBS; pH 7,4, 0,1 M) trois fois pendant 5 minutes.
   4. Fixez les cellules en ajoutant 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C pendant 15 min.
      REMARQUE: Selon les différents anticorps qui pourraient être utilisés pour l’immunofluorescence, les méthodes de fixation peuvent différer de la PFA typique à 4%. Les fixateurs à base d’alcool peuvent être plus efficaces pour préserver certains épitopes.
4. Étude d’immunofluorescence
   1. Laver les échantillons avec du PBS avec du triton X (PBST; 0,01%) pendant 10 minutes trois fois.
   2. Retirer le PBST et ajouter le tampon bloquant l’albumine sérique bovine (BSA) à 10 % dans le PBST (tableau 1) pendant 30 min à température ambiante.
   3. Retirer le tampon de blocage et ajouter 200 μL par puits de PBS contenant le mélange d’anticorps primaires (anticorps monoclonal Ki-67 de rat 1:500 et anticorps de caspase-3 clivé de lapin 1:500; voir le tableau des matières). Incuber pendant une nuit à 4 °C.
   4. Après 24 h d’incubation à 4 °C, laisser les échantillons à température ambiante pendant 30 min.
   5. Lavez les puits trois fois pendant 10 min avec du PBS sur un agitateur (basse vitesse).
   6. Retirer le PBS et le remplacer par 200 μL par puits de PBS contenant le mélange d’anticorps secondaires (anticorps secondaires 1:200 IgG anti-rat d’âne (H + L) anticorps secondaire fortement adsorbé, Alexa Fluor 488 et 1:200 IgG anti-lapin (H + L) anticorps secondaire fortement adsorbé par des oreilles croisées, Alexa Fluor 647; voir Tableau des matériaux) pendant 45 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
   7. Laver les échantillons avec du PBS pendant 10 min sur un agitateur polyvalent.
   8. Retirer le PBS et ajouter 200 μL par puits de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilué dans du PBS (1:5 000) pendant 1 min.
   9. Retirer le DAPI (voir Tableau des matières) et laver les cellules pendant 5 min dans du PBS.
   10. Retirez le cadre du puits et ajoutez 50 μL de PBS:glycérol (1:1) sur chaque puits et couvrez avec une lamelle de couverture.
   11. Scellez les lames avec du vernis à ongles.
   12. Acquérir des images à 20x à l’aide d’un système de microscope confocal (voir Tableau des matériaux).

3. Quantification et analyse de la prolifération et de l’apoptose des cellules tumorales

REMARQUE : Afin de mesurer l’effet potentiel des différents β-glucanes sur la prolifération et l’apoptose des cellules tumorales, un script interne a été utilisé dans le logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de pixels positifs de Ki67 (prolifération) et cCasp3 (apoptose)¹³.

1. Ouvrez ImageJ. Cliquez sur le bouton Plugins . Cliquez sur Coloc2, un plugin précédemment installé dans le dossier plugin, et enfin sélectionnez l’image à analyser¹¹.
   REMARQUE: Ce plugin était disponible suite à un contact précédent avec le Dr Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Au lieu du script, les logiciels ImageJ et Fiji ont des outils différents pour l’analyse de la colocalisation (voir Tableau des matériaux), avec des propriétés similaires.
2. Définissez des seuils en fonction des conditions de contrôle (non traité, DMEM uniquement). Cliquez sur le bouton OK .
   REMARQUE: Afin d’éviter les différences d’arrière-plan et d’intensité, toutes les images doivent être prises dans les mêmes conditions. De préférence, les séances d’imagerie doivent être effectuées le même jour et les paramètres du microscope ne sont pas modifiés d’une image à l’autre.
3. Assurez-vous que les images résultantes des pixels colocalisés et une fenêtre récapitulative indiquant le pourcentage ou le nombre brut de pixels au-dessus du seuil apparaissent. Normaliser les résultats par rapport aux conditions de contrôle (non traitées).
   NOTE: Toutes les données sont données sous forme de moyenne ± MEB. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse (voir le tableau des matériaux). Une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey a été utilisée. Les erreurs sont représentées par l’erreur-type de la moyenne (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).

Résultats

Purification réussie des β-glucanes
La masse de MP, SMP et SβG obtenue à partir des fructifications de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus après le processus d’extraction et de purification est résumée dans le tableau 1. La composition de base (glucides totaux, β-glucanes et protéines) des MP, SMP et SβG obtenus à partir des champignons est représentée dans le tableau 2. Ces résultats montrent comment...

Discussion

Ce travail décrit l’utilisation de techniques bien établies pour isoler, purifier et caractériser avec succès la teneur en SβG de quatre champignons différents. Les résultats ont montré comment, après l’extraction à l’eau chaude des SMP, obtenue à partir de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus, suivie d’un traitement hydrolytique à la α-amylase, à la glucosidase et à la protéase, la teneur en α-glucane et en protéines a été réduite, enrichissant ainsi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chamber slides	Thermo Fisher, USA	171080
Air-drying oven	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	protease
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
Blade mill	Retsch, Germany	SM100
Bovine Serum Albumin	MERK, Germany	A9418
Cellulose tubing membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
Centrifuge	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
Dextrans	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
FT-IR spectromete	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
Graphing and analysis software	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
Incubator	Eppedorf	Galaxy 170S
Mass Spectometer	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
Paraformaldehyde	MERK, Germany	P6148
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH meter	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
Phosphate-buffered saline	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Abcam, UK	ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal	Thermofisher, USA	MA5-14520
Rotary evaporator	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
UV-Visible spectrophotometer	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
Water bath	J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.	Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-glucans	Setas y Hongos del Sur, S.L.		Supplied the four variants of mushrooms