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Resumo

O secretoma cerebral desempenha um papel fundamental no desenvolvimento e funcionamento normal do sistema nervoso central. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento do secretoma cerebral de culturas de fatias cerebrais ex vivo .

Resumo

O secretoma cerebral consiste em proteínas secretadas ativamente ou eliminadas da superfície celular por clivagem proteolítica na matriz extracelular do sistema nervoso. Essas proteínas incluem receptores de fator de crescimento e proteínas transmembranares, entre outras, cobrindo um amplo espectro de papéis no desenvolvimento e funcionamento normal do sistema nervoso central. O procedimento atual para extrair o secretoma do líquido cefalorraquidiano é complicado e demorado, e é difícil isolar essas proteínas de cérebros de animais experimentais. Neste estudo, apresentamos um novo protocolo para isolar o secretoma cerebral de culturas de fatias de cérebro de camundongos. Primeiro, os cérebros foram isolados, fatiados e cultivados ex vivo. O meio de cultura foi então filtrado e concentrado para isolamento de proteínas por centrifugação após alguns dias. Finalmente, as proteínas isoladas foram resolvidas usando eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e posteriormente sondadas para caracterização de pureza por western blot. Este procedimento de isolamento do secretoma cerebral de culturas ex vivo de fatias cerebrais pode ser usado para investigar os efeitos do secretoma em uma variedade de doenças do neurodesenvolvimento, como transtornos do espectro do autismo.

Introdução

A matriz extracelular do sistema nervoso consiste em proteínas que são ativamente secretadas ou eliminadas da superfície celular, chamadas de "secretoma". O secretoma cerebral contém proteínas como receptores de fator de crescimento e proteínas transmembrana1, que abrangem um amplo espectro de papéis no desenvolvimento e funcionamento normal do sistema nervoso central. Um grande número de proteínas secretadas pelas células gliais, incluindo micróglia e astrócitos em particular, reflete uma ampla variedade de condições gliais, incluindo neuroinflamação no sistema nervoso central2. Foi demonstrado que o secretoma de proteínas tem efeitos neuroprotetores e neurotóxicos. Por exemplo, genes que codificam neuroligina, uma proteína transmembrana presente nas pós-sinapses que regula a estrutura e a função das junções sinápticas3, foram considerados um fator de risco para transtornos do espectro do autismo. A neuroligina sofre um processo denominado excreção de ectodomínio, no qual os ectodomínios das proteínas transmembranares são liberados da superfície celular por clivagem da membrana na forma de secretoma 4,5.

Muitas proteínas no secretoma dentro do cérebro podem ser detectadas no líquido cefalorraquidiano; Assim, a análise proteômica desse fluido pode ajudar a identificar novos mecanismos fisiológicos e patológicos e biomarcadores de doenças neurológicas 6,7. Muitas das funções fisiológicas das proteínas do secretoma cerebral permanecem desconhecidas e requerem mais exploração. O estabelecimento de um procedimento eficaz para extrair o secretoma cerebral é fundamental para esses estudos. No entanto, o procedimento atual para extrair o secretoma do líquido cefalorraquidiano é complicado e demorado, e é difícil isolar essas proteínas de cérebros de animais experimentais8. Neste artigo, apresentamos um novo protocolo para isolar o secretoma de fatias de cérebro de camundongos.

Fatias de cérebro cultivadas in vitro contêm os mesmos tipos de células e estrutura celular tridimensional que o tecido cerebral, preservando circuitos sinápticos normais e intactos, distribuição de receptores, transmissão de transmissores e outras funções fisiológicas. O modelo imita o crescimento e o funcionamento das células nervosas em camundongos quando as fatias de cérebro são colocadas em um meio de cultura apropriado para garantir o crescimento e a sobrevivência sustentados das células. Neste estudo, as fatias do cérebro do camundongo continuaram a secretar proteínas neurossecretoras9, e o cérebro isolado foi dissecado e colocado em um filtro em condições estéreis. Os insertos filtrantes foram colocados em placas de 6 poços contendo o meio de cultura. Dado que as proteínas secretadas por neurônios e células gliais podem penetrar na membrana da inserção, mas não nas células, o secretoma cerebral pode ser coletado do meio de cultura condicional.

Este artigo descreve os procedimentos básicos para (i) o isolamento de fatias de cérebro, (ii) a coleta de fatias de cérebro, (iii) a coleta de culturas de fatias de cérebro de meio condicional, (iv) análises de western blot e (v) análise proteômica (Figura 1).

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado e segue as diretrizes de cuidados com os animais estabelecidas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia do Sul (SUSTech-JY202112006). Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas adultos (6-8 semanas de idade, 22-30 g) foram usados neste estudo. Os camundongos foram alojados a 22-25 ° C em um ciclo circadiano de 12 h de luz e 12 h de escuridão, com acesso ad libitum a comida e água. As etapas do protocolo estão listadas a seguir.

1. Isolamento de fatias cerebrais

  1. Prepare as ferramentas cirúrgicas: pinça de dobra oftálmica, béqueres (250 mL, 500 mL), papel de filtro, tesoura, lâmina de barbear, lâmina de um lado e caneta de escova. Coloque essas ferramentas em uma caixa de espuma cheia de gelo picado para esfriar.
  2. Abra a válvula para o gás misturado contendo 95% de O2 e 5% de CO2. Limpe a cabeça do tubo de gás colocando-a em um copo de água ultrapura.
  3. Prepare o tampão de dissecção gelado usando os seguintes componentes: 225 mM de sacarose, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 26 mM de NaHCO3, 11 mM de D-glicose, 5 mM de ácido L-ascórbico, 3 mM de piruvato de sódio, 7 mM de MgSO4 e 0,5 mM de CaCl2. Ajuste o pH para 7,3-7,4.
  4. Prepare a solução de cultura com os seguintes componentes: 122 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 26 mM de NaHCO3, 11 mM de D-glicose, 7 mM de MgSO4 e 0,5 mM de CaCl2. Ajuste o pH para 7,3-7,4, filtre e adicione 10% de solução de penicilina-estreptomicina (P/S) na solução de cultura.
  5. Oxigenar a solução de cultura e a solução de dissecção durante 30 minutos antes de sacrificar os ratinhos. Quebre a lâmina de barbear para pegar metade da fatia e monte-a no fatiador. Instale a base e o porta-ferramentas do fatiador.
  6. Sacrifique os camundongos por luxação cervical ou usando 2% -3% de isofluorano para anestesiar.
    1. Use uma tesoura para cortar o crânio no pescoço. Corte a pele no meio do crânio para expor todo o crânio.
    2. Use uma tesoura oftálmica para cortar o crânio ao longo da linha mediana e use uma pinça ocular curva para cortar o crânio.
    3. Finalmente, use uma pinça curva para alcançar a base do crânio e cortar o nervo base; todo o cérebro agora pode ser removido.
  7. Coloque rapidamente o cérebro em um tampão de dissecação gelado. Use uma lâmina afiada, esterilizada e de um lado para cortar o excesso de partes do cérebro, incluindo a parte inferior.
  8. Cole o tecido cerebral no tanque usando cola apropriada. Despeje a solução de fatiamento no tanque, garantindo que o tecido cerebral esteja coberto e continue a oxigenar.
  9. Ajuste os parâmetros do vibratomo para cortar o tecido em seções de 300 μm de espessura. A velocidade e a frequência do fatiador utilizado neste estudo foram de 0,3 mm/s e 70 Hz, respectivamente.
  10. Use um pincel para retirar as fatias de cérebro e coloque-as em um prato com a solução de cultura. Em seguida, transfira duas a quatro fatias para cada inserção de cultura de tecidos de 30 mm e tamanho de poro de 0,4 μm em placas de 6 poços contendo 1,5 mL da solução de cultura, a uma distância que não permita que as fatias cresçam umas nas outras.
  11. Incubar os tecidos a 37°C, 5% de CO2 e 95% de umidade por 14 h.

2. Coleta de fatias cerebrais

  1. Aspirar o meio de cultura da lamínula e transferir suavemente a fatia de cérebro para o tubo de 1,5 ml com uma escova.
  2. Adicione 200-400 μL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) contendo 1 mmol / L de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) ao tubo. Oscile rigorosamente e misture para formar uma solução homogênea usando um moedor de tecido. A frequência e o tempo utilizados neste estudo foram 800 Hz e 60 s, respectivamente.
  3. Centrifugar a suspensão a 700 x g durante 10 min a 4 °C. Em seguida, colete o sobrenadante em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
  4. Adicione 20-40 μL de Triton X-100 a 20% ao sobrenadante e gire a amostra com um agitador de balanço a 4 ° C por 1 h.
  5. Centrifugar a suspensão a 13.000 x g durante 20 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Normalize todas as amostras de fatias de cérebro para uma concentração de proteína de 2 μg/μL usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA).
  6. Misture o sobrenadante em tampão de carga de dodecil sulfato de sódio (SDS) 5x (10% SDS, 10 mM de ditiotreitol [DTT], 250 mM de Tris-HCl [pH 6,8], 30% [v / v] de glicerol e 0,05% [p / v] de corante azul de bromofenol) e ferva a amostra por 5 min a 95 ° C.
  7. Congelar as amostras preparadas a -20 °C. Posteriormente, serão submetidos à detecção por métodos de eletroforese e western blotting.

3. Coleta de meio condicionado de cultura de fatias de cérebro (CM)

  1. Aspirar o meio de cultura após 14 h e filtrar o CM com um filtro de 0,22 μm.
  2. Concentre o meio condicionado até 100 μL com um tubo de centrífuga de ultrafiltração de 10 kDa a 9.000 x g por 50 min a 4 °C. Normalize todas as amostras de meio para uma concentração de proteína de 0,8 μg/μL usando o kit de ensaio de proteína BCA.
  3. Eluir o meio condicionado em tampão de carga 5x SDS e ferver durante 5 min a 95 °C.
  4. Congelar as amostras preparadas a -20 °C. Posteriormente, serão submetidos à detecção por métodos de eletroforese e western blotting.

4. Análises de Western blot

  1. Prepare o gel de eletroforese em gel de dodecil-sulfato de poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) conforme descrito anteriormente10. Coloque a fatia de cérebro e a amostra média em géis SDS-PAGE pré-moldados. Separe as amostras a uma tensão constante de 80 V por 30 min inicialmente e, em seguida, a uma tensão constante de 120 V por 70 min.
  2. Transfira as proteínas para as membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) e bloqueie com albumina de soro bovino (BSA) a 5% em solução salina tamponada com tris-Tween 20 (TBST; 150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,4) por 1 h.
  3. Adicione anticorpos primários no TBST da seguinte forma: anti-sAPP-α de camundongo (taxa de diluição de anticorpos de 1:5.000), anti-clusterina de coelho (taxa de diluição de anticorpos de 1:5.000), anti-MAP2 de camundongo (taxa de diluição de anticorpos de 1:5.000), anti-GAPDH de camundongo (taxa de diluição de anticorpos de 1:5.000) e anti-actina de camundongo (taxa de diluição de anticorpos de 1:5.000) e incube durante a noite a 4 °C em um balancim.
  4. Lave a membrana três vezes com TBST por 15 min cada.
  5. Adicione um anticorpo secundário apropriado no tampão TBST da seguinte forma: m-IgGκ BP-HRP (diluição de 1:5.000), IgG-HRP de camundongo anti-coelho (razão de diluição de anticorpos secundários de 1:5.000). Incubar por 1-2 h.
  6. Lave a membrana três vezes usando TBST por 15 min cada.
  7. Digitalize e obtenha imagens das membranas usando um sistema de imagem apropriado.

5. Análise proteômica

  1. Neste estudo, coletar o meio de cultura (CM) de acordo com a etapa 3.1 e, posteriormente, concentrá-lo até um volume final de 80 μL usando um tubo de concentração de 3 kDa a 9.000 x g por 40 min a 4 °C. Armazenar a amostra de CM no gelo, aguardando análise por espectrometria de massa.
  2. Conduza os métodos de detecção e análise proteômica para amostras seguindo os protocolos descritos em trabalhos anteriores 11,12,13.

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Resultados

Para quantificar a secreção de proteínas extracelulares em fatias de cérebro, examinamos as concentrações de proteínas das amostras de fatias de cérebro e amostras de meio condicionado por meio de experimentos de ensaio de BCA. Amostras de fatias de cérebro e amostras de meio condicionado apresentaram altas concentrações de proteínas (Tabela 1 e Figura 2). Descobrimos que um grande número de proteínas extracelu...

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Discussão

O secretoma cerebral refere-se à coleção de moléculas de sinalização, conhecidas como produtos neurossecretores ou neuropeptídicos, que são liberadas por neurônios ou células gliais no ambiente extracelular. O secretoma cerebral possui funções críticas em muitos processos biológicos e fisiológicos do sistema nervoso17,18. Compreender o secretoma cerebral e suas funções é importante para obter informações sobre...

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Divulgações

Os autores afirmam que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Centro de Pesquisa Clínica para Transtornos Mentais de Shenzhen (20210617155253001), Fundo de Shenzhen para Especialidades Clínicas de Alto Nível da Província de Guangdong (SZGSPO13), Comitê de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20200109150700942), Programa de Pesquisa e Desenvolvimento de Área-Chave da Província de Guang Dong (2019B030335001) e Fundo de Construção de Disciplina Médica Chave de Shenzhen (SZXK042) Somos gratos pela assistência do Laboratório Chave da Província de Guangdong de Biomateriais Avançados.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm Non-Sterile Millex Syringe Filters with PES MembraneMilliporeSLGPR33RB
1,4-Dithio-DL-threitol (DTT)Merck (Sigma Aldrich)DTT-RO
6-well platesCORNING3516
Actin antibodyCell Signaling Technology #3700
APP AntibodyCell Signaling Technology2452
BioRad Mini-Protean TGX precast gelsBioRad#1610185
Bovine serum albumin (BSA)Merck (Sigma Aldrich)10735094001
Bromophenol BlueMerck (Sigma Aldrich)B0126
Brush penDeli1.00008E+11
CaCl2Merck (Sigma Aldrich)C1016
CF3COOHMerck (Sigma Aldrich)302031
CH3CNMerck (Sigma Aldrich)34851
Clusterin antibodyCell Signaling Technology#42143
D-GlucoseMerck (Sigma Aldrich)G8270
Easy-nLC1200Thermo Fisher ScientificEasy-nLC1200
Filter paperROHUROHU-DLLZ00105
GAPDH antibodyCell Signaling Technology# 5174S
GlycerolMerck (Sigma Aldrich)G5516-100ML
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen (Gibco)14175095
Human/Rat NLGN2 AntibodyR&D SystemsAF5645
ICH2CONH2Merck (Sigma Aldrich)I6125
Immun-Blot PVDF membranesBIO-RAD#1620177
KClMerck (Sigma Aldrich)P3911
L-Ascorbic AcidMerck (Sigma Aldrich)A92902
Map2 antibodyCell Signaling Technology# 4542S
MgSO4Merck (Sigma Aldrich)M7506
m-IgGκ BP-HRPSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-516102
Millicell-CM 0.4 μmMilliporePIHP03050
Millipore AmiconUltra-0.5MLMilliporeUFC5010
mouse anti-rabbit IgG-HRPSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-2357
NaH2PO4Merck (Sigma Aldrich)S0751
NaHCO3Merck (Sigma Aldrich)S5761
NH4HCO3Merck (Sigma Aldrich)A6141
ParenzymeThermo Fisher ScientificR001100
Penicillin-Streptomycin Solution(P/S)Invitrogen (Gibco)15070063
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QEactiveThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Rabbit Anti-Goat IgG (H&L)-HRP ConjugatedEasybioBE0103-100
Razor bladeBFYING EAGLEHX-L146-1H
Sodium chloride NaClMerck (Sigma Aldrich)S6150
Sodium dodecylsulfate (SDS)Merck (Sigma Aldrich)V900859
Sodium PyruvateMerck (Sigma Aldrich)P2256
SpeedVac SRF110 Refrigerated Vacuum Concentrator (German)Thermo Fisher ScientificSRF110P2-115
SucroseMerck (Sigma Aldrich)G8270
Tissue grinderSCIENTZSCIENTZ-48
Tris (Hydroxymethyl)Merck (Sigma Aldrich)TRIS-RO
TritonX-100Merck (Sigma Aldrich)T8787
Tween-20Merck (Sigma Aldrich)P1379
Vibratory slicerLeicaLeica VT 1000S

Referências

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