감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

요약

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

초록

중추신경계(CNS)의 모델은 생체 내에서 발견되는 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크를 요약해야 합니다.중추신경계는 주로 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포로 구성됩니다. 동물 사용을 대체하고 줄이기 위한 노력이 증가함에 따라 선천성 세포 특성을 탐색하기 위해 다양한 시험관 내 세포 배양 시스템이 개발되어 CNS 감염 및 병리에 대한 치료제를 개발할 수 있습니다. 특정 연구 질문은 (유도된) 만능 줄기 세포와 같은 인간 기반 세포 배양 시스템으로 해결할 수 있지만 인간 세포로 작업하는 것은 가용성, 비용 및 윤리와 관련하여 고유한 한계가 있습니다. 여기에서는 배아 마우스 뇌에서 세포를 분리하고 배양하기 위한 고유한 프로토콜을 설명합니다. 그 결과 혼합 신경 세포 배양은 생체 내 뇌에서 발견되는 여러 세포 집단과 상호 작용을 모방합니다. 현재의 동등한 방법과 비교할 때, 이 프로토콜은 뇌의 특성을 더 밀접하게 모방하고 더 많은 세포를 확보하므로 임신한 마우스 한 마리에서 더 많은 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 비교적 쉽고 재현성이 높습니다. 이러한 배양은 96웰 기반 고처리량 스크리닝, 24웰 현미경 분석, 유세포 분석 및 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석을 위한 6웰 배양을 포함하여 다양한 규모로 사용하도록 최적화되었습니다. 이 배양 방법은 시험관 내 방법의 편리함과 함께 CNS의 일부 복잡성의 맥락에서 감염 및 면역을 조사하는 강력한 도구입니다.

서문

중추신경계(CNS)에 대한 이해를 높이는 것은 많은 신경염증 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료 옵션을 개선하는 데 중요합니다. 뇌, 척수, 시신경 내에서 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크인 CNS는 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 이들의 선천성 면역 세포인 미세아교세포로 구성됩니다¹. 체외 접근법은 종종 의미있는 연구를 수행하는 데 필요한 마우스의 수를 크게 줄일 수 있습니다. 그러나 CNS의 복잡한 특성으로 인해 세포주를 사용하여 생체 내 상황을 요약하는 것은 불가능합니다. 혼합 신경 세포 배양은 3Rs(Replacement, Reduction and Refinement) 원칙 ^2,3에 따라 관련 모델에서 신경(면역학) 문제를 조사하는 데 매우 유용한 연구 도구를 제공합니다.

Thomson et al.은 앞서 언급한 모든 주요 CNS 세포 유형으로 분화하는 태아기 척수 세포를 이용한 세포 배양 방법을 설명했다⁴. 이 시스템은 또한 시냅스 형성, 수초 축삭 및 Ranvier의 노드를 가지고 있습니다. 이 배양 방법의 주요 한계는 척수이기 때문에 뇌를 유용하게 모델링하지 못하고 배아 13일(E13) 척수로부터의 세포 수율이 수축한다는 것입니다. 따라서 조사할 수 있는 실험 조건의 수가 제한됩니다. 따라서 본 연구는 동물에 대한 요구량을 줄이기 위해 세포 수율이 증가한 뇌의 특성을 재현하는 새로운 세포 배양 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다.

Thomson et al. 출발점으로 우리는 순전히 태아기 쥐의 뇌에서 파생된 세포 배양 모델을 개발했습니다. 이러한 배양은 척수 배양과 동일한 세포 집단, 상호 연결성 및 치료 옵션을 가지고 있지만 비교에 의한 수초화가 적습니다. 그러나 세포 수율이 약 3배 더 높은 CNS in vitro 모델을 갖는 것이 더 효율적이며, 더 적은 수의 마우스와 더 적은 배아 처리 시간을 필요로 합니다. 당사는 현미경 분석을 위한 유리 커버슬립과 고처리량 연구를 위한 96웰 플레이트를 포함한 다양한 크기의 플라스틱 웰 플레이트를 사용하는 등 여러 다운스트림 응용 분야 및 스케일에 맞게 이 고유한 배양 시스템을 최적화했습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 동물 사용에 대한 현지 법률 및 지침을 준수했으며 글래스고 대학의 지역 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 영국 내무부 프로젝트 라이센스의 후원하에 1986년 영국 동물 과학 절차법에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되었습니다. 이 연구에서는 사내에서 사육된 성인 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 젊은 여성 (8-12 주)의 사용은 임신 성공률이 높기 때문에 권장됩니다. 수컷은 여러 차례의 번식에 재사용 할 수 있습니다. 그림 1 은 혼합된 뉴런 및 신경교 배양을 생성하는 설명된 방법의 개략도를 나타냅니다.

1. 조직 배양 소모품의 제조

1. Class 2 안전 캐비닛 내부에 현미경 커버슬립이 들어 있는 접시 및/또는 접시를 준비합니다. 배양 기간 동안 무균 상태를 보장하기 위해 모든 시약 또는 오토클레이브를 멸균하십시오.
2. 적절한 부피의 BA-PLL(붕산 완충액[BA][50mM 붕산, 12.5mM 사붕산나트륨, pH 8.5] 중 13.2μg/mL 폴리-L-라이신하이드로브로마이드[PLL])을 각 웰(6웰 플레이트에서 1,000μL/웰, 96웰 플레이트에서 100μL/웰, 부피는 표 1에 요약됨)에 추가합니다. 현미경 커버슬립의 경우 200개의 멸균 커버슬립이 들어 있는 직경 9cm의 조직 배양 접시에 20mL의 BA-PLL을 넣고 소용돌이쳐 고르게 분포시킵니다.
3. 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
4. 현미경 커버슬립이 들어 있는 각 웰 또는 접시에서 BA-PLL 용액을 제거하고 멸균수 20mL를 추가하고 커버슬립을 휘젓고 물을 제거하여 세척합니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하십시오. 커버슬립이 포함된 접시의 경우 최종 세척 시 조직 배양 접시에 멸균수를 남겨두어 커버슬립을 쉽게 제거할 수 있습니다.
5. 멸균 피펫으로 가능한 한 많은 액체를 제거하고 최소 2시간에서 하룻밤 동안 건조시키십시오.
6. 코팅된 플레이트를 4°C에서 최대 2개월 동안 보관합니다.
   참고: 폴리-l-라이신(BA-PLL) 용액으로 준비된 붕산은 매번 새로운 PLL을 추가하여 최대 3회까지 재사용할 수 있습니다. BA-PLL을 4°C에서 보관하십시오. PLL은 세포가 달라붙어 성장할 수 있도록 하기 때문에 접시는 BA-PLL로 처리됩니다. 이 처리가 없으면 약 1주일의 배양 후에 세포가 들어 올려져 더 이상 분화할 수 없습니다.

2. E17 배아 뇌의 해부

1. 한 마리 또는 여러 마리의 암컷 마우스와 수컷 마우스를 함께 수용합니다. 암컷에게 매일 점액 마개가 있는지 확인하여 짝짓기가 이루어 졌음을 나타냅니다.
   참고: 모든 "연결된" 암컷 마우스는 정확한 임신 시작 날짜를 보장하기 위해 수컷과 분리되어야 합니다. 임신을 확인하기 위해 마우스의 무게를 측정하거나 육안으로 모니터링 할 수 있습니다.
2. 예를 들어 이산화탄소(CO₂) 농도 상승, 치명적인 마취 과다 복용 또는 목 탈구와 같은 지역 동물 복지 지침 및 법률에 따라 적절한 방법을 사용하여 E17에서 임신한 마우스를 도태합니다.
   참고: 선택한 방법은 배아를 방해해서는 안 됩니다. 이 연구에서는 이산화탄소 가스 농도 상승에 노출된 후 대퇴 동맥을 절단하여 사망을 확인하는 방법을 사용하여 임신한 댐을 도태했습니다.
3. 도태된 임신한 마우스를 해부 보드에 등에 올려 놓습니다. 고정할 필요는 없지만 경험이 없는 연구원이 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 집게를 사용하여 복부의 정중선을 꼬집습니다. 날카로운 가위를 사용하여 자궁에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하면서 생식기에서 흉곽까지 정중선을 통해 피부와 복막을 통해 복부를 잘라냅니다.
   1. 쥐의 자궁에는 두 개의 뿔이 있으며, 각 뿔에는 일반적으로 1-5개의 배아가 들어 있습니다. 어머니에게서 배아가 들어있는 자궁을 제거하고 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오.
4. 태반 측면의 난황 자루를 자르고 배아가 손상되지 않도록 주의하고 난황 자루에서 배아를 제거합니다.
5. 즉시 배아를 참수하십시오. 목이 잘린 머리를 얼음 위에 칼슘(Ca 2+)과 마그네슘(Mg²⁺)(HBSS-/-)이 없는 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)과 함께 접시에 넣습니다.
   참고: 유전자형 분석이 필요한 경우 유전자 분석을 위해 이 단계에서 꼬리를 제거할 수 있습니다. 여러 유전자형이 예상되는 경우 각 배아의 머리를 별도로 보관하여 배양해야 합니다.
6. 각진 집게를 사용하여 머리를 왼쪽을 향하도록 옆으로 눕힙니다.
7. 집게의 한쪽 가장자리로 눈을 뚫고 다른 쪽 턱을 단단히 잡습니다.
8. 목덜미에서 시작하여 끝을 향해 정중선을 따라 두피의 피부를 부드럽게 찢습니다.
9. 흰색 타원형으로 눈에 띄는 척수를 통해 들어가면 각진 집게를 사용하여 정중선을 따라 두개골을 부수고 뇌를 노출시킵니다.
10. 두개골을 위쪽을 향한 쪽에서 부드럽게 떼어내어 뇌를 노출시킵니다.
11. 두개골에서 뇌를 들어 올려 뇌가 완전히 제거되면 두개골을 처리합니다.
12. 집게를 사용하여 조밀 한 혈관을 가진 얇은 막으로 눈에 띄는 수막을 제거하십시오.
13. 얼음 위에 2mL의 HBSS-/-가 들어 있는 비쥬( 재료 표 참조)에 뇌를 넣습니다.
14. 나머지 브레인에 대해 2.6-2.13단계를 반복하여 비쥬당 최대 4개의 브레인을 추가합니다.
15. 비쥬에 250 μL의 10x 트립신을 넣고 비쥬를 흔들어 뇌를 분쇄합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
    알림: 이 시점부터 모든 단계는 멸균 조직 배양 후드에서 수행해야 합니다.
16. 2mL의 대두 트립신(SD) 억제제(Leibovitz L-15, 대두에서 0.52mg/mL 트립신 억제제, 40μg/mL DNase I, 3mg/mL 소 혈청 알부민[BSA] 분획 V, 표 참조)를 37°C에 두어 -20°C에서 해동합니다.
17. 뇌가 포함된 각 비쥬(최대 4개의 브레인을 포함하는 비쥬당)에 SD 억제제 2mL를 넣고 비쥬를 다시 흔들어 고르게 분산시킵니다.
    참고: SD 억제제는 트립신 활성을 감소시켜 샘플의 불필요한 소화를 방지하고 세포 생존율을 보존합니다.
18. 원심분리하지 않고 각 비석에서 상층액 2mL를 제거하고 세포 덩어리가 옮겨지지 않도록 주의하면서 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
19. 현탁액을 두 번 흡인하여 5mL 주사기에 부착된 19G 바늘로 비석에 남아 있는 세포를 분쇄합니다. 이것은 두꺼운 점액과 같은 혼합물을 생성합니다.
    1. 21G 바늘을 사용하여 두 번 더 반복하십시오. 덩어리가 남아 있으면 21G 바늘로 한 번 더 분쇄합니다.
20. 23G 바늘을 사용하여 비쥬에서 동일한 15mL 원심분리 튜브(단계 2.18부터)로 세포를 옮깁니다.
21. 실온(RT)에서 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
22. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 모든 상층액을 제거하고 필요한 세포가 들어 있는 바닥의 느슨한 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 다른 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
23. 상층액을 RT에서 200 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
    참고: 이 단계는 필수는 아니지만 많은 세포가 필요하거나 배아가 적은 경우 이 단계를 수행하여 상청액에서 가능한 한 많은 세포를 복구할 수 있습니다.
24. 10mL의 도금 배지(PM)(49% Dulbecco's modified eagle medium[DMEM], 1% 페니실린/스트렙토마이신[Pen/Strep], 25% 말 혈청, 25% HBSS with Ca 2+ 및 Mg² +[HBSS⁺ /+]; 재료 표 참조), 두 펠릿을 함께 결합하고 재현탁하여 전체 세포 현탁액을 만듭니다.
25. 트립판 블루와 혈구계 또는 디지털 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세고 PM으로 세포 현탁액을 1.8 x 10⁶ cells/mL의 농도로 희석합니다.

3. 셀 도금

1. 표 1에 자세히 설명된 대로 필요한 부피의 세포 현탁액을 필요한 형식에 추가합니다: 6웰 형식의 경우 웰당 1,000μL, 96웰 형식의 경우 웰당 50μL 또는 커버슬립당 100μL.
2. 37°C에서 5%-7%_CO2로 2-4시간 동안 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 세포가 부착되었는지 확인하십시오.
3. 배지를 제거하고 새로운 분화 배지(DM+: 10μg/mL 인슐린을 포함한 DM-)로 보충합니다. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50nM 하이드로코르티손, 10ng/mL 비오틴, 2.5mL 100x N1 배지 보충제; 재료 표 참조). 볼륨은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 떠 있는 커버슬립을 누릅니다.

4. 문화 유지

참고: 이러한 배양은 최적의 성장과 분화를 지원하기 위해 매주 세 번 먹이를 주어야 합니다. 배양은 DIV (days in vitro) 실험을 위한 최적의 건강 및 성숙도에 도달할 것이다 21. 세포는 최대 28 일 동안 배양 할 수 있으며, 그 후에 배양 물은 빠르게 퇴화됩니다.

1. DIV12까지 주 3회, 6웰 형식의 경우 웰당 500μL, 96웰 형식의 경우 웰당 50μL 또는 3개의 커버슬립이 포함된 접시당 500μL를 제거하고 6웰 형식의 경우 웰당 600μL, 96웰 형식의 경우 웰당 60μL를 추가하여 상층액의 일부를 신선한 DM+로 교체하고, 또는 커버슬립 접시당 600μL(표 1).
2. DIV13부터 주당 3회, 6-웰 형식에서 웰당 500 μL, 96-웰 형식에서 웰당 50 μL, 또는 3개의 커버슬립을 포함하는 디쉬당 500 μL를 제거하고, 6-웰 형식에서 웰당 600 μL, 96-웰 형식에서 웰당 60 μL을 추가하여, 상청액의 일부를 신선한 DM-으로 교체하고, 또는 커버슬립 접시당 600μL(표 1).

결과

현미경 검사 법
유리 커버슬립에서 자란 배양액은 현미경으로 분석하는 데 이상적입니다. 배양의 발달을 시각화하기 위해 커버슬립을 DIV0(세포가 부착된 후)부터 DIV28까지 여러 시점에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정했습니다. 배양물은 앞서 설명한⁵ 와 같이 신경교 마커로서 NG2(미성숙 희소돌기아교세포) 및 네스틴(신경줄기/전구 세포), 신경 표지자로서 SMI31(?...

토론

중추신경계는 뇌에서 척수까지 이어지는 복잡한 네트워크로, 주로 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포, 미세아교세포 등 다양한 세포 유형으로 구성되어 있다¹. 각 세포는 항상성을 유지하고 CNS ^9,10,11의 문제에 대한 적절한 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 모든 세포 유형을 포함하는 배양 시스템은 뇌?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor