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摘要

大脑分泌组在中枢神经系统的发育和正常功能中起着关键作用。在本文中，我们提供了从 离体 脑切片培养物中分离脑分泌组的详细方案。

摘要

脑分泌组由蛋白质组成，这些蛋白质要么是主动分泌的，要么是通过神经系统细胞外基质中的蛋白水解裂解从细胞表面脱落的。这些蛋白质包括生长因子受体和跨膜蛋白等，涵盖了在中枢神经系统的发育和正常功能中的广泛作用。目前从脑脊液中提取分泌蛋白组的程序复杂且耗时，并且很难从实验动物大脑中分离这些蛋白质。在这项研究中，我们提出了一种从小鼠脑切片培养物中分离脑分泌组的新方案。首先，将大脑分离、切片和 体外培养。然后过滤和浓缩培养基，几天后通过离心分离蛋白质。最后，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 分离分离的蛋白质，随后通过 western blot 探测纯度表征。这种从 离体 脑切片培养物中分离脑分泌组的程序可用于研究分泌组对各种神经发育疾病（如自闭症谱系障碍）的影响。

引言

神经系统的细胞外基质由主动分泌或从细胞表面脱落的蛋白质组成，称为“分泌组”。脑分泌组包含生长因子受体和跨膜蛋白1 等蛋白质，它们在中枢神经系统的发育和正常功能中具有广泛的作用。神经胶质细胞分泌的大量蛋白质，尤其是小胶质细胞和星形胶质细胞，反映了多种神经胶质细胞状况，包括中枢神经系统的神经炎症2。蛋白质分泌组已被证明具有神经保护和神经毒性作用。例如，编码 neuroligin 的基因，一种存在于突触后，调节突触连接3 结构和功能的跨膜蛋白，已被发现是自闭症谱系障碍的危险因素。Neuroligin 经历一个称为胞外域脱落的过程，其中跨膜蛋白的胞外域通过分泌组的形式从膜上裂解而从细胞表面释放出来 4,5。

脑内分泌组中的许多蛋白质可以在脑脊液中检测到;因此，这种液体的蛋白质组学分析可以帮助确定神经系统疾病的新生理和病理机制以及生物标志物 6,7。脑分泌组蛋白的许多生理功能仍然未知，需要进一步探索。建立提取大脑分泌蛋白组的有效程序对于这些研究至关重要。然而，目前从脑脊液中提取分泌蛋白组的过程复杂且耗时，并且很难从实验动物大脑中分离这些蛋白质8。在本文中，我们提出了一种从小鼠脑切片中分离分泌组的新方案。

体外培养的脑切片包含与脑组织相同的细胞类型和三维细胞结构，保留了正常和完整的突触回路、受体分布、递质传递和其他生理功能。该模型模拟了将脑切片置于适当的培养基中以确保细胞持续生长和存活时小鼠神经细胞的生长和功能。在本研究中，小鼠脑切片继续分泌神经分泌蛋白9，在无菌条件下解剖分离的脑并置于过滤器插入物上。将过滤器插件置于含有培养基的 6 孔板中。鉴于神经元和神经胶质细胞分泌的蛋白质可以穿透插入片段的膜但不能穿透细胞，因此可以从条件培养基中收集脑分泌组。

本文描述了 （i） 脑切片的分离，（ii） 脑切片的收集，（iii） 从条件培养基中收集脑切片培养物的基本程序，（iv） 蛋白质印迹分析和 （v） 蛋白质组学分析（图 1）。

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研究方案

该方案已获得批准，并遵循南方科技大学动物护理和使用委员会 （SUSTech-JY202112006） 制定的动物护理指南。本研究使用成年雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠 （6-8 周龄，22-30 g）。将小鼠饲养在 22-25 °C 下，昼夜节律周期为 12 小时光照和 12 小时黑暗，可 随意 获取食物和水。协议的步骤如下。

1. 分离脑切片

  1. 准备手术工具：眼科弯曲镊子、烧杯（250 mL、500 mL）、滤纸、剪刀、剃须刀片、单面刀片和毛笔。将这些工具放入装满碎冰的泡沫盒中冷却。
  2. 打开含有 95% O2 和 5% CO2 的混合气体的阀门。将燃气管头放入装有超纯水的烧杯中清洁燃气管头。
  3. 使用以下组分制备冰冷的解剖缓冲液：225 mM 蔗糖、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、11 mM D-葡萄糖、5 mM L-抗坏血酸、3 mM 丙酮酸钠、7 mM MgSO 4 和 0.5 mM CaCl2。将 pH 值调节至 7.3-7.4。
  4. 使用以下组分制备培养溶液：122 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、11 mM D-葡萄糖、7 mM MgSO4 和 0.5 mM CaCl2。将 pH 值调节至 7.3-7.4，然后过滤并将 10% 青霉素 - 链霉素溶液 （P/S） 加入培养液中。
  5. 在处死小鼠之前，将培养液和解剖液充氧 30 分钟。折断剃须刀片以取取一半的切片，然后将其安装在切片机上。安装切片机的底座和刀架。
  6. 通过颈椎脱位或使用 2%-3% 异氟烷麻醉来处死小鼠。
    1. 用剪刀剪掉脖子上的头骨。切开颅骨中间的皮肤，露出整个颅骨。
    2. 用眼科剪刀沿正中线切开颅骨，用弯曲的眼钳将颅骨切开。
    3. 最后，用弯曲的镊子到达颅底，切断基底神经;现在可以切除整个大脑。
  7. 将大脑快速放入冰冷的解剖缓冲液中。使用锋利、消毒的单面刀片切掉大脑的多余部分，包括底部。
  8. 使用适当的胶水将脑组织插入水箱中。将切片溶液倒入水箱中，确保脑组织被覆盖，并继续充氧。
  9. 调整振动切片机的参数，将组织切成 300 μm 厚的切片。本研究中使用的切片机的速度和频率分别为 0.3 mm/s 和 70 Hz。
  10. 用刷子挑出脑切片，并将它们放入装有培养液的培养皿中。然后，将 2 到 4 个切片转移到含有 1.5 mL 培养溶液的 6 孔板中每个 30 mm、0.4 μm 孔径的组织培养小室上，并保持不允许切片相互生长的距离。
  11. 将组织在 37°C、5% CO2 和 95% 湿度下孵育 14 小时。

2. 脑切片收集

  1. 从盖玻片中吸出培养基，然后用刷子轻轻地将脑切片转移到 1.5 mL 试管中。
  2. 向试管中加入 200-400 μL 含有 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 的 Hanks 平衡盐溶液 （HBSS）。使用组织研磨机进行剧烈振荡和混合，以形成均匀的溶液。本研究中使用的频率和时间分别为 800 Hz 和 60 s。
  3. 将悬浮液在 4 °C 下以 700 x g 离心 10 分钟。 然后，将上清液收集到新的 1.5 mL 离心管中。
  4. 向上清液中加入 20-40 μL 20% Triton X-100，并用摇床在 4°C 下旋转样品 1 小时。
  5. 将悬浮液在 4 °C 下以 13,000 x g 离心 20 分钟并收集上清液。使用二辛可宁酸 （BCA） 蛋白质测定试剂盒将所有脑切片样品标准化至 2 μg/μL 的蛋白质浓度。
  6. 将上清液与5x十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液（10%SDS，10mM二硫苏糖醇[DTT]，250mM Tris-HCl [pH 6.8]，30%[v / v]甘油和0.05%[w / v]溴酚蓝染料）混合，并在95°C下煮沸样品5分钟。
  7. 将制备的样品在 -20 °C 下冷冻。 随后将通过电泳和 western blotting 方法对其进行检测。

3. 脑切片培养条件培养基 （CM） 的收集

  1. 14 小时后吸出培养基，并使用 0.22 μm 过滤器过滤 CM。
  2. 用 10 kDa 超滤离心管在 4 °C 下以 9,000 x g 的离心力浓缩 50 分钟，将条件培养基浓缩至 100 μL。 使用 BCA 蛋白检测试剂盒将所有培养基样品标准化至 0.8 μg/μL 的蛋白质浓度。
  3. 在 5x SDS 上样缓冲液中洗脱条件培养基，并在 95 °C 下煮沸 5 分钟。
  4. 将制备的样品在 -20 °C 下冷冻。 随后将通过电泳和 western blotting 方法对其进行检测。

4. 蛋白质印迹分析

  1. 如前所述10.将脑切片和培养基样品上样到预制 SDS-PAGE 凝胶上。最初在 80 V 的恒定电压下分离样品 30 分钟，然后在 120 V 的恒定电压下分离 70 分钟。
  2. 将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上，并在 tris 缓冲盐水-Tween 20（TBST;150 mM NaCl、20 mM Tris、0.1% Tween-20，pH 7.4）中用 5% 牛血清白蛋白 （BSA） 封闭 1 小时。
  3. 在 TBST 中加入一抗如下：小鼠抗 sAPP-α（抗体稀释比为 1：5,000）、兔抗聚集素（抗体稀释比为 1：5,000）、小鼠抗 MAP2（抗体稀释比为 1：5,000）、小鼠抗 GAPDH（抗体稀释比为 1：5,000）和小鼠抗肌动蛋白（抗体稀释比为 1：5,000），并在 4°C 下在摇床上孵育过夜。
  4. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。
  5. 在 TBST 缓冲液中加入适当的二抗，如下所示：m-IgGκ BP-HRP（1：5,000 稀释）、小鼠抗兔 IgG-HRP（二抗稀释比为 1：5,000）。孵育 1-2 小时。
  6. 使用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。
  7. 使用适当的成像系统扫描膜并成像。

5. 蛋白质组学分析

  1. 在本研究中，根据步骤 3.1 收集培养基 （CM），然后使用 3 kDa 浓度管以 9,000 x g 在 4 °C 下浓缩至 40 分钟，使其浓缩至最终体积为 80 μL。 将 CM 样品储存在冰上，等待质谱分析。
  2. 按照先前论文11、12、13 中描述的方案对样品进行蛋白质组学检测和分析方法。

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结果

为了量化脑切片中细胞外蛋白的分泌，我们通过 BCA 测定实验检查了脑切片样品和条件培养基样品的蛋白质浓度。脑切片样品和条件培养基样品均具有高蛋白质浓度（表 1 和图 2）。我们发现大量细胞外蛋白分泌到培养基中，计算出条件培养基中的平均蛋白浓度为 1.78 μg/μL。孵育 14 h 后，脑切片仍存活，脑切片的平均蛋白浓...

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讨论

脑分泌组是指神经元或神经胶质细胞释放到细胞外环境中的信号分子的集合，称为神经分泌或神经肽产物。大脑分泌组在神经系统的许多生物和生理过程中具有关键功能17,18。了解大脑分泌组及其功能对于深入了解大脑功能和疾病的潜在机制非常重要。此外，脑分泌蛋白显示出作为推进药物开发的新型治疗靶点或作为帮助疾病?...

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披露声明

作者声明他们没有任何利益冲突。

致谢

本研究得到了深圳市精神障碍临床医学研究中心（20210617155253001）、深圳市广东省高水平临床重点专科基金（SZGSPO13）、深圳市科技创新委员会（JCYJ20200109150700942、广东省重点领域研发计划（2019B030335001）和深圳市医学重点学科建设基金（SZXK042）的支持。感谢广东省重点实验室的协助先进生物材料。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm Non-Sterile Millex Syringe Filters with PES MembraneMilliporeSLGPR33RB
1,4-Dithio-DL-threitol (DTT)Merck (Sigma Aldrich)DTT-RO
6-well platesCORNING3516
Actin antibodyCell Signaling Technology #3700
APP AntibodyCell Signaling Technology2452
BioRad Mini-Protean TGX precast gelsBioRad#1610185
Bovine serum albumin (BSA)Merck (Sigma Aldrich)10735094001
Bromophenol BlueMerck (Sigma Aldrich)B0126
Brush penDeli1.00008E+11
CaCl2Merck (Sigma Aldrich)C1016
CF3COOHMerck (Sigma Aldrich)302031
CH3CNMerck (Sigma Aldrich)34851
Clusterin antibodyCell Signaling Technology#42143
D-GlucoseMerck (Sigma Aldrich)G8270
Easy-nLC1200Thermo Fisher ScientificEasy-nLC1200
Filter paperROHUROHU-DLLZ00105
GAPDH antibodyCell Signaling Technology# 5174S
GlycerolMerck (Sigma Aldrich)G5516-100ML
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen (Gibco)14175095
Human/Rat NLGN2 AntibodyR&D SystemsAF5645
ICH2CONH2Merck (Sigma Aldrich)I6125
Immun-Blot PVDF membranesBIO-RAD#1620177
KClMerck (Sigma Aldrich)P3911
L-Ascorbic AcidMerck (Sigma Aldrich)A92902
Map2 antibodyCell Signaling Technology# 4542S
MgSO4Merck (Sigma Aldrich)M7506
m-IgGκ BP-HRPSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-516102
Millicell-CM 0.4 μmMilliporePIHP03050
Millipore AmiconUltra-0.5MLMilliporeUFC5010
mouse anti-rabbit IgG-HRPSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-2357
NaH2PO4Merck (Sigma Aldrich)S0751
NaHCO3Merck (Sigma Aldrich)S5761
NH4HCO3Merck (Sigma Aldrich)A6141
ParenzymeThermo Fisher ScientificR001100
Penicillin-Streptomycin Solution(P/S)Invitrogen (Gibco)15070063
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QEactiveThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Rabbit Anti-Goat IgG (H&L)-HRP ConjugatedEasybioBE0103-100
Razor bladeBFYING EAGLEHX-L146-1H
Sodium chloride NaClMerck (Sigma Aldrich)S6150
Sodium dodecylsulfate (SDS)Merck (Sigma Aldrich)V900859
Sodium PyruvateMerck (Sigma Aldrich)P2256
SpeedVac SRF110 Refrigerated Vacuum Concentrator (German)Thermo Fisher ScientificSRF110P2-115
SucroseMerck (Sigma Aldrich)G8270
Tissue grinderSCIENTZSCIENTZ-48
Tris (Hydroxymethyl)Merck (Sigma Aldrich)TRIS-RO
TritonX-100Merck (Sigma Aldrich)T8787
Tween-20Merck (Sigma Aldrich)P1379
Vibratory slicerLeicaLeica VT 1000S

参考文献

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  8. Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
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