Glioblastoma için İmmünoterapi Stratejisi Olarak Fungal β-Glukan'ın İzolasyonu ve Saflaştırılması

Özet

Bu protokol, dört farklı mantar β-glukanının saflaştırma adımlarını ve sonraki çalışmalarını, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia'nın anti-tümöral özelliklerini geliştiren potansiyel immünomodülatör moleküller olarak tanımlamaktadır.

Özet

Glioblastoma karşı etkili tedaviler geliştirmedeki en büyük zorluklardan biri, tümör mikro ortamındaki güçlü bağışıklık baskılanmasının üstesinden gelmektir. İmmünoterapi, bağışıklık sistemi tepkisini tümör hücrelerine karşı çevirmek için etkili bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Glioma ile ilişkili makrofajlar ve mikroglia (GAM'lar) bu tür anti-enflamatuar senaryoların ana itici güçleridir. Bu nedenle, GAM'larda anti-kanseröz yanıtın arttırılması, glioblastoma hastalarını tedavi etmek için potansiyel bir ko-adjuvan tedaviyi temsil edebilir. Bu damarda, mantar β-glukan molekülleri uzun zamandır güçlü bağışıklık modülatörleri olarak bilinmektedir. Doğuştan gelen bağışıklık aktivitesini uyarma ve tedavi yanıtını iyileştirme yetenekleri tanımlanmıştır. Bu modüle edici özellikler kısmen, ilginç bir şekilde, GAM'larda büyük ölçüde ifade edilen örüntü tanıma reseptörlerine bağlanma yeteneklerine atfedilir. Bu nedenle, bu çalışma, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia'nın tümör öldürücü tepkisini arttırmak için mantar β-glukanların izolasyonu, saflaştırılması ve daha sonra kullanılmasına odaklanmıştır. Fare glioblastomu (GL261) ve mikroglia (BV-2) hücre hatları, mevcut biyofarmasötik endüstrisinde yoğun olarak kullanılan mantarlardan ekstrakte edilen dört farklı mantar β-glukanının immünomodülatör özelliklerini test etmek için kullanılır: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ve Ganoderma lucidum. Bu bileşikleri test etmek için, önceden aktive edilmiş mikroglia şartlandırılmış bir ortamın glioblastoma hücrelerinde proliferasyon ve apoptoz aktivasyonu üzerindeki etkisini ölçmek için ko-stimülasyon testleri yapıldı.

Giriş

Nöro-onkoloji alanında yeni başarıların ortaya çıkmasına rağmen, glioblastoma hastalarının yaşam beklentisi yetersiz kalmaktadır. Beyin tümörlerine karşı altın standart tedaviler cerrahi, radyoterapi ve kemoterapinin birleştirilmesine dayanır. Bununla birlikte, son on yılda, immünoterapi, farklı kanser türlerini tedavi etmek için güçlü bir strateji olarak ortaya çıkmıştır¹. Bu nedenle, vücudun tümör hücrelerine karşı bağışıklık tepkisini kullanma olasılığı son zamanlarda onkolojinin dördüncü ayağı haline gelmiştir.

Alandaki en büyük zorluklardan birinin, tümör mikroçevre^2'de bulunan güçlü immünsüpresyonun üstesinden gelmek olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Özellikle, beyin kanserinin en yaygın ve agresif formlarından biri olan glioblastoma durumunda, bu tür pro-tümöral senaryoları düzenleyen kilit yolları çözmek ve bağışıklık sisteminin iç karartıcı tepkisine karşı koyabilecek yeni bileşikler bulmak, bu tedavi edilemez hastalığa karşı gelecekteki tedavilerin yolunu açabilir.

Beyin kendi bağışıklık sistemi hücrelerine sahiptir ve en alakalı hücre tipi mikrogliadır. Bu hücrelerin farklı merkezi hastalıklarda oldukça karmaşık bir davranışa sahip oldukları kanıtlanmıştır³. Primer beyin tümörleri (örneğin, glioblastoma) durumunda, bu hücreler beyin parankimini kolonize etmek için tümör hücrelerini destekleyen bir anti-enflamatuar fenotipe doğru kaydırılır³. Çok sayıda yayın, tümör progresyonu sırasında bu hücrelerin ana rolünü arttırmıştır. Bunun başlıca nedenlerinden biri, glioma ile ilişkili mikroglia ve infiltrasyon makrofajlarının (GAM'lar) toplam tümör kütlesinin üçte birini oluşturmasıdır, bu nedenle beyin tümörü ilerlemesi sırasında aktivasyon durumlarının kesin etkisini düşündürmektedir ^4,5.

Bu bağlamda, mantar β-glukanlar, fagositoz ve pro-inflamatuar faktörlerin üretimi de dahil olmak üzere etkili immün yanıtları tetikleyen ve zararlı ajanların eliminasyonuna yol açan güçlü moleküller olarak tanımlanmıştır 6,7,8,9,10. Mantar β-glukanlar genellikle farklı mantar parçalarından elde edilen ekstraktlar kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, spesifik etkilerin atfedilmesi, belirsizliklerden kaçınmak ve immünomodülatör ajanlar gibi moleküllerin etki mekanizmasını anlayabilmek için saflaştırılmasını gerektirir⁸.

Bu çalışmada, çözünür β-glukanlar, düzenli olarak yenilebilir (Pleurotus ostreatus ve Pleurotus djamor) ve tıbbi (Ganoderma lucidum ve Hericium erinaceus) mantarlar olarak kullanılan dört farklı mantarın meyve veren gövdesinden saflaştırılır. Özellikle, bu dört mantar gıda ve ilaç endüstrisinde büyük kullanıma sahiptir ve ticari bir işletmede çevre dostu bir döngüsel ekonomi içinde üretilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

Beyin kanseri tedavilerinde mantar β-glukanların gelecekteki kullanımının temelini atmak için, iyi tanımlanmış saflaştırma stratejileri ve bağışıklık sistemi hücreleri ile varsayılan etkileşimlerini araştıran klinik öncesi çalışmalar, anti-tümör aracıları olarak potansiyel rollerini değerlendirmek için gereklidir. Bu çalışma, seçilen mantarın meyve veren gövdelerinde bulunan çözünür β-glukanları elde etmek için gereken sayısız izolasyon ve saflaştırma adımını açıklamaktadır. Başarılı bir şekilde saflaştırıldıktan sonra, mikroglia hücreleri enflamatuar fenotiplerini arttırmak için aktive edilir. Fare glioblastoma hücreleri (GL261), daha önce bu ekstraktlarla muamele edilen farklı bir mikroglia şartlandırılmış ortam ile kaplanır ve daha sonra tümör hücrelerinin davranışları üzerindeki etkisi değerlendirilir. İlginç bir şekilde, laboratuvarımızdan yapılan pilot çalışmalar (veriler gösterilmemiştir), pro-inflamatuar mikroglia'nın sadece glioblastoma hücrelerinde değil, diğer kanser hücre hatlarında da tümör hücresi göçünü ve istila özelliklerini nasıl yavaşlatabileceğini ortaya çıkarmıştır. Bu multidisipliner çalışma, onkoloji araştırmacılarının birçok farklı tümör türünde bağışıklık tepkisini artırabilen umut verici bileşikleri test etmeleri için yararlı bir araç sağlayabilir.

Protokol

Bu protokolde açıklanan dört farklı mantar çeşidi ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Mantar β-glukanların izolasyonu

1. Çözünür mantar polisakkaritlerinin ekstraksiyonu ve izolasyonu
   NOT: Çözünür mantar polisakkaritleri (SMP'ler) Şekil 1'de şematik olarak gösterilen prosedüre göre elde edilmiştir.
   1. Taze P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus ve G. lucidum meyve veren cisimleri (yaklaşık 2.000 g / mantar) damıtılmış suda beş kez nazikçe durulayın.
   2. Meyve gövdelerini geleneksel bir hava kurutmalı fırında sabit bir ağırlığa ulaşana kadar (~ 24 saat) 50 ± 2 ° C'de kurutun.
   3. Kurutulmuş mantarları bir bıçak değirmeninde öğütün ve her mantardan yaklaşık 200 g toz elde edin.
   4. 100 g mantar tozunu (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus ve G. lucidum) 1.000 mL_H2O'daaskıya alın. Ardından, 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlayın ve son olarak oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
   5. Elde edilen süspansiyonu 6.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
   6. Çözünmeyen mantar polisakkaritleri (IMP) içeren çökeltiyi 50 ± 2 °C'de hava kurutmalı fırında 24 saat kurutun.
   7. Çökeltiyi atın ve süpernatantı koruyun. Süpernatantı döner bir evaporatörde 10 kez konsantre edin.
   8. SMP içeren konsantreyi gece boyunca 4 ° C'de etanol (% 80 nihai konsantrasyon) ile çökeltin.
   9. Etanol süspansiyonunu 6.000 x g'de 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin, peleti koruyun (çökeltin) ve süpernatantı bir pipetle atın.
   10. Çökeltiyi_H2Od(% 10 w / v) içinde çözmeden önce% 80 etanol ile üç kez yıkayın. PH'ı 6.5/7'ye ve sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın ve üreticinin talimatlarını izleyerek α-glukanları çözündürmek için sırasıyla 2 U ve 4 U α-amilaz ve glukoamilaz ile muamele edin (bkz.
   11. α-amilaz / glukoamilaz ile işlemden sonra, pH ve sıcaklığı sırasıyla 8.0 ve 50 ° C'ye ayarlayın ve proteinleri çözündürmek için alkalaz (2.5 U / g protein) ile muamele edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
       NOT: Bu sıralı enzimatik işlem, etanol çökeltisinde β-glukanlarla birlikte çökelen çoğu α-glukan ve proteini uzaklaştırır.
   12. Hidrolizden sonra, hidrolizatı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj edin ve temiz süpernatant döner bir evaporatörde beş kez konsantre olur. % 80 etanol ile tekrar çökeltin.
   13. Elde edilen çökeltiyi_H2O'daçözünür ve düşük moleküler ağırlıklı molekülleri uzaklaştırmak için selüloz boru membranları (12.000 Da kesme membranları; bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak 24 saat boyunca damıtılmış suda diyaliz yapın. Suda çözünür kısmı geri kazanın ve çözünür β-glukanlar (SβG'ler) üretmek için dondurarak kurutun.
2. Şeker ve protein ölçümü
   1. Her fraksiyonun toplam şeker içeriğini, standart⁸ olarak glikoz kullanarak fenol-sülfürik asit yöntemiyle ölçün.
      NOT: β-glukan içeriğinin kantitasyonu, enzimatik hidrolize ve oksidoredüktazların aktivitesine dayanan β-glukan tahlil kiti (mantar ve maya; bakınız Malzeme Tablosu) kullanılarak da yapılabilir: yani ekzo-1,3-β-glukanaz, glikoz oksidaz, β-glukozidaz ve peroksidaz, daha sonra kinoneimin oluşumu ile. Küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarını izleyin.
   2. 12 MH₂SO 4 yerine 18 MH₂SO₄ kullanın.
   3. Toplam glukanların ve α-glukanların içeriğini ayrı ayrı değerlendirin.
   4. Elde edilen β-glukan değerlerini, Kjeldahl protokolünü takiben toplam glukan ve α-glukan (üçlü) değerleri arasındaki fark olarak ölçün. Bazı durumlarda, protein içeriği, kalibrasyon eğrisi^11,12'yi çizmek için albümin kullanılarak Lowry yöntemiyle belirlenebilir.
3. Ultraviyole absorpsiyon spektroskopisi analizi
   1. 200-400 nm bölgesindeki numuneleri tarayarak UV görünür bir spektrofotometre kullanarak SβG ultraviyole (UV) spektrumlarını elde edin (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 2).
   2. Her bir SβG'den 1.0 mg/mL'sini_H2OD'dehazırlayın, çözeltiyi bir kuvars küvete aktarın ve oda sıcaklığında tarayın.
4. Moleküler ağırlık dağılımı analizi
   1. Bir kırılma indisi dedektörü ve ultra hidrojel lineer jel filtrasyon sütunu (300 mm x 7,8 mm; Şekil 3).
   2. Tahlilini 40 °C'de, 0,5 mL/^dak-1 akış hızında elüent olarak deiyonize su ve standart olarak dextrans (110, 80 ve 50 kDa) kullanarak gerçekleştirin (bkz. 5 mL'lik bir fraksiyon toplayın.
5. Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) analizi
   1. Kızılötesi spektrumları (Şekil 4) 4000-500 ^cm-1 aralığında bir FTIR spektrometresine kaydedin. Numuneler daha önce film oluşturmak için KBr ile karıştırılmalıdır (standart FTIR prosedürü; üreticinin talimatlarına ve Malzeme Tablosuna bakınız).
6. Moleküler kompozisyon analizi
   1. SβG'lerin moleküler bileşimlerini, standart prosedürleri izleyerek yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) ve kütle spektrometresine (GC-MS) bağlı gaz kromatografisi ile tahmin edin¹².

2. β-glukan kaynaklı mikroglia stimülasyonunun in vitro çalışması

1. 8 kuyucuklu odacıklı slaytlarda fare glioblastoma ve mikroglia hücrelerinin hücre kültürü
   NOT: Bu protokol GL261 (glioblastoma) ve BV2 (mikroglia) hücre hatları için spesifiktir. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle, bu adımlar potansiyel olarak diğer kanser ve bağışıklık hücresi hatlarını incelemek için kullanılabilir.
   1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM) komple ortamını L-glutamin, 4.5 g / L D-glikoz ile modifiye edilmiş ve piruvat olmadan hazırlayın. Fetal sığır serumunun (FBS) %10'unu ve %1'ini penisilin/streptomisin ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Malzemeyi 37 ° C'de bir su banyosunda 15 dakika boyunca önceden ısıtın.
   2. Dondurulmuş BV2 ve GL261 aliquotlarını 2 dakika boyunca bir su banyosuna (37 ° C) çözün ve tamamen çözülmeden hemen önce, onları laminer bir akış başlığına taşıyın ve hücreleri iki farklı steril T25 şişesine (her hücre hattı için bir tane) plakalayın.
   3. T25 şişelerini 37 ° C'de,% 5 CO_2'de kültür birleşene kadar inkübe edin.
      NOT: Donma koşullarına ve kriyoprezervasyon altındaki süreye bağlı olarak, birleşme süresi değişebilir. Bu hücre hatları genellikle bir T75 şişesinde akıcılığa ulaşmak için 3 ila 5 gün gerektirir.
   4. BV2 hücre kültürü birleştikten sonra, 0.6 x 10⁶ hücre / kuyucuklu 8 delikli oda slaytlarına aktarın. 8 delikli oda slaytlarını inkübatörde 24 saat boyunca saklayın.
   5. Mikroglia hücreleri 8 delikli oda slaytlarına kaplandıktan sonra, GL261 hücreleri ile aynı protokolü tekrarlayın.
2. Mikroglia'nın β-glukanlarla aktivasyonu
   1. BV2 hücrelerini dört farklı β-glukan (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus) ile 72 saat boyunca 0.2 mg / mL konsantrasyonda kaplayın. Bir deneysel koşul, kontrol grubu olarak hareket ederek tedavi edilmeden (normal ortam) kalmalıdır.
   2. Süpernatantı 72 saat sonra bir pipetle toplayın ve kalan hacmi 0,20 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin. Ardından, süpernatantı -80 ° C'de en az 24 saat dondurun.
3. GL261'in önceden aktive edilmiş mikroglia şartlandırılmış ortam ile tedavisi
   1. GL261, 8 delikli hazneli kızaklar içinde% 80 oranında birleştiğinde, 72 saat boyunca% 25'lik bir son hacim konsantrasyonunda (toplam hacim: 250 μl / kuyu) β-glukanla muamele edilmiş mikroglial ortam (adım 2.2.2) ekleyin.
   2. 72 saatlik inkübasyondan sonra ortamı çıkarın ve atın.
   3. Hücreleri fosfat tampon salin (PBS; pH 7.4, 0.1 M) ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   4. 15 dakika boyunca 4 ° C'de 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri sabitleyin.
      NOT: İmmünofloresan için kullanılabilecek farklı antikorlara bağlı olarak, fiksasyon yöntemleri tipik% 4 PFA'dan farklı olabilir. Alkol bazlı fiksatifler, bazı epitopların korunmasında daha etkili olabilir.
4. İmmünofloresan çalışması
   1. Numuneleri PBS ile triton X (PBST; %0,01) ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   2. PBST'yi çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBST'de (Tablo 1) sığır serum albümini (BSA) bloke edici tamponu% 10 ekleyin.
   3. Bloke edici tamponu çıkarın ve birincil antikor karışımını içeren PBS kuyucuğu başına 200 μL ekleyin (1:500 sıçan Ki-67 monoklonal antikoru ve 1:500 tavşan parçalanmış kaspaz-3 antikoru; bakınız Malzeme Tablosu). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   4. 4 ° C'de 24 saat inkübasyondan sonra, numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
   5. Kuyucukları bir çalkalayıcıda PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın (düşük hız).
   6. PBS'yi çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika boyunca ikincil antikorların (1:200 eşek anti-sıçan IgG (H + L) yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 488 ve 1:200 eşek anti-tavşan IgG (H + L) yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 647; bkz.
   7. Numuneleri PBS ile çok amaçlı bir çalkalayıcıda 10 dakika yıkayın.
   8. PBS'yi çıkarın ve 1 dakika boyunca PBS'de (1:5.000) seyreltilmiş 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kuyucuğu başına 200 μL ekleyin.
   9. DAPI'yi çıkarın (bkz. malzemeler tablosu) ve hücreleri PBS'de 5 dakika yıkayın.
   10. Kuyu çerçevesini çıkarın ve her bir oyuğa 50 μL PBS:gliserol (1:1) ekleyin ve bir kapak kayması ile örtün.
   11. Slaytları oje ile kapatın.
   12. Konfokal mikroskop sistemi kullanarak 20x'te görüntüler elde edin (bkz.

3. Tümör hücresi proliferasyonu ve apoptozun nicelleştirilmesi ve analizi

NOT: Farklı β-glukanların tümör hücresi proliferasyonu ve apoptoz üzerindeki potansiyel etkisini ölçmek için, ImageJ yazılımında Ki67 (proliferasyon) ve cCasp3 (apoptoz)^13'ün pozitif piksellerinin sayısını ölçmek için şirket içi bir komut dosyası kullanılmıştır.

1. ImageJ'yi açın. Eklentiler düğmesine tıklayın. Daha önce eklenti klasörüne yüklenmiş bir eklenti olan Coloc2'ye tıklayın ve son olarak analiz etmek için resmi seçin¹¹.
   NOT: Bu eklenti, Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca) ile önceki temasın ardından mevcuttu. Komut dosyası yerine, hem ImageJ hem de Fiji yazılımı, benzer özelliklere sahip kolokalizasyon analizi için farklı araçlara sahiptir (bkz.
2. Eşikleri kontrol (işlenmemiş, yalnızca DMEM) koşullarına göre ayarlayın. Tamam düğmesine tıklayın.
   NOT: Arka plan ve yoğunluk tutarsızlıklarını önlemek için, tüm görüntüler aynı koşullar altında çekilmelidir. Tercihen, görüntüleme seansları aynı gün yapılmalı ve mikroskop parametreleri görüntüler arasında değişmeden yapılmalıdır.
3. Birlikte yerelleştirilmiş piksellerin elde edilen görüntülerinin ve eşiğin üzerindeki piksellerin yüzdesini veya ham sayısını sağlayan bir özet penceresinin açıldığından emin olun. Kontrol (tedavi edilmemiş) koşullarına göre sonuçları normalleştirin.
   NOT: Tüm veriler SEM'± ortalama olarak verilmiştir. İstatistiksel analiz grafik ve analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA kullanıldı. Hatalar, ortalamanın (s.e.m.) standart hatası olarak temsil edilir (*p < 0.05, **p < 0.01).

Sonuçlar

β-glukanların başarılı bir şekilde saflaştırılması
Ekstraksiyon ve saflaştırma işlemini takiben P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus'un meyve veren cisimciklerinden elde edilen MP, SMP ve SβG'lerin kütlesi Tablo 1'de özetlenmiştir. Mantarlardan elde edilen MP, SMP ve SβG'lerin temel bileşimi (toplam karbonhidratlar, β-glukanlar ve protein) Tablo 2'de gösterilmiştir. Bu sonuçlar, protokolün SMP'...

Tartışmalar

Bu çalışma, SβG'lerin içeriğini dört farklı mantardan başarılı bir şekilde izole etmek, saflaştırmak ve karakterize etmek için köklü tekniklerin kullanımını açıklamaktadır. Sonuçlar, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus'tan elde edilen SMP'lerin sıcak su ekstraksiyonundan ve ardından α-amilaz, glukozidaz ve proteaz ile hidrolitik işlemden sonra, α-glukan ve protein içeriğinin nasıl azaldığını ve böylece saf SβG'lerin miktarını önemli ölç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chamber slides	Thermo Fisher, USA	171080
Air-drying oven	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	protease
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
Blade mill	Retsch, Germany	SM100
Bovine Serum Albumin	MERK, Germany	A9418
Cellulose tubing membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
Centrifuge	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
Dextrans	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
FT-IR spectromete	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
Graphing and analysis software	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
Incubator	Eppedorf	Galaxy 170S
Mass Spectometer	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
Paraformaldehyde	MERK, Germany	P6148
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH meter	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
Phosphate-buffered saline	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Abcam, UK	ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal	Thermofisher, USA	MA5-14520
Rotary evaporator	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
UV-Visible spectrophotometer	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
Water bath	J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.	Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-glucans	Setas y Hongos del Sur, S.L.		Supplied the four variants of mushrooms