Выделение секретома мозга из культур среза мозга ex vivo

Секретом мозга играет ключевую роль в развитии и нормальном функционировании центральной нервной системы. В этой статье мы приводим подробный протокол выделения секретома мозга из культур среза мозга ex vivo .

Аннотация

Секретом мозга состоит из белков, которые либо активно секретируются, либо выделяются с поверхности клетки путем протеолитического расщепления во внеклеточном матриксе нервной системы. Эти белки включают рецепторы фактора роста и трансмембранные белки, среди прочих, охватывающие широкий спектр ролей в развитии и нормальном функционировании центральной нервной системы. Текущая процедура извлечения секретома из спинномозговой жидкости сложна и трудоемка, и выделить эти белки из экспериментального мозга животных сложно. В этом исследовании мы представляем новый протокол выделения секретома мозга из культур среза мозга мыши. Во-первых, мозг был изолирован, разрезан и культивирован ex vivo. Затем питательную среду фильтровали и концентрировали для выделения белков методом центрифугирования через несколько дней. Наконец, выделенные белки были растворены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и впоследствии исследованы для определения чистоты методом вестерн-блоттинга. Эта процедура выделения секретома мозга из культур среза мозга ex vivo может быть использована для исследования влияния секретома на различные неврологические заболевания, такие как расстройства аутистического спектра.

Введение

Внеклеточный матрикс нервной системы состоит из белков, которые либо активно секретируются, либо выделяются с поверхности клетки, называемые «секретомом». Секретом мозга содержит белки^{, такие} как рецепторы фактора роста и трансмембранные белки1, которые выполняют широкий спектр функций в развитии и нормальном функционировании центральной нервной системы. Большое количество белков, секретируемых глиальными клетками, включая, в частности, микроглию и астроциты, отражают широкий спектр глиальных состояний, включая нейровоспаление в центральной^{нервной системе.} Было продемонстрировано, что секретом белка обладает как нейропротекторным, так и нейротоксическим действием. Например, гены, кодирующие нейролигин, трансмембранный белок, присутствующий в постсинапсах и регулирующий структуру и функцию синаптических соединений³, были признаны фактором риска расстройств аутистического спектра. Нейролигин претерпевает процесс, называемый выделением эктодоменов, при котором эктодомены трансмембранных белков высвобождаются с поверхности клетки путем расщепления от мембраны в виде секретома ^4,5.

Многие белки в секретоме мозга могут быть обнаружены в спинномозговой жидкости; Таким образом, протеомный анализ этой жидкости может помочь выявить новые физиологические и патологические механизмы и биомаркеры неврологических заболеваний ^6,7. Многие физиологические функции белков секретома мозга остаются неизвестными и требуют дальнейшего изучения. Создание эффективной процедуры извлечения секретома мозга имеет решающее значение для этих исследований. Тем не менее, существующая процедура извлечения секретома из спинномозговой жидкости сложна и трудоемка, и выделить эти белки из экспериментального мозга животных сложно. В этой статье мы представляем новый протокол выделения секретома из срезов мозга мыши.

Срезы мозга, культивируемые in vitro, содержат те же типы клеток и трехмерную клеточную структуру, что и мозговая ткань, сохраняя нормальные и неповрежденные синаптические цепи, распределение рецепторов, передачу трансмиттеров и другие физиологические функции. Модель имитирует рост и функционирование нервных клеток у мышей, когда срезы мозга помещаются в соответствующую культуральную среду для обеспечения устойчивого роста и выживания клеток. В этом исследовании срезы мозга мыши продолжали секретировать нейросекреторные белки9, а изолированный мозг был препарирован и помещен на фильтрующую вставку в стерильных условиях. Фильтрующие вкладыши помещали в 6-луночные планшеты, содержащие питательную среду. Учитывая, что белки, секретируемые нейронами и глиальными клетками, могут проникать через мембрану вставки, но не проникают в клетки, секретом мозга может быть таким образом собран из условной питательной среды.

В этой статье описываются основные процедуры (i) выделения срезов мозга, (ii) сбора срезов мозга, (iii) сбора культур срезов мозга из условной среды, (iv) вестерн-блоттинга и (v) протеомного анализа (рис. 1).

протокол

Этот протокол был одобрен и соответствует рекомендациям по уходу за животными, установленным Комитетом по уходу за животными и их использованию Южного университета науки и технологий (SUSTech-JY202112006). В этом исследовании использовались взрослые самцы и самки мышей C57BL/6J (в возрасте 6-8 недель, 22-30 г). Мышей содержали при температуре 22-25 °C в циркадном цикле 12 часов света и 12 часов темноты, с ограниченным доступом к пище и воде. Шаги протокола перечислены ниже.

1. Выделение срезов мозга

Подготовьте хирургические инструменты: офтальмологический гибочный пинцет, мензурки (250 мл, 500 мл), фильтровальную бумагу, ножницы, лезвие бритвы, одностороннее лезвие и ручку-кисть. Поместите эти инструменты в пенопластовую коробку, наполненную колотым льдом, чтобы остыть.
Откройте клапан для газовой смеси, содержащей 95%_O2 и 5%_CO2. Очистите головку газовой трубы, поместив ее в стакан со сверхчистой водой.
Приготовьте буфер для ледяной диссекции с использованием следующих компонентов: 225 мМ сахарозы, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ₂PO₄, 26 мМ NaHCO₃, 11 мМ D-глюкозы, 5 мМ L-аскорбиновой кислоты, 3 мМ пирувата натрия, 7 мМ MgSO4 и 0,5 мМ CaCl₂. Отрегулируйте pH до 7,3-7,4.
Приготовьте питательный раствор со следующими компонентами: 122 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ₂PO₄, 26 мМ NaHCO₃, 11 мМ D-глюкоза, 7 мМ MgSO4 и 0,5 мМ CaCl₂. Отрегулируйте pH до 7,3-7,4, затем отфильтруйте и добавьте в культуральный раствор 10% раствор пенициллин-стрептомицина (P/S).
Насытите кислородом питательный раствор и раствор для вскрытия в течение 30 минут, прежде чем умерщвлять мышей. Сломайте лезвие бритвы, чтобы взять половину ломтика, а затем установите его на слайсер. Установите основание и держатель инструмента для слайсера.
Принесите мышей в жертву путем вывиха шейного отдела позвоночника или с использованием 2-3% изофторана для обезболивания.
1. С помощью ножниц отрежьте череп на шее. Разрежьте кожу в середине черепа, чтобы обнажить весь череп.
2. Используйте офтальмологические ножницы, чтобы разрезать череп по срединной линии, и используйте изогнутые глазные щипцы, чтобы разрезать череп на части.
3. Наконец, с помощью изогнутых щипцов доберитесь до основания черепа и отрежьте нерв основания; Теперь можно удалить весь мозг.
Быстро поместите мозг в ледяной буфер для вскрытия. С помощью острого стерилизованного одностороннего лезвия отрежьте лишние части мозга, в том числе и нижнюю часть.
Воткните ткани мозга в резервуар с помощью соответствующего клея. Налейте раствор для нарезки в резервуар, убедившись, что мозговая ткань покрыта, и продолжайте насыщать кислородом.
Отрегулируйте параметры вибратома, чтобы разрезать ткань на участки толщиной 300 мкм. Скорость и частота среза, использованного в этом исследовании, составили 0,3 мм/с и 70 Гц соответственно.
С помощью кисточки выберите срезы мозга и положите их в чашку с раствором культуры. Затем перенесите от двух до четырех срезов на каждые 30 мм с размером пор 0,4 мкм тканевую культуру в 6-луночные планшеты, содержащие 1,5 мл питательного раствора, на расстоянии, которое не позволяет срезам врастать друг в друга.
Инкубируйте ткани при температуре 37°C, 5%_CO2 и влажности 95% в течение 14 часов.

2. Сбор срезов мозга

Отсадите питательную среду из покровного стекла и аккуратно перенесите срез мозга в пробирку объемом 1,5 мл с помощью щетки.
Добавьте в пробирку 200-400 мкл сбалансированного раствора соли Ганкса (HBSS), содержащего 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Строго поколебать и перемешать до образования однородного раствора с помощью измельчителя тканей. Частота и время, использованные в этом исследовании, составили 800 Гц и 60 с соответственно.
Центрифугируйте суспензию при 700 x g в течение 10 мин при 4 °C. Затем соберите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
Добавьте 20-40 мкл 20% Triton X-100 в надосадочную жидкость и вращайте образец с помощью качающегося шейкера при температуре 4°C в течение 1 ч.
Центрифугируйте суспензию при 13 000 x g в течение 20 минут при 4 °C и соберите надосадочную жидкость. Нормализуйте все образцы среза мозга до концентрации белка 2 мкг/мкл с помощью набора для анализа белка бицинхоновой кислоты (BCA).
Смешайте надосадочную жидкость в 5-кратном буфере для загрузки додецилсульфата натрия (SDS) (10% SDS, 10 мМ дитиотреитола [DTT], 250 мМ Tris-HCl [pH 6,8], 30% [v/v] глицерина и 0,05% [w/v] бромфенолового синего красителя) и кипятите образец в течение 5 минут при 95 °C.
Подготовленные образцы заморозьте при температуре -20 °C. Впоследствии они будут подвергнуты выявлению методами электрофореза и вестерн-блоттинга.

3. Забор культуры срезов мозга кондиционированной среды (КМ)

Отсадите питательную среду через 14 ч и отфильтруйте КМ с помощью фильтра 0,22 мкм.
Концентрируйте кондиционированную среду до 100 мкл с помощью ультрафильтрационной центрифуги с током 10 кДа при давлении 9 000 x g в течение 50 мин при 4 °C. Нормализуйте все образцы среды до концентрации белка 0,8 мкг/л с помощью набора для анализа белка BCA.
Разбавьте кондиционированную среду в загрузочном буфере 5x SDS и кипятите 5 минут при температуре 95 °C.
Подготовленные образцы заморозьте при температуре -20 °C. Впоследствии они будут подвергнуты выявлению методами электрофореза и вестерн-блоттинга.

4. Вестерн-блоттинг

Приготовьте гель для электрофореза в полиакриламидном геле для додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), как описано ранее¹⁰. Загрузите срез мозга и образец среды в сборные гели SDS-PAGE. Сначала разделите образцы при постоянном напряжении 80 В в течение 30 минут, а затем при постоянном напряжении 120 В в течение 70 минут.
Перенесите белки на мембраны поливинилидендифторида (PVDF) и блокируйте 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в трис-буферизованном физиологическом растворе Tween 20 (TBST; 150 мМ NaCl, 20 мМ Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,4) в течение 1 ч.
Добавьте первичные антитела в TBST следующим образом: мышиный анти-sAPP-α (коэффициент разведения антител 1:5000), кроличий антикластерин (коэффициент разведения антител 1:5000), мышиный анти-MAP2 (коэффициент разведения антител 1:5000), мышиный анти-GAPDH (коэффициент разведения антител 1:5000) и мышиный антиактин (коэффициент разведения антител 1:5000) и инкубируйте в течение ночи при 4°C на качалке.
Промойте мембрану три раза с TBST по 15 минут каждый.
Добавьте соответствующее вторичное антитело в буфер TBST следующим образом: m-IgGκ BP-HRP (разведение 1:5000), мышиный антикроличий IgG-HRP (коэффициент разведения вторичных антител 1:5000). Выдерживать 1-2 ч.
Промойте мембрану три раза с помощью TBST по 15 минут каждый.
Отсканируйте и визуализируйте мембраны с помощью соответствующей системы визуализации.

5. Протеомный анализ

В этом исследовании собирают питательную среду (КМ) в соответствии с этапом 3.1 и затем концентрируют ее до конечного объема 80 мкл с помощью пробирки с концентрацией 3 кДа при концентрации 9000 x g в течение 40 мин при 4 °C. Храните образец КМ на льду в ожидании масс-спектрометрического анализа.
Протеомные методы обнаружения и анализа образцов проводят в соответствии с протоколами, описанными в предыдущих работах 11,12,13.

Результаты

Чтобы количественно оценить секрецию внеклеточных белков в срезах мозга, мы изучили концентрации белков в образцах среза мозга и образцах кондиционированной среды с помощью экспериментов по анализу BCA. Образцы срезов мозга и образцы кондиционированной среды имели в...

Обсуждение

Секретом мозга относится к совокупности сигнальных молекул, известных как нейросекреторные или нейропептидные продукты, которые высвобождаются нейронами или глиальными клетками во внеклеточную среду. Секретом мозга выполняет важнейшие функции во многих биологиче...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет никаких конфликтов интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Шэньчжэньским клиническим исследовательским центром психических расстройств (20210617155253001), Шэньчжэньским фондом для ключевых клинических специальностей высокого уровня провинции Гуандун (SZGSPO13), Комитетом по научно-техническим инновациям Шэньчжэня (JCYJ20200109150700942), Программой исследований и разработок в ключевых областях провинции Гуандун (2019B030335001) и Фондом строительства ключевых медицинских дисциплин провинции Шэньчжэнь (SZXK042) Мы благодарны за помощь Ключевой лаборатории провинции Гуандун Передовые биоматериалы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Non-Sterile Millex Syringe Filters with PES Membrane	Millipore	SLGPR33RB
1,4-Dithio-DL-threitol (DTT)	Merck (Sigma Aldrich)	DTT-RO
6-well plates	CORNING	3516
Actin antibody	Cell Signaling Technology	#3700
APP Antibody	Cell Signaling Technology	2452
BioRad Mini-Protean TGX precast gels	BioRad	#1610185
Bovine serum albumin (BSA)	Merck (Sigma Aldrich)	10735094001
Bromophenol Blue	Merck (Sigma Aldrich)	B0126
Brush pen	Deli	1.00008E+11
CaCl₂	Merck (Sigma Aldrich)	C1016
CF₃COOH	Merck (Sigma Aldrich)	302031
CH₃CN	Merck (Sigma Aldrich)	34851
Clusterin antibody	Cell Signaling Technology	#42143
D-Glucose	Merck (Sigma Aldrich)	G8270
Easy-nLC1200	Thermo Fisher Scientific	Easy-nLC1200
Filter paper	ROHU	ROHU-DLLZ00105
GAPDH antibody	Cell Signaling Technology	# 5174S
Glycerol	Merck (Sigma Aldrich)	G5516-100ML
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen (Gibco)	14175095
Human/Rat NLGN2 Antibody	R&D Systems	AF5645
ICH₂CONH₂	Merck (Sigma Aldrich)	I6125
Immun-Blot PVDF membranes	BIO-RAD	#1620177
KCl	Merck (Sigma Aldrich)	P3911
L-Ascorbic Acid	Merck (Sigma Aldrich)	A92902
Map2 antibody	Cell Signaling Technology	# 4542S
MgSO₄	Merck (Sigma Aldrich)	M7506
m-IgGκ BP-HRP	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-516102
Millicell-CM 0.4 μm	Millipore	PIHP03050
Millipore AmiconUltra-0.5ML	Millipore	UFC5010
mouse anti-rabbit IgG-HRP	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-2357
NaH₂PO₄	Merck (Sigma Aldrich)	S0751
NaHCO₃	Merck (Sigma Aldrich)	S5761
NH₄HCO₃	Merck (Sigma Aldrich)	A6141
Parenzyme	Thermo Fisher Scientific	R001100
Penicillin-Streptomycin Solution(P/S)	Invitrogen (Gibco)	15070063
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
QEactive	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR
Rabbit Anti-Goat IgG (H&L)-HRP Conjugated	Easybio	BE0103-100
Razor blade	BFYING EAGLE	HX-L146-1H
Sodium chloride NaCl	Merck (Sigma Aldrich)	S6150
Sodium dodecylsulfate (SDS)	Merck (Sigma Aldrich)	V900859
Sodium Pyruvate	Merck (Sigma Aldrich)	P2256
SpeedVac SRF110 Refrigerated Vacuum Concentrator (German)	Thermo Fisher Scientific	SRF110P2-115
Sucrose	Merck (Sigma Aldrich)	G8270
Tissue grinder	SCIENTZ	SCIENTZ-48
Tris (Hydroxymethyl)	Merck (Sigma Aldrich)	TRIS-RO
TritonX-100	Merck (Sigma Aldrich)	T8787
Tween-20	Merck (Sigma Aldrich)	P1379
Vibratory slicer	Leica	Leica VT 1000S