교모세포종에 대한 면역요법 전략으로서의 진균성 β-글루칸의 분리 및 정제

요약

본 프로토콜은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 항종양 특성을 향상시키는 잠재적인 면역 조절 분자로서 4가지 다른 진균 β글루칸의 정제 단계 및 후속 연구를 설명합니다.

초록

교모세포종에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 있어 가장 큰 과제 중 하나는 종양 미세 환경 내에서 강력한 면역 억제를 극복하는 것입니다. 면역 요법은 종양 세포에 대한 면역계 반응을 돌리는 효과적인 전략으로 부상했습니다. 신경아교종 관련 대식세포 및 미세아교세포(GAM)는 이러한 항염증 시나리오의 주요 동인입니다. 따라서 GAM에서 항암 반응을 향상시키는 것은 교모세포종 환자를 치료하기 위한 잠재적인 공동 보조 요법을 나타낼 수 있습니다. 그런 맥락에서 곰팡이 β글루칸 분자는 오랫동안 강력한 면역 조절제로 알려져 왔습니다. 선천성 면역 활동을 자극하고 치료 반응을 개선하는 능력이 설명되었습니다. 이러한 조절 기능은 부분적으로 패턴 인식 수용체에 결합하는 능력에 기인하며, 흥미롭게도 GAM에서 크게 표현됩니다. 따라서 이 작업은 교모세포종 세포에 대한 미세아교세포의 종양 반응을 향상시키기 위한 진균 β글루칸의 분리, 정제 및 후속 사용에 중점을 둡니다. 마우스 교모세포종(GL261) 및 미세아교세포(BV-2) 세포주는 현재 바이오 제약 산업에서 많이 사용되는 버섯에서 추출한 4가지 다른 진균 β글루칸(Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus 및 Ganoderma lucidum)의 면역 조절 특성을 테스트하는 데 사용됩니다. 이들 화합물을 시험하기 위해, 교모세포종 세포에서의 증식 및 세포자멸사 활성화에 대한 사전 활성화된 미세아교세포-조건화 배지의 효과를 측정하기 위해 공동-자극 분석을 수행하였다.

서문

신경 종양학 분야에서 새로운 업적이 출현 했음에도 불구하고 교 모세포종 환자의 기대 수명은 여전히 미미합니다. 뇌종양에 대한 표준 치료법은 수술, 방사선 요법 및 화학 요법의 융합을 기반으로 합니다. 그러나 지난 10년 동안 면역요법은 다양한 유형의 암을 치료하기 위한 강력한 전략으로 부상했다¹. 따라서 종양 세포에 대한 신체의 면역 반응을 활용할 수 있는 가능성은 최근 종양학의 네 번째 기둥이 되었습니다.

이 분야에서 가장 큰 과제 중 하나는 종양^{미세환경2}에서 발견되는 강력한 면역억제를 극복하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 특히, 가장 흔하고 공격적인 형태의 뇌암 중 하나인 교모세포종의 경우, 이러한 종양 전(前)종양 시나리오를 조율하는 주요 경로를 밝히고 면역 체계의 우울한 반응을 상쇄할 수 있는 새로운 화합물을 찾는 것은 이 난치병에 대한 미래 치료법의 길을 열 수 있습니다.

뇌는 자체 면역 체계 세포를 가지고 있으며 가장 관련성이 높은 세포 유형은 미세 아교 세포입니다. 이 세포들은 서로 다른 중추 질환에 걸쳐 다소 복잡한 행동을 하는 것으로 입증되었다³. 원발성 뇌종양(예: 교모세포종)의 경우, 이들 세포는 종양 세포가 뇌 실질에 서식하도록 지원하는 항염증 표현형으로 이동한다³. 수많은 출판물이 종양 진행 동안 이러한 세포의 주요 역할을 향상시켰습니다. 그 주된 이유 중 하나는 신경교종 관련 미세아교세포와 침윤성 대식세포(GAM)가 전체 종양 질량의 1/3을 차지하기 때문에 뇌종양 진행 중 활성화 상태의 명백한 영향을 시사하기 때문입니다 ^4,5.

이러한 맥락에서 진균 β-글루칸은 식균 작용 및 전염증 인자 생성을 포함한 효과적인 면역 반응을 유발하는 강력한 분자로 설명되어 악성 물질인 ^6,7,8,9,10을 제거합니다. 곰팡이 β글루칸은 일반적으로 다른 버섯 부분의 추출물을 사용하여 연구되었습니다. 그러나, 특정 효과의 귀속은 모호성을 피하고 면역조절제⁸와 같은 분자의 작용 기전을 이해할 수 있도록 정제를 필요로 한다.

이 연구에서 용해성 β 글루칸은 식용 버섯 (Pleurotus ostreatus 및 Pleurotus djamor) 및 약용 버섯 (Ganoderma lucidum 및 Hericium erinaceus)으로 정기적으로 사용되는 4 가지 버섯의 자실체에서 정제됩니다. 특히, 이 4가지 버섯은 식품 및 제약 산업에서 많이 사용되며 상업 기업의 환경 친화적인 순환 경제 내에서 생산되었습니다( 재료 표 참조).

뇌암 치료에서 진균 β글루칸의 향후 사용을 위한 토대를 마련하기 위해서는 항종양 매개체로서의 잠재적 역할을 평가하기 위해 잘 정의된 정제 전략과 면역계 세포와의 추정 상호 작용을 탐구하는 전임상 연구가 필수적입니다. 이 작업은 선택된 버섯의 자실체 내에 포함된 용해성 β글루칸을 회수하는 데 필요한 수많은 분리 및 정제 단계를 설명합니다. 성공적으로 정제되면 미세아교세포가 활성화되어 염증 표현형이 향상됩니다. 마우스 교모세포종 세포(GL261)를 이전에 이러한 추출물로 처리한 다른 미세아교세포 조절 배지로 코팅한 다음 종양 세포의 행동에 미치는 영향을 평가합니다. 흥미롭게도, 우리 연구실의 파일럿 연구 (데이터는 표시되지 않음)는 전 염증성 미세 아교 세포가 교 모세포종 세포뿐만 아니라 다른 암 세포주에서도 종양 세포 이동 및 침윤 특성을 늦출 수있는 방법을 밝혀 냈습니다. 이 다학제적 연구는 종양학 연구자들이 다양한 유형의 종양에서 면역 반응을 높일 수 있는 유망한 화합물을 테스트하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 4가지 다른 버섯 변종은 상업적 출처에서 얻은 것입니다( 재료 표 참조).

1. 곰팡이 β글루칸의 분리

1. 용해성 버섯 다당류의 추출 및 분리
   참고: 가용성 버섯 다당류(SMP)는 그림 1에 개략적으로 표시된 절차에 따라 얻었습니다.
   1. 신선한 P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus 및 G. lucidum 자실체(약 2,000g/버섯)를 증류수로 5회 부드럽게 헹굽니다.
   2. 자실체를 50 ± 2 °C에서 일정한 무게에 도달 할 때까지 기존의 공기 건조 오븐에서 건조시킵니다 (~ 24 시간).
   3. 말린 버섯을 블레이드 밀에 갈아서 각 버섯에서 약 200g의 분말을 얻습니다.
   4. 100g의 버섯 분말(MP)(P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus 및 G. lucidum)을 1,000mL의_H2Od에 현탁합니다. 이어서, 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하고, 마지막으로 실온에서 30분 동안 방치한다.
   5. 생성된 현탁액을 4°C에서 10분 동안 6,000 x g 에서 원심분리한다.
   6. 불용성 버섯 다당류(IMP)를 함유하는 침전물을 공기 건조 오븐에서 50± 2°C에서 24시간 동안 건조시킵니다.
   7. 침전물을 버리고 상청액을 유지하십시오. 상청액을 회전 증발기에서 10 회 농축합니다.
   8. SMPs를 함유한 농축액을 에탄올(80% 최종 농도)로 4°C에서 밤새 침전시킨다.
   9. 에탄올 현탁액을 4°C에서 15분 동안 6,000 x g 에서 원심분리하고, 펠릿(침전물)을 유지하고, 피펫으로 상청액을 버린다.
   10. 침전물을 H_{2O d} (10 % w / v)에 용해시키기 전에 80 % 에탄올로 3 회 세척하십시오. pH를 6.5/7로 조정하고 온도를 37°C로 조정하고 제조업체의 지침에 따라 α-글루칸을 가용화하기 위해 각각 2U 및 4U의 α-아밀라아제 및 글루코아밀라아제로 처리하십시오(재료 표 참조).
   11. α-아밀라아제/글루코아밀라아제로 처리한 후 pH와 온도를 각각 8.0 및 50°C로 조정하고 알칼라제(단백질 2.5U/g)( 재료 표 참조)로 처리하여 단백질을 가용화합니다.
       참고: 이 순차적 효소 처리는 에탄올 침전에서 β글루칸과 함께 침전되는 대부분의 α글루칸과 단백질을 제거합니다.
   12. 가수분해한 후, 가수분해물을 4°C에서 15분 동안 6,000 x g 로 원심분리하고, 상등액을 회전 증발기에서 5회 농축한다. 80 % 에탄올로 다시 침전시킨다.
   13. 생성된 침전물을_H2Od에 가용화하고 셀룰로오스 튜브 멤브레인(12,000Da 컷오프 멤브레인, 재료 표 참조)을 사용하여 증류수에서 24시간 동안 투석하여 저분자량 분자를 제거합니다. 수용성 부분을 회수하고 동결 건조하여 용해성 β글루칸(SβGs)을 생성합니다.
2. 설탕 및 단백질 측정
   1. 페놀-황산 방법으로 각 분획의 총 당 함량을 측정하고, 포도당을 표준으로^{사용한다 8}.
      참고: β-글루칸 함량의 정량화는 효소 가수분해 및 산화환원효소(즉, 엑소-1,3-β-글루카나제, 포도당 산화효소, β-글루코시다아제 및 과산화효소)의 활성을 기반으로 β-글루칸 분석 키트(버섯 및 효모, 재료 표 참조)를 사용하여 수행할 수도 있습니다. 제조업체의 지침을 약간 수정하여 따르십시오.
   2. 12MH_2SO4 대신 18MH_2SO4를 사용합니다.
   3. 총 글루칸과 α-글루칸의 함량을 별도로 평가합니다.
   4. Kjeldahl 프로토콜에 따라 결과 β-글루칸 값을 총 글루칸 및 α-글루칸(삼중) 값의 차이로 측정합니다. 특정 경우에, 단백질 함량은 로리 방법에 의해 결정될 수 있으며, 알부민을 사용하여 검량선^11,12를 플롯팅한다.
3. 자외선 흡수 분광법 분석
   1. 200-400 nm 영역의 샘플을 스캔하여 UV 가시광선 분광 광도계( 재료 표 참조)를 사용하여 SβG 자외선(UV) 스펙트럼을 얻습니다(그림 2).
   2. H_2Od에서 각 SβG의 1.0mg/mL를 준비하고, 용액을 석영 큐벳으로 옮기고, 실온에서 스캔한다.
4. 분자량 분포 분석
   1. 굴절률 검출기와 울트라 하이드로겔 선형 겔 여과 컬럼(300 mm x 7.8 mm; 그림 3).
   2. 0.5mL/^min-1 의 유속으로 용리액으로 탈이온수를 사용하고 표준으로 dextrans(110, 80 및 50kDa)를 사용하여 40°C에서 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 5mL 분획을 수집합니다.
5. 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분석
   1. 적외선 스펙트럼(그림 4)을 4000-500cm-1 범위의 FTIR 분광계에 기록합니다. 샘플은 필름을 형성하기 위해 이전에 KBr과 혼합되어야 합니다(표준 FTIR 절차, 제조업체 지침 및 재료 표 참조).
6. 분자 조성 분석
   1. 표준 절차¹²에 따라 고성능 박막 크로마토그래피(HPTLC)와 질량 분석법과 결합된 가스 크로마토그래피(GC-MS)를 통해 SβG의 분자 조성을 추정한다.

2. β글루칸 유도 미세아교세포 자극에 대한 시험관 내 연구

1. 8-웰 챔버 슬라이드에서 마우스 교모세포종 및 미세아교세포 세포의 세포 배양
   참고: 이 프로토콜은 GL261(교모세포종) 및 BV2(미세아교세포) 세포주에 특이적입니다. 그러나 약간의 수정을 통해 이러한 단계는 잠재적으로 다른 암 및 면역 세포주를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
   1. L-글루타민, 4.5g/L D-포도당으로 변형되고 피루브산이 없는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 완전 배지를 준비합니다. 10%의 소 태아 혈청(FBS)과 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 추가합니다( 재료 표 참조). 재료를 37°C의 수조에서 15분 동안 예열합니다.
   2. 냉동된 BV2 및 GL261 분취액을 수조(37°C)에서 2분 동안 해동하고 완전히 해동하기 직전에 층류 후드로 옮기고 세포를 두 개의 다른 멸균 T25 플라스크(각 세포주당 하나씩)에 플레이트합니다.
   3. 배양물이 합류할 때까지 T25 플라스크를 37°C, 5%_CO2 에서 인큐베이션한다.
      알림: 동결 조건 및 냉동 보존 시간에 따라 합류까지의 시간이 다를 수 있습니다. 이러한 세포주는 일반적으로 T75 플라스크에서 합류도에 도달하는 데 3-5일이 걸립니다.
   4. BV2 세포 배양이 합류한 후 8웰 챔버 슬라이드 0.6 x 10⁶ 세포/웰로 옮깁니다. 8-웰 챔버 슬라이드를 인큐베이터에 24시간 동안 보관합니다.
   5. 미세아교세포 세포가 8웰 챔버 슬라이드에 도말되면 GL261 세포와 동일한 프로토콜을 반복합니다.
2. β-글루칸을 이용한 미세아교세포의 활성화
   1. BV2 세포를 4개의 다른 β글루칸(P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus)으로 72시간 동안 0.2mg/mL 농도로 코팅합니다. 하나의 실험 조건은 대조군으로 작용하여 처리되지 않은 상태로 유지되어야 합니다(정상 배지).
   2. 72시간 후 피펫으로 상층액을 수집하고 나머지 부피를 0.20μm 주사기 필터에 통과시킵니다. 그런 다음 상청액을 -80°C에서 최소 24시간 동안 동결합니다.
3. 사전 활성화된 미세아교세포 조절 배지로 GL261 처리
   1. GL261이 8웰 챔버 슬라이드 내에서 80% 합류하면 2.2.2시간 동안 25%의 최종 부피 농도로 β글루칸 처리된 소교세포 배지(단계 72)를 추가합니다(총 부피: 250μl/웰).
   2. 72시간 배양 후 배지를 제거하고 폐기합니다.
   3. 세포를 인산완충식염수(PBS; pH 7.4, 0.1 M)로 5분 동안 3회 세척하였다.
   4. 4°C에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 200μL를 첨가하여 세포를 고정합니다.
      참고: 면역형광에 사용될 수 있는 다양한 항체에 따라 고정 방법은 일반적인 4% PFA와 다를 수 있습니다. 알코올 기반 고정제는 특정 에피토프를 보존하는 데 더 효율적일 수 있습니다.
4. 면역형광 연구
   1. 샘플을 트리톤 X(PBST; 0.01%)로 PBS로 10분 동안 3회 세척한다.
   2. PBST를 제거하고 PBST(표 1) 중 10% 소혈청알부민(BSA) 차단 완충액을 첨가하여 실온에서 30분 동안 처리하였다.
   3. 블로킹 완충액을 제거하고, 1차 항체 혼합물(1:500 rat Ki-67 monoclonal 항체 및 1:500 rabbit cleaved caspase-3 antibody; 표 참조)을 함유하는 PBS의 웰당 200 μL 를 첨가한다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   4. 4°C에서 24시간 배양한 후 샘플을 실온에서 30분 동안 방치합니다.
   5. 웰을 진탕기 상에서 PBS로 10분 동안 3회 세척한다(저속).
   6. PBS를 제거하고, 2차 항체(1:200 당나귀 항-래트 IgG(H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488 및 1:200 당나귀 항-토끼 IgG(H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 647; 재료 표 참조)의 혼합물을 함유하는 PBS를 웰 당 200 μL로 실온에서 실온에서 45분 동안 교체하였다.
   7. 다목적 셰이커에서 10분 동안 PBS로 샘플을 세척합니다.
   8. PBS를 제거하고 PBS(1:5,000)에 희석된 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 웰당 200μL를 1분 동안 추가합니다.
   9. DAPI( 재료 표 참조)를 제거하고 PBS에서 5분 동안 세포를 세척합니다.
   10. 웰 프레임을 제거하고 각 웰에 50μL의 PBS:글리세롤(1:1)을 추가하고 커버슬립으로 덮습니다.
   11. 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오.
   12. 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 20x에서 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조).

3. 종양 세포 증식 및 세포 사멸의 정량화 및 분석

참고: 종양 세포 증식 및 세포자멸사에 대한 다양한 β글루칸의 잠재적 효과를 측정하기 위해 ImageJ 소프트웨어에서 사내 스크립트를 사용하여 Ki67(증식) 및 cCasp3(세포자멸사)¹³의 양성 픽셀 수를 정량화했습니다.

1. ImageJ를 엽니다. 플러그인 버튼을 클릭합니다. 플러그인 폴더에 기존에 설치된 플러그인인 Coloc2를 클릭하고, 마지막으로 분석할 이미지를 선택한다¹¹.
   참고: 이 플러그인은 Dr. Vasiliki Economopoulos(veconom@uwo.ca)와의 이전 연락 후 사용할 수 있었습니다. 스크립트 대신 ImageJ와 Fiji 소프트웨어에는 유사한 속성을 가진 공동 위치 분석을 위한 서로 다른 도구( 재료 표 참조)가 있습니다.
2. 제어(처리되지 않음, DMEM만 해당) 조건에 따라 임계값을 설정합니다. 확인 버튼을 클릭합니다.
   참고: 배경과 강도 불일치를 피하기 위해 모든 이미지는 동일한 조건에서 촬영해야 합니다. 가급적이면 이미징 세션은 같은 날에 수행되어야 하며 현미경 매개변수는 이미지 전반에 걸쳐 변경되지 않아야 합니다.
3. colocalized 픽셀의 결과 이미지와 임계값 이상의 픽셀 비율 또는 원시 수를 제공하는 요약 창이 팝업되는지 확인합니다. 대조군(처리되지 않은) 조건에 대한 결과를 정규화합니다.
   참고: 모든 데이터는 SEM± 평균으로 제공됩니다. 통계 분석은 그래프 및 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다(재료 표 참조). Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석이 사용되었습니다. 오차는 평균(s.e.m.)의 표준 오차(*p < 0.05, **p < 0.01)로 표시됩니다.

결과

β글루칸의 성공적인 정제
추출 및 정제 과정을 거쳐 P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum 및 H. erinaceus 의 자실체에서 얻은 MP, SMP 및 SβG의 질량은 표 1에 요약되어 있습니다. 진균으로부터 얻어진 MP, SMPs 및 SβGs의 기본 조성(총 탄수화물, β-글루칸 및 단백질)은 표 2에 묘사되어 있다. 이러한 결과는 프로토콜이 어떻게 SMP에서 많은 양의 단백...

토론

이 연구는 4가지 다른 균류에서 SβG의 함량을 성공적으로 분리, 정제 및 특성화하기 위해 잘 확립된 기술의 사용을 설명합니다. 그 결과, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum, H. erinaceus로부터 얻은 SMP를 열수 추출한 후 α-아밀라아제, 글루코시다아제, 프로테아제로 가수분해 처리한 후 α-글루칸과 단백질의 함량이 감소하여 순수한 SβG의 양이 크게 풍부해졌습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chamber slides	Thermo Fisher, USA	171080
Air-drying oven	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	protease
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
Blade mill	Retsch, Germany	SM100
Bovine Serum Albumin	MERK, Germany	A9418
Cellulose tubing membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
Centrifuge	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
Dextrans	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
FT-IR spectromete	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
Graphing and analysis software	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
Incubator	Eppedorf	Galaxy 170S
Mass Spectometer	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
Paraformaldehyde	MERK, Germany	P6148
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH meter	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
Phosphate-buffered saline	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Abcam, UK	ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal	Thermofisher, USA	MA5-14520
Rotary evaporator	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
UV-Visible spectrophotometer	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
Water bath	J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.	Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-glucans	Setas y Hongos del Sur, S.L.		Supplied the four variants of mushrooms