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요약

뇌 분비체는 중추 신경계의 발달과 정상적인 기능에 중추적인 역할을 합니다. 이 기사에서는 생체 외 뇌 절편 배양에서 뇌 분비체를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

뇌 분비체(brain secretome)는 신경계의 세포외 기질(extracellular matrix)에서 단백질 분해 분열에 의해 세포 표면에서 활발하게 분비되거나 방출되는 단백질로 구성되어 있습니다. 이러한 단백질에는 성장 인자 수용체(growth factor receptor)와 막관통 단백질(transmembrane protein)이 포함되며, 특히 중추 신경계의 발달 및 정상적인 기능에 대한 광범위한 역할을 다룹니다. 뇌척수액에서 분비체를 추출하는 현재의 절차는 복잡하고 시간이 많이 소요되며, 실험용 동물의 뇌에서 이러한 단백질을 분리하는 것은 어렵습니다. 이 연구에서는 쥐의 뇌 절편 배양에서 뇌 분비체를 분리하기 위한 새로운 프로토콜을 제시합니다. 먼저, 뇌를 분리하고, 절편화하고, 체 외에서 배양했습니다. 그런 다음 배양 배지를 여과하고 농축하여 며칠 후 원심분리로 단백질을 분리했습니다. 마지막으로, 분리된 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 사용하여 분리된 단백질을 분리한 후 웨스턴 블롯(western blot)에 의한 순도 특성화를 조사했습니다. 생체 외 뇌 절편 배양에서 뇌 분비체를 분리하는 이 절차는 자폐 스펙트럼 장애와 같은 다양한 신경 발달 질환에 대한 분비체의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

신경계의 세포외 기질은 세포 표면에서 활발하게 분비되거나 흘러나오는 단백질로 구성되어 있으며, 이를 "분비체(secretome)"라고 합니다. 뇌 분비체(brain secretome)는 성장인자 수용체(growth factor receptor)와 막관통 단백질(transmembrane protein)1과 같은 단백질을 포함하고 있으며, 이는 중추신경계의 발달과 정상적인 기능에 광범위한 역할을 합니다. 특히 미세아교세포(microglia)와 성상세포(astrocyte)를 포함하여 신경교세포(glial cell)에서 분비되는 많은 단백질은 중추신경계의 신경염증을 포함한 다양한 신경교세포(glial condition)를 반영한다2. 단백질 분비체는 신경 보호 효과와 신경독성 효과를 모두 가지고 있는 것으로 입증되었습니다. 예를 들어, 시냅스 접합3의 구조와 기능을 조절하는 시냅스 후 단백질인 막관통 단백질인 뉴로리진(neuroligin)을 암호화하는 유전자는 자폐 스펙트럼 장애의 위험 요인으로 밝혀졌습니다. 뉴로리진(neuroligin)은 엑토도메인 흘리기(ectodomain sheding)라고 불리는 과정을 거치는데, 이 과정에서 막관통 단백질의 외도메인(ectodomain)은 분비체 형태의 막에서 절단에 의해 세포 표면에서 방출됩니다 4,5.

뇌 내 분비체의 많은 단백질은 뇌척수액에서 검출될 수 있습니다. 따라서 이 유체의 단백질체 분석은 신경 질환의 새로운 생리학적 및 병리학적 메커니즘과 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다 6,7. 뇌 분비 단백질의 생리학적 기능 중 많은 부분이 아직 알려지지 않은 상태로 남아 있으며 추가 연구가 필요합니다. 뇌 분비체를 추출하기 위한 효과적인 절차를 확립하는 것은 이러한 연구에서 매우 중요합니다. 그러나 뇌척수액에서 분비체를 추출하는 현재의 절차는 복잡하고 시간이 많이 소요되며, 실험용 동물의 뇌에서 이러한 단백질을 분리하는 것은 어렵다8. 이 기사에서는 쥐의 뇌 절편에서 분비체를 분리하기 위한 새로운 프로토콜을 제시합니다.

체외에서 배양된 뇌 절편은 뇌 조직과 동일한 세포 유형과 3차원 세포 구조를 포함하여 정상 및 온전한 시냅스 회로, 수용체 분포, 전달물질 전달 및 기타 생리적 기능을 보존합니다. 이 모델은 지속적인 세포 성장과 생존을 보장하기 위해 뇌 절편을 적절한 배양 배지에 배치할 때 쥐의 신경 세포의 성장과 기능을 모방합니다. 이 연구에서 쥐의 뇌 절편은 신경 분비단백질을 계속 분비하고9 분리된 뇌를 해부하여 무균 상태에서 필터 삽입물에 놓았습니다. 필터 삽입물을 배양 배지를 함유하는 6-웰 플레이트에 넣었습니다. 뉴런과 신경교세포에서 분비되는 단백질이 삽입체의 막을 관통할 수 있지만 세포는 통과할 수 없다는 점을 감안할 때, 뇌 분비체는 조건부 배양 배지에서 수집될 수 있습니다.

이 기사에서는 (i) 뇌 절편 분리, (ii) 뇌 절편 수집, (iii) 조건부 배지에서 뇌 절편 배양 수집, (iv) 웨스턴 블롯 분석 및 (v) 단백질체 분석에 대한 기본 절차를 설명합니다(그림 1).

프로토콜

이 프로토콜은 승인되었으며 Southern University of Science and Technology Animal Care and Use Committee(SUSTech-JY202112006)에서 정한 동물 관리 지침을 따릅니다. 본 연구에서는 성체 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스(생후 6-8주, 22-30g)를 사용하였다. 생쥐는 22-25 °C에서 12 시간의 빛과 12 시간의 어둠의 일주기 주기로 수용되었으며, 음식과 물에 대한 자유가 주어졌습니다. 프로토콜의 단계는 다음과 같습니다.

1. 뇌 절편의 분리

  1. 수술 도구를 준비합니다: 안과용 굽힘 핀셋, 비커(250mL, 500mL), 여과지, 가위, 면도날, 단면 면도날, 브러시 펜. 이 도구를 으깬 얼음으로 채워진 거품 상자에 넣어 식히십시오.
  2. 95% O2 및 5% CO2를 포함하는 혼합 가스의 밸브를 엽니다. 가스 파이프 헤드를 초순수 비이커에 넣어 청소합니다.
  3. 다음 성분을 사용하여 빙저온 해부 완충액을 준비합니다: 225 mM 수크로스, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 11 mM D-글루코스, 5 mM L-아스코르브산, 3 mM 피루브산 나트륨, 7 mM MgSO4 및 0.5 mM CaCl2. pH를 7.3-7.4로 조정합니다.
  4. 122 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 , 11 mM D-glucose, 7 mM MgSO4 및 0.5 mM CaCl2 성분으로 배양 용액을 준비합니다. pH를 7.3-7.4로 조정한 다음 여과하여 10% 페니실린-스트렙토마이신 용액(P/S)을 배양 용액에 추가합니다.
  5. 마우스를 희생하기 전에 배양 용액과 해부 용액에 산소를 공급하십시오. 면도날을 부수어 슬라이스의 절반을 취한 다음 슬라이서에 장착합니다. 슬라이서의 베이스와 도구 홀더를 설치합니다.
  6. 경추 탈구로 생쥐를 희생시키거나 2%-3% 이소플루오란을 사용하여 마취시킵니다.
    1. 가위를 사용하여 목의 두개골을 자릅니다. 두개골 중앙의 피부를 잘라 두개골 전체를 드러냅니다.
    2. 안과 가위를 사용하여 중앙선을 따라 두개골을 자르고 구부러진 안구 집게를 사용하여 두개골을 잘라냅니다.
    3. 마지막으로 구부러진 집게를 사용하여 두개골 기저부에 도달하고 기저 신경을 절단합니다. 이제 뇌 전체를 제거할 수 있습니다.
  7. 뇌를 얼음처럼 차가운 해부 완충액에 빠르게 넣습니다. 날카롭고 살균된 단면 칼날을 사용하여 뇌의 바닥 부분을 포함하여 뇌의 과도한 부분을 잘라냅니다.
  8. 적절한 접착제를 사용하여 뇌 조직을 탱크에 붙입니다. 슬라이싱 용액을 탱크에 붓고 뇌 조직이 덮여 있는지 확인하고 계속해서 산소를 공급합니다.
  9. 비브라톰의 매개변수를 조정하여 조직을 300μm 두께의 절편으로 자릅니다. 이 연구에 사용된 슬라이서의 속도와 주파수는 각각 0.3mm/s와 70Hz였습니다.
  10. 브러시를 사용하여 뇌 조각을 골라내고 배양 용액이 담긴 접시에 넣습니다. 그런 다음, 1.5mL의 배양 용액이 들어있는 6-well plate에 2-4개의 슬라이스를 각각 30mm, 0.4μm 공극 크기의 조직 배양 삽입물에 슬라이스가 서로 자라지 않도록 거리를 두고 옮깁니다.
  11. 37°C, 5% CO2 및 95% 습도에서 14시간 동안 조직을 배양합니다.

2. 뇌 슬라이스 수집

  1. 커버슬립에서 배양 배지를 흡인하고 브러시를 사용하여 뇌 절편을 1.5mL 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
  2. 1mmol/L 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 함유한 200-400μL의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)을 튜브에 추가합니다. 엄격하게 진동하고 혼합하여 티슈 그라인더를 사용하여 균일한 용액을 형성합니다. 이 연구에 사용된 주파수와 시간은 각각 800Hz와 60초였습니다.
  3. 현탁액을 700 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 새 1.5mL 원심분리 튜브에 모읍니다.
  4. 20-40 μL의 20% Triton X-100을 상층액에 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 흔들리는 쉐이커로 샘플을 회전시킵니다.
  5. 현탁액을 13,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 수집합니다. 비신초닌산(BCA) 단백질 분석 키트를 사용하여 모든 뇌 절편 샘플을 2μg/μL의 단백질 농도로 정규화합니다.
  6. 상등액을 5x 도데실황산나트륨(SDS) 로딩 버퍼(10% SDS, 10mM 디티오트레이톨[DTT], 250mM 트리스-HCl[pH 6.8], 30%[v/v] 글리세롤 및 0.05%[w/v] 브로모페놀 블루 염료)에 혼합하고 샘플을 95°C에서 5분 동안 끓입니다.
  7. 준비된 샘플을 -20°C에서 동결합니다. 그들은 이후에 전기 영동 및 웨스턴 블로팅 방법에 의해 검출 될 것입니다.

3. 뇌절편 배양 조건화 매체(CM) 수집

  1. 14시간 후 배양액을 흡입하고 0.22μm 필터를 사용하여 CM을 여과합니다.
  2. 10kDa 한외여과 원심분리 튜브를 사용하여 9,000 x g 에서 4°C에서 50분 동안 최대 100μL의 컨디셔닝 배지를 농축합니다. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 모든 배지 샘플을 0.8μg/μL의 단백질 농도로 정규화합니다.
  3. 컨디셔닝된 배지를 5x SDS 로딩 버퍼에서 용리하고 95°C에서 5분 동안 끓입니다.
  4. 준비된 샘플을 -20°C에서 동결합니다. 그들은 이후에 전기 영동 및 웨스턴 블로팅 방법에 의해 검출 될 것입니다.

4. 웨스턴 블롯 분석

  1. 앞서 설명한 바와 같이 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 나트륨 겔 전기영동(SDS-PAGE)겔을 준비한다10. 브레인 슬라이스와 배지 샘플을 프리캐스트 SDS-PAGE 젤에 로드합니다. 샘플을 분리하십시오.tage 80V의 정전압에서 처음에는 30분 동안, 그 다음에는 120V의 정전압에서 70분 동안.
  2. 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮기고 트리스 완충 식염수-트윈 20(TBST; 150mM NaCl, 20mM Tris, 0.1% Tween-20, pH 7.4)에서 1시간 동안 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단합니다.
  3. TBST에 1차 항체를 추가하는 방법은 mouse anti-sAPP-α(항체 희석율 1:5,000), rabbit anti-clusterin(항체 희석률 1:5,000), mouse anti-MAP2(항체 희석율 1:5,000), mouse anti-GAPDH(항체 희석율 1:5,000), mouse anti-actin(항체 희석률 1:5,000)으로 하고, rocker에서 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
  4. TBST로 멤브레인을 각각 15분 동안 세 번 세척합니다.
  5. TBST 완충액에 m-IgGκ BP-HRP(1:5,000 희석), 마우스 항토끼 IgG-HRP(2차 항체 희석 비율 1:5,000)와 같이 적절한 2차 항체를 추가합니다. 1-2시간 동안 배양합니다.
  6. TBST를 사용하여 멤브레인을 각각 15분 동안 세 번 세척합니다.
  7. 적절한 이미징 시스템을 사용하여 멤브레인을 스캔하고 이미지화합니다.

5. 단백질체 분석

  1. 본 연구에서는 3.1단계에 따라 배양 배지(CM)를 수집한 후 4°C에서 40분 동안 9,000 x g 의 3kDa 농축 튜브를 사용하여 최종 부피 80μL로 농축합니다. 질량 분석 분석을 기다리는 얼음 위에 CM 샘플을 보관하십시오.
  2. 이전 논문 11,12,13에서 설명한 프로토콜에 따라 샘플에 대한 단백질체학 검출 및 분석 방법을 수행합니다.

결과

뇌 절편에서 세포외 단백질의 분비를 정량화하기 위해 BCA 분석 실험을 통해 뇌 절편 샘플과 컨디셔닝된 배지 샘플의 단백질 농도를 조사했습니다. 뇌 절편 샘플과 조건화된 중간 크기 샘플은 모두 높은 단백질 농도를 보였습니다(표 1 및 그림 2). 우리는 많은 수의 세포외 단백질이 배지로 분비되는 것을 발견했으며, 조절된 ...

토론

뇌 분비체(brain secretome)는 신경 분비 또는 신경 펩타이드 산물로 알려진 신호 분자의 집합체를 말하며, 이 분자는 뉴런 또는 신경교세포에 의해 세포 외 환경으로 방출됩니다. 뇌 분비체는 신경계의 많은 생물학적, 생리적 과정에서 중요한 기능을 수행합니다17,18. 뇌 분비체와 그 기능을 이해하는 것은 뇌 기능과 장애의 기저에 ?...

공개

저자는 이해 상충이 없다고 말합니다.

감사의 말

이 연구는 심천 정신 장애 임상 연구 센터(20210617155253001), 광둥성 고위급 임상 핵심 전문 선전 선전 기금(SZGSPO13), 선전 과학 기술 혁신 위원회(JCYJ20200109150700942), 광동성 핵심 지역 연구 개발 프로그램(2019B030335001) 및 선전 핵심 의료 분야 건설 기금(SZXK042)의 지원을 받았습니다. 고급 생체 재료.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm Non-Sterile Millex Syringe Filters with PES MembraneMilliporeSLGPR33RB
1,4-Dithio-DL-threitol (DTT)Merck (Sigma Aldrich)DTT-RO
6-well platesCORNING3516
Actin antibodyCell Signaling Technology #3700
APP AntibodyCell Signaling Technology2452
BioRad Mini-Protean TGX precast gelsBioRad#1610185
Bovine serum albumin (BSA)Merck (Sigma Aldrich)10735094001
Bromophenol BlueMerck (Sigma Aldrich)B0126
Brush penDeli1.00008E+11
CaCl2Merck (Sigma Aldrich)C1016
CF3COOHMerck (Sigma Aldrich)302031
CH3CNMerck (Sigma Aldrich)34851
Clusterin antibodyCell Signaling Technology#42143
D-GlucoseMerck (Sigma Aldrich)G8270
Easy-nLC1200Thermo Fisher ScientificEasy-nLC1200
Filter paperROHUROHU-DLLZ00105
GAPDH antibodyCell Signaling Technology# 5174S
GlycerolMerck (Sigma Aldrich)G5516-100ML
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen (Gibco)14175095
Human/Rat NLGN2 AntibodyR&D SystemsAF5645
ICH2CONH2Merck (Sigma Aldrich)I6125
Immun-Blot PVDF membranesBIO-RAD#1620177
KClMerck (Sigma Aldrich)P3911
L-Ascorbic AcidMerck (Sigma Aldrich)A92902
Map2 antibodyCell Signaling Technology# 4542S
MgSO4Merck (Sigma Aldrich)M7506
m-IgGκ BP-HRPSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-516102
Millicell-CM 0.4 μmMilliporePIHP03050
Millipore AmiconUltra-0.5MLMilliporeUFC5010
mouse anti-rabbit IgG-HRPSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGYsc-2357
NaH2PO4Merck (Sigma Aldrich)S0751
NaHCO3Merck (Sigma Aldrich)S5761
NH4HCO3Merck (Sigma Aldrich)A6141
ParenzymeThermo Fisher ScientificR001100
Penicillin-Streptomycin Solution(P/S)Invitrogen (Gibco)15070063
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QEactiveThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Rabbit Anti-Goat IgG (H&L)-HRP ConjugatedEasybioBE0103-100
Razor bladeBFYING EAGLEHX-L146-1H
Sodium chloride NaClMerck (Sigma Aldrich)S6150
Sodium dodecylsulfate (SDS)Merck (Sigma Aldrich)V900859
Sodium PyruvateMerck (Sigma Aldrich)P2256
SpeedVac SRF110 Refrigerated Vacuum Concentrator (German)Thermo Fisher ScientificSRF110P2-115
SucroseMerck (Sigma Aldrich)G8270
Tissue grinderSCIENTZSCIENTZ-48
Tris (Hydroxymethyl)Merck (Sigma Aldrich)TRIS-RO
TritonX-100Merck (Sigma Aldrich)T8787
Tween-20Merck (Sigma Aldrich)P1379
Vibratory slicerLeicaLeica VT 1000S

참고문헌

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