Stabilire colture cellulari miste neuronali e gliali da cervelli di topo embrionali per studiare l'infezione e l'immunità innata

Riepilogo

Questo protocollo presenta un modo unico di generare colture cellulari del sistema nervoso centrale da cervelli di topo embrionali del giorno 17 per la ricerca neuro(immuno)logica. Questo modello può essere analizzato utilizzando varie tecniche sperimentali, tra cui RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria a flusso.

Abstract

I modelli del sistema nervoso centrale (SNC) devono ricapitolare la complessa rete di cellule interconnesse trovate in vivo. Il SNC è costituito principalmente da neuroni, astrociti, oligodendrociti e microglia. A causa dei crescenti sforzi per sostituire e ridurre l'uso di animali, sono stati sviluppati una varietà di sistemi di coltura cellulare in vitro per esplorare le proprietà cellulari innate, che consentono lo sviluppo di terapie per infezioni e patologie del SNC. Mentre alcune domande di ricerca possono essere affrontate da sistemi di coltura cellulare basati sull'uomo, come le cellule staminali pluripotenti (indotte), lavorare con cellule umane ha i suoi limiti per quanto riguarda la disponibilità, i costi e l'etica. Qui, descriviamo un protocollo unico per isolare e coltivare cellule da cervelli di topo embrionali. Le colture di cellule neurali miste risultanti imitano diverse popolazioni cellulari e interazioni trovate nel cervello in vivo. Rispetto agli attuali metodi equivalenti, questo protocollo imita più da vicino le caratteristiche del cervello e raccoglie anche più cellule, consentendo così di studiare più condizioni sperimentali da un topo gravido. Inoltre, il protocollo è relativamente facile e altamente riproducibile. Queste colture sono state ottimizzate per l'uso su varie scale, tra cui schermi ad alta produttività basati su 96 pozzetti, analisi al microscopio a 24 pozzetti e colture a 6 pozzetti per la citometria a flusso e l'analisi della reazione a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa (RT-qPCR). Questo metodo di coltura è un potente strumento per studiare l'infezione e l'immunità nel contesto di alcune delle complessità del SNC con la comodità dei metodi in vitro .

Introduzione

Migliorare la nostra comprensione del sistema nervoso centrale (SNC) è fondamentale per migliorare le opzioni terapeutiche per molte malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative. Il SNC, una complessa rete di cellule interconnesse all'interno del cervello, del midollo spinale e dei nervi ottici, comprende neuroni, oligodendrociti, astrociti e le loro cellule immunitarie innate, la microglia¹. Un approccio in vitro può spesso ridurre drasticamente il numero di topi necessari per eseguire ricerche significative; tuttavia, la natura complessa del SNC rende impossibile ricapitolare la situazione in vivo utilizzando linee cellulari. Le colture miste di cellule neurali forniscono uno strumento di ricerca estremamente prezioso per indagare le questioni neuro(immuno)logiche in un modello pertinente, in linea con i principi di sostituzione, riduzione e raffinamento (3R) ^2,3.

Thomson et al. hanno descritto un metodo di coltura cellulare utilizzando cellule del midollo spinale prenatale che si differenziano in tutti i suddetti principali tipi di cellule del SNC⁴. Questo sistema ha anche formazione di sinapsi, assoni mielinizzati e nodi di Ranvier. Il limite principale di questo metodo di coltura è che, essendo il midollo spinale, non modella utilmente il cervello, e le rese cellulari dal giorno embrionale 13 (E13) del midollo spinale sono costrittive. Pertanto, questo limita il numero di condizioni sperimentali che possono essere studiate. Pertanto, questo studio mirava a sviluppare un nuovo sistema di coltura cellulare che ricapitola le caratteristiche del cervello con una maggiore resa cellulare per ridurre i requisiti per gli animali.

Usando Thomson et al. come punto di partenza, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare derivato esclusivamente dal cervello prenatale del topo. Queste colture hanno le stesse popolazioni cellulari, interconnettività e opzioni di trattamento delle colture del midollo spinale, tranne che c'è meno mielinizzazione in confronto. Tuttavia, avere un modello in vitro sul SNC con una resa cellulare circa tre volte superiore è più efficiente, richiedendo meno topi e meno tempo per elaborare gli embrioni. Abbiamo ottimizzato questo esclusivo sistema di coltura per molteplici applicazioni e bilance a valle, incluso l'utilizzo di vetrini di copertura per l'analisi al microscopio e varie dimensioni di lastre di plastica, comprese le lastre a 96 pozzetti per la ricerca ad alta produttività.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono conformi alle leggi e alle linee guida locali per l'uso degli animali e sono stati approvati dal locale Comitato di revisione etica dell'Università di Glasgow. Gli animali sono stati alloggiati in specifiche condizioni prive di agenti patogeni in conformità con il UK Animals Scientific Procedures Act 1986, sotto gli auspici di una licenza di progetto del Ministero degli Interni del Regno Unito. Per questo studio, sono stati utilizzati topi adulti C57BL / 6J allevati internamente. L'uso di giovani donne (8-12 settimane) è raccomandato a causa del più alto tasso di successo della gravidanza; I maschi possono essere riutilizzati per più cicli di riproduzione. La Figura 1 rappresenta una panoramica schematica del metodo descritto per generare colture miste neuronali e gliali.

1. Preparazione dei materiali di consumo per la coltura tissutale

1. Preparare le piastre e/o le stoviglie contenenti i vetrini di copertura per microscopia all'interno di un armadio di sicurezza di Classe 2. Sterilizzare tutti i reagenti o l'autoclave per garantire la sterilità durante il periodo di coltura.
2. Aggiungere il volume appropriato di BA-PLL (13,2 μg/mL di poli-L-lisinebromidrato [PLL] nel tampone di acido borico [BA] [50 mM di acido borico, 12,5 mM di tetraborato di sodio, pH 8,5]; vedere la tabella dei materiali) a ciascun pozzetto (1.000 μL/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti, 100 μL/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti; i volumi sono riassunti nella Tabella 1). Per i vetrini di copertura per microscopia, aggiungere 20 ml di BA-PLL a un piatto di coltura tissutale di 9 cm di diametro contenente 200 vetrini sterili e ruotare per distribuire uniformemente.
3. Incubare a 37 °C per 1-2 h.
4. Rimuovere la soluzione BA-PLL da ciascun pozzetto o piatto contenente i vetrini di copertura della microscopia e lavare aggiungendo 20 ml di acqua sterile, ruotando i vetrini di copertura e quindi rimuovendo l'acqua. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte. Per un piatto contenente coverslips, lasciare acqua sterile nel piatto di coltura di tessuto al lavaggio finale per rimuovere facilmente i coprifogli.
5. Rimuovere quanto più liquido possibile con una pipetta sterile e lasciare asciugare per almeno 2 ore a tutta la notte.
6. Conservare le piastre rivestite a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
   NOTA: L'acido borico preparato con soluzione di poli-l-lisina (BA-PLL) può essere riutilizzato fino a tre volte, aggiungendo ogni volta nuovo PLL. Conservare il BA-PLL a 4 °C. I piatti sono trattati con BA-PLL, poiché il PLL consente alle cellule di attaccarsi e crescere. Senza questo trattamento, le cellule si solleveranno dopo circa 1 settimana di coltura e non saranno più in grado di differenziarsi.

2. Dissezione del cervello embrionale E17

1. Co-ospitare uno o più topi femmina con un topo maschio. Controlla quotidianamente le femmine per un tappo di muco, indicando che l'accoppiamento ha avuto luogo.
   NOTA: Tutti i topi femmina "collegati" devono essere separati dal maschio per garantire la corretta data di inizio della gestazione. I topi possono essere pesati per confermare la gravidanza o monitorati visivamente.
2. Tagliare il topo gravido a E17 utilizzando metodi appropriati in conformità con le linee guida e le leggi locali sul benessere degli animali, ad esempio, aumentando la concentrazione di anidride carbonica (CO₂), un sovradosaggio di anestetico letale o la lussazione del collo.
   NOTA: Il metodo scelto non deve disturbare gli embrioni. Per questo studio, l'esposizione a una crescente concentrazione di anidride carbonica gassosa seguita dalla conferma della morte recidendo l'arteria femorale è stata utilizzata per abbattere le madri gravide.
3. Posizionare il topo gravido abbattuto sulla schiena su una tavola di dissezione; Mentre non è necessario appuntarlo, potrebbe renderlo più facile per i ricercatori inesperti. Pizzica la linea mediana dell'addome usando una pinza. Usando forbici affilate, tagliare l'addome attraverso la pelle e il peritoneo oltre la linea mediana dai genitali alla gabbia toracica, facendo attenzione a non perforare l'utero.
   1. L'utero del topo ha due corna, ciascuna contenente tipicamente da uno a cinque embrioni. Rimuovere l'utero contenente gli embrioni dalla madre e metterlo immediatamente sul ghiaccio.
4. Tagliare il sacco vitellino sul lato della placenta, facendo attenzione a non danneggiare gli embrioni e rimuovere gli embrioni dal loro sacco vitellino.
5. Decapitare immediatamente gli embrioni. Aggiungere le teste decapitate in un piatto con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) senza calcio (Ca 2+) e magnesio (Mg²⁺) (HBSS-/-) su ghiaccio.
   NOTA: Se è richiesta la genotipizzazione, è possibile rimuovere la coda in questa fase per l'analisi genetica. Quando sono previsti più genotipi, le teste di ciascun embrione devono essere tenute separate per la coltivazione.
6. Usando una pinza angolata, posiziona la testa sul lato rivolto a sinistra.
7. Forare l'occhio con un bordo della pinza, tenendo saldamente il mento con l'altro.
8. Partendo dalla nuca, strappare delicatamente la pelle del cuoio capelluto lungo la linea mediana verso la punta del muso.
9. Entrando attraverso il midollo spinale, evidente come un ovale bianco, usa la pinza angolata per aprire il cranio lungo la linea mediana, esponendo il cervello.
10. Staccare delicatamente il cranio sul lato rivolto verso l'alto, esponendo il cervello.
11. Sollevare il cervello dal cranio, eliminando il cranio una volta che il cervello è stato completamente rimosso.
12. Usando la pinza, rimuovere le meningi, che sono evidenti come una membrana sottile con vasi sanguigni densi.
13. Mettere il cervello in un bijou (vedi Tabella dei materiali) contenente 2 ml di HBSS-/- su ghiaccio.
14. Ripeti i passaggi da 2,6 a 2,13 con i cervelli rimanenti, aggiungendo fino a quattro cervelli per bijou.
15. Aggiungere 250 μL di tripsina 10x al bijou e triturare il cervello scuotendo il bijou. Incubare per 15 min a 37 °C.
    NOTA: Tutti i passaggi da questo punto in avanti devono essere eseguiti in una cappa di coltura di tessuti sterili.
16. Scongelare 2 mL di inibitore della tripsina (SD) della soia (Leibovitz L-15, 0,52 mg/mL di inibitore della tripsina da soia, 40 μg/mL di DNasi I, 3 mg/mL di sieroalbumina bovina [BSA] frazione V; cfr. tabella dei materiali) da -20 °C ponendolo a 37 °C.
17. Aggiungere 2 ml di inibitore SD a ciascun bijou contenente cervelli (per bijou contenente fino a quattro cervelli), agitando nuovamente il bijou per disperderlo uniformemente.
    NOTA: L'inibitore SD diminuisce l'attività della tripsina per prevenire la digestione non necessaria dei campioni e preservare la vitalità cellulare.
18. Senza centrifugazione, rimuovere 2 ml di surnatante da ogni bijou e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 ml, facendo attenzione a non trasferire grumi di cellule.
19. Triturare le cellule rimanenti nel bijou con un ago da 19 G attaccato a una siringa da 5 mL aspirando due volte la sospensione. Questo creerà una miscela densa simile al muco.
    1. Ripetere altre due volte utilizzando un ago da 21 G. Se rimangono grumi, triturare ancora una volta con l'ago 21 G.
20. Trasferire le cellule dal bijou alla stessa provetta da centrifuga da 15 ml (dal punto 2.18) utilizzando un ago da 23 G.
21. Centrifugare a 200 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
22. Rimuovere tutto il surnatante con una pipetta sierologica da 5 mL e trasferirlo in un'altra provetta da centrifuga da 15 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet sciolto sul fondo contenente le cellule necessarie.
23. Centrifugare nuovamente il surnatante a 200 x g a RT per 5 minuti.
    NOTA: Questo passaggio non è essenziale, ma se si richiedono molte cellule o si hanno pochi embrioni, si potrebbe eseguire questo passaggio per recuperare quante più cellule possibili dal surnatante.
24. Utilizzando 10 ml di terreno di placcatura (PM) (49% terreno di aquila modificato di Dulbecco [DMEM], 1% penicillina/streptomicina [Pen/Strep], 25% siero di cavallo, 25% HBSS con Ca 2+ e Mg² + [HBSS⁺ /+]; vedi Tabella dei materiali), combinare e risospendere i due pellet insieme per creare una sospensione di cellule intere.
25. Contare le cellule usando il blu di tripano e un emocitometro o un contatore cellulare digitale e diluire la sospensione cellulare con PM a una concentrazione di 1,8 x 10⁶ cellule / ml.

3. Placcatura delle celle

1. Aggiungere il volume richiesto della sospensione cellulare al formato richiesto come descritto nella Tabella 1: 1.000 μL per pozzetto in formato a 6 pozzetti, 50 μL per pozzetto in formato 96 pozzetti o 100 μL per vetrino.
2. Incubare per 2-4 ore a 37 °C con 5%-7% CO₂. Controllare che le cellule abbiano aderito usando un microscopio invertito.
3. Rimuovere il terreno e rabboccare con nuovi mezzi di differenziazione (DM+: DM- inclusi 10 μg/ml di insulina. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM idrocortisone, 10 ng/mL biotina, 2,5 mL 100x N1 media supplemento; vedi Tabella dei materiali). I volumi sono dettagliati nella tabella 1. Premere verso il basso eventuali vetrini di copertura flottanti utilizzando una punta sterile per pipetta.

4. Mantenere le culture

NOTA: Queste colture richiedono l'alimentazione tre volte alla settimana per supportare una crescita e una differenziazione ottimali. Le colture raggiungeranno la salute e la maturità ottimali per esperimenti su DIV (giorni in vitro) 21. Le cellule possono essere tenute in coltura per un massimo di 28 giorni, dopo di che le colture degenerano rapidamente.

1. Tre volte alla settimana fino a DIV12, sostituire parte del surnatante con DM+ fresco rimuovendo 500 μL per pozzetto in formato a 6 pozzetti, 50 μL per pozzetto in formato a 96 pozzetti o 500 μL per piatto contenente tre vetrini di copertura e aggiungendo 600 μL per pozzetto in formato 6 pozzetti, 60 μL per pozzetto in formato 96 pozzetti, o 600 μL per capsula di copertura (Tabella 1).
2. Tre volte alla settimana dal DIV13 in poi, sostituire parte del surnatante con DM- fresco rimuovendo 500 μL per pozzetto in formato 6 pozzetti, 50 μL per pozzetto in formato 96 pozzetti o 500 μL per piatto contenente tre coprivetrini e aggiungendo 600 μL per pozzetto in formato 6 pozzetti, 60 μL per pozzetto in formato 96 pozzetti, o 600 μL per capsula di copertura (Tabella 1).

Risultati

Microscopia
Le colture coltivate su vetrini sono ideali per essere analizzate al microscopio. Per visualizzare lo sviluppo delle colture, i vetrini di copertura sono stati fissati in paraformaldeide al 4% (PFA) in più punti temporali da DIV0 (una volta che le cellule sono state attaccate) fino a DIV28. Le colture sono state colorate per l'imaging immunofluorescenza come precedentemente descritto⁵ utilizzando tre diverse combinazioni di colorazione: NG2 (oligodendrociti immatur...

Discussione

Il SNC è una rete complessa che si estende dal cervello fino al midollo spinale e consiste di molti tipi di cellule, prevalentemente neuroni, oligodendrociti, astrociti e microglia¹. Poiché ogni cellula ha un ruolo importante nel mantenere l'omeostasi e generare risposte appropriate alle sfide nel SNC 9,10,11^, un sistema di coltura che contiene tutti questi tipi di cellule è uno strumento utile e versatile per studiare come ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor