从胚胎小鼠大脑中建立混合神经元和神经胶质细胞培养物以研究感染和先天免疫

摘要

该协议提供了一种从胚胎第17天小鼠大脑生成中枢神经系统细胞培养物的独特方法，用于神经（免疫）学研究。该模型可以使用各种实验技术进行分析，包括RT-qPCR，显微镜，ELISA和流式细胞术。

摘要

中枢神经系统（CNS）的模型必须概括 体内发现 的相互连接的细胞的复杂网络。中枢神经系统主要由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞组成。由于越来越多的努力替代和减少动物的使用，已经开发了各种 体外 细胞培养系统来探索先天细胞特性，从而可以开发针对CNS感染和病理的治疗方法。虽然某些研究问题可以通过基于人类的细胞培养系统来解决，例如（诱导的）多能干细胞，但与人类细胞一起工作在可用性、成本和伦理方面有其自身的局限性。在这里，我们描述了一种从胚胎小鼠大脑中分离和培养细胞的独特方案。由此产生的混合神经细胞培养物模拟 体内大脑中发现的几种细胞群和相互作用。与目前的等效方法相比，该协议更接近于模拟大脑的特征，并且还获得了更多的细胞，从而允许从一只怀孕的小鼠中研究更多的实验条件。此外，该协议相对容易且高度可重复。这些培养物已经过优化，可用于各种规模，包括基于 96 孔的高通量筛选、24 孔显微镜分析和用于流式细胞术和逆转录定量聚合酶链反应 （RT-qPCR） 分析的 6 孔培养物。这种培养方法是在CNS的一些复杂性背景下研究感染和免疫力的有力工具，并且体 外 方法很方便。

引言

提高我们对中枢神经系统（CNS）的理解对于改善许多神经炎症和神经退行性疾病的治疗选择至关重要。中枢神经系统是大脑、脊髓和视神经内相互连接的细胞的复杂网络，包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞及其先天免疫细胞小胶质细胞¹。 体外 方法通常可以大大减少进行有意义研究所需的小鼠数量;然而，CNS的复杂性使得不可能使用细胞系概括 体内 情况。混合神经细胞培养物提供了一种非常有价值的研究工具，用于研究相关模型中的神经（免疫）学问题，符合替换、减少和改进（3Rs）原则^2，3。

Thomson等人描述了一种使用产前脊髓细胞分化为上述所有主要CNS细胞类型⁴的细胞培养方法。该系统还具有突触形成，髓鞘轴突和Ranvier节点。这种培养方法的主要局限性是，作为脊髓，它不能有效地模拟大脑，并且胚胎第13天（E13）脊髓的细胞产量正在收缩。因此，这限制了可以研究的实验条件的数量。因此，本研究旨在开发一种新的细胞培养系统，通过提高细胞产量来概括大脑的特征，以减少对动物的需求。

以Thomson等人为起点，我们开发了一种纯粹来自产前小鼠大脑的细胞培养模型。这些培养物具有与脊髓培养物相同的细胞群、互连性和治疗选择，只是相比之下髓鞘形成较少。然而，具有大约三倍细胞产量的CNS 体外 模型更有效，需要更少的小鼠和更少的胚胎处理时间。我们针对多种下游应用和规模优化了这种独特的培养系统，包括使用玻璃盖玻片进行显微镜分析，以及使用各种尺寸的塑料孔板，包括用于高通量研究的 96 孔板。

研究方案

所有动物实验均符合当地动物使用法律和准则，并得到格拉斯哥大学当地伦理审查委员会的批准。根据1986年英国动物科学程序法，在英国内政部项目许可证的主持下，动物被饲养在特定的无病原体条件下。在这项研究中，使用了内部繁殖的成年C57BL / 6J小鼠。由于怀孕成功率较高，建议使用年轻女性（8-12周）;雄性可以重复使用进行多轮繁殖。 图1 表示所述生成混合神经元和神经胶质培养物的方法的示意图。

1. 组织培养耗材的制备

1. 在 2 类安全柜内准备装有显微镜盖玻片的板和/或培养皿。对所有试剂或高压灭菌器进行灭菌，以确保培养期间无菌。
2. 向每个孔中加入适当体积的 BA-PLL（13.2 μg/mL 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 [PLL] 中的硼酸缓冲液 [BA] [50 mM 硼酸，12.5 mM 四硼酸钠，pH 8.5];参见 材料表）（6 孔板中为 1，000 μL/孔，96 孔板中为 100 μL/孔; 表 1 总结了体积）。对于显微镜盖玻片，将 20 mL BA-PLL 加入包含 200 张无菌盖玻片的 9 cm 直径组织培养皿中，并涡旋以均匀分布。
3. 在37°C孵育1-2小时。
4. 从每个孔或含有显微镜盖玻片的培养皿中取出BA-PLL溶液，并通过加入20 mL无菌水，旋转盖玻片，然后除去水来洗涤。重复此洗涤步骤三次。对于含有盖玻片的培养皿，在最后一次洗涤时将无菌水留在组织培养皿中，以便轻松去除盖玻片。
5. 用无菌移液管尽可能多地去除液体，并干燥至少2小时至过夜。
6. 将涂层板在4°C下储存长达2个月。
   注意:制备的硼酸与聚-l-赖氨酸（BA-PLL）溶液最多可重复使用三次，每次添加新的PLL。将BA-PLL储存在4°C。 培养皿用BA-PLL处理，因为PLL允许细胞粘附并生长。如果没有这种处理，细胞将在培养约1周后提升，不再能够分化。

2. 解剖E17胚胎脑

1. 与雄性小鼠共同容纳一只或多只雌性小鼠。每天检查雌性是否有粘液栓，表明已经交配。
   注意:任何"堵塞"的雌性小鼠都需要与雄性小鼠分开，以确保正确的妊娠开始日期。可以称量小鼠以确认怀孕或目视监测。
2. 使用符合当地动物福利指南和法律的适当方法在E17上剔除怀孕小鼠，例如，通过提高二氧化碳（CO₂）浓度，致命麻醉剂过量或颈部脱臼。
   注意:所选择的方法不得破坏胚胎。在这项研究中，暴露于浓度上升的二氧化碳气体中，然后通过切断股动脉确认死亡，用于扑杀怀孕的水坝。
3. 将被淘汰的怀孕小鼠背放在解剖板上;虽然不需要固定它，但它可能会让没有经验的研究人员更容易。用镊子捏住腹部的中线。使用锋利的剪刀，从生殖器到胸腔的中线通过皮肤和腹膜切开腹部，注意不要刺穿子宫。
   1. 小鼠子宫有两个角，每个角通常包含一到五个胚胎。从母亲身上取出含有胚胎的子宫，并立即将其放在冰上。
4. 切开胎盘侧面的蛋黄袋，注意不要损坏胚胎，然后将胚胎从蛋黄袋中取出。
5. 立即将胚胎斩首。将斩首的头加入装有汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的盘中，不含钙（Ca 2+）和镁（Mg²⁺）（HBSS-/-）。
   注意:如果需要基因分型，可以在此阶段去除尾巴进行遗传分析。当预期有多个基因型时，应单独保存每个胚胎的头部以进行培养。
6. 使用倾斜的镊子，将头部朝左放置。
7. 用镊子的一个边缘刺穿眼睛，用另一个边缘牢牢地握住下巴。
8. 从颈背开始，沿着中线向鼻尖轻轻撕裂头皮的皮肤。
9. 通过脊髓进入，明显为白色椭圆形，使用倾斜的镊子沿着中线打开头骨，露出大脑。
10. 轻轻地将头骨朝上一侧剥开，露出大脑。
11. 将大脑从颅骨中取出，一旦大脑被完全移除，就处理掉头骨。
12. 使用镊子去除脑膜，脑膜明显为具有致密血管的薄膜。
13. 将大脑放入含有2mL HBSS-/-的冰上。
14. 用剩余的大脑重复步骤2.6到2.13，每个bijou最多四个大脑。
15. 向bijou中加入250μL 10x胰蛋白酶，并通过摇动bijo来研磨大脑。在37°C孵育15分钟。
    注意:从这一点开始的所有步骤都应在无菌组织培养罩中进行。
16. 将2mL大豆胰蛋白酶（SD）抑制剂（Leibovitz L-15，来自大豆的0.52mg / mL胰蛋白酶抑制剂，40μg/ mL脱氧核糖核酸酶I，3mg / mL牛血清白蛋白[BSA]级分V;见 材料表）从-20°C解冻，将其置于37°C。
17. 向每个包含大脑的bijou中加入2mL SD抑制剂（每个bijou最多包含四个大脑），再次摇动bijou以使其均匀分散。
    注意:SD抑制剂降低胰蛋白酶活性，以防止不必要的样品消化并保持细胞活力。
18. 在不离心的情况下，从每个bijou中取出2 mL上清液并转移到15 mL离心管中，注意不要转移细胞团块。
19. 通过吸出悬浮液两次，用连接到5mL注射器的19G针头研磨bijou中的剩余细胞。这将产生浓稠的粘液样混合物。
    1. 使用21 G针头再重复两次。如果仍有团块，请用 21 G 针再次研磨。
20. 使用 23 G 针将细胞从 bijou 转移到相同的 15 mL 离心管（来自步骤 2.18）。
21. 在室温（RT）下以200× g 离心5分钟。
22. 使用5 mL血清移液管除去所有上清液，并将其转移到另一个15 mL离心管中，注意不要干扰底部含有所需细胞的松散沉淀。
23. 在室温下再次以200× g 离心上清液5分钟。
    注意:此步骤不是必需的，但是如果需要许多细胞或胚胎很少，则可以执行此步骤以从上清液中回收尽可能多的细胞。
24. 使用10 mL电镀培养基（PM）（49%Dulbecco的改良鹰培养基[DMEM]，1%青霉素/链霉素[Pen/Strep]，25%马血清，25%HBSS与Ca 2+和Mg^{2 +} [HBSS⁺/+];参见材料表），将两个沉淀组合并重悬在一起以产生全细胞悬液。
25. 使用台盼蓝和血细胞计数器或数字细胞计数器计数细胞，并用PM稀释细胞悬液至1.8 x 10⁶ 个细胞/ mL的浓度。

3. 电镀细胞

1. 将所需体积的细胞悬液添加到所需格式，如表1所示:6孔格式每孔 1，000 μL，96孔格式每孔50 μL，或每盖玻片100 μL。
2. 在37°C与5%-7%CO₂孵育2-4小时。使用倒置显微镜检查细胞是否粘附。
3. 取出培养基并加满新的分化培养基（DM+:DM-，包括 10 μg/mL 胰岛素。DM-:DMEM、1% 笔/链球菌、50 nM 氢化可的松、10 ng/mL 生物素、2.5 mL 100x N1 培养基补充剂;见 材料表）。卷详见 表 1。使用无菌移液器吸头按下任何浮动盖玻片。

4. 维护文化

注意:这些培养物需要每周喂食三次，以支持最佳生长和分化。培养物将达到DIV（ 体外天数）实验的最佳健康和成熟度21。细胞可以在培养物中保存长达28天，之后培养物会迅速退化。

1. 每周三次直到DIV12，用新鲜的DM+替换部分上清液，每孔去除500 μL（6孔形式），每孔50 μL（96孔形式）或每皿500 μL包含三个盖玻片，每孔添加600 μL（6孔形式），每孔60 μL（96孔形式）， 或每个盖玻片培养皿 600 μL（表 1）。
2. 从DIV13开始每周三次，用新鲜DM-替换部分上清液，方法是以6孔形式每孔去除500μL，以96孔形式每孔去除50μL，或每张含有三个盖玻片的培养皿500μL，并以6孔形式每孔添加600μL，以96孔形式每孔添加60μL， 或每个盖玻片培养皿 600 μL（表 1）。

结果

显微术
在玻璃盖玻片上生长的培养物非常适合通过显微镜进行分析。为了可视化培养物的发展，将盖玻片固定在从DIV0（一旦细胞附着）到DIV28的多个时间点的4%多聚甲醛（PFA）中。^如前 所述5使用三种不同的染色组合对培养物进行免疫荧光成像染色:NG2（未成熟的少突胶质细胞）和巢蛋白（神经元干/祖细胞）作为发育标志物，SMI31（轴突），MBP（髓磷脂）和NeuN（神?...

讨论

中枢神经系统是一个复杂的网络，从大脑到脊髓，由许多细胞类型组成，主要是神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞¹。由于每个细胞在维持体内平衡和对CNS⁹，¹⁰，¹¹中的挑战产生适当的反应方面都起着重要作用^，因此包含所有这些细胞类型的培养系统是研究大脑如何对刺激做出反应的有用且通用的工?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor