Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Modelle des Zentralnervensystems (ZNS) müssen das komplexe Netzwerk miteinander verbundener Zellen rekapitulieren, das in vivo zu finden ist.Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia. Aufgrund der zunehmenden Bemühungen, den Einsatz von Tieren zu ersetzen und zu reduzieren, wurde eine Vielzahl von In-vitro-Zellkultursystemen entwickelt, um die Eigenschaften angeborener Zellen zu erforschen, die die Entwicklung von Therapeutika für ZNS-Infektionen und -Pathologien ermöglichen. Während bestimmte Forschungsfragen mit humanen Zellkultursystemen beantwortet werden können, wie z. B. (induzierte) pluripotente Stammzellen, hat die Arbeit mit menschlichen Zellen ihre eigenen Grenzen in Bezug auf Verfügbarkeit, Kosten und Ethik. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus embryonalen Mäusegehirnen. Die daraus resultierenden gemischten neuronalen Zellkulturen ahmen mehrere Zellpopulationen und Interaktionen nach, die im Gehirn in vivo zu finden sind. Im Vergleich zu aktuellen äquivalenten Methoden ahmt dieses Protokoll die Eigenschaften des Gehirns genauer nach und sammelt auch mehr Zellen, so dass mehr experimentelle Bedingungen an einer trächtigen Maus untersucht werden können. Darüber hinaus ist das Protokoll relativ einfach und sehr gut reproduzierbar. Diese Kulturen wurden für den Einsatz in verschiedenen Maßstäben optimiert, darunter 96-Well-basierte Hochdurchsatz-Screens, 24-Well-Mikroskopieanalysen und 6-Well-Kulturen für die Durchflusszytometrie und die Analyse der reversen Transkriptions-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Diese Kulturmethode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Infektionen und Immunität im Zusammenhang mit einem Teil der Komplexität des ZNS mit der Bequemlichkeit von In-vitro-Methoden zu untersuchen.

Einleitung

Die Verbesserung unseres Verständnisses des zentralen Nervensystems (ZNS) ist entscheidend, um die therapeutischen Optionen für viele neuroinflammatorische und neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern. Das ZNS, ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Zellen im Gehirn, Rückenmark und Sehnerven, besteht aus Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und ihren angeborenen Immunzellen, den Mikroglia¹. Ein In-vitro-Ansatz kann die Anzahl der Mäuse, die für sinnvolle Forschung erforderlich sind, oft drastisch reduzieren. Die Komplexität des ZNS macht es jedoch unmöglich, die In-vivo-Situation mit Hilfe von Zelllinien zu rekapitulieren. Gemischte neuronale Zellkulturen stellen ein äußerst wertvolles Forschungswerkzeug dar, um neuro(immun)ologische Fragestellungen in einem relevanten Modell zu untersuchen, in Übereinstimmung mit den Prinzipien von Replacement, Reduction and Refinement (3R) ^2,3.

Thomson et al. beschrieben eine Zellkulturmethode mit pränatalen Rückenmarkszellen, die sich in alle oben genannten Hauptzelltypen des ZNS differenzieren⁴. In diesem System gibt es auch Synapsenbildung, myelinisierte Axone und Ranvier-Knoten. Die Haupteinschränkung dieser Kultivierungsmethode besteht darin, dass das Rückenmark das Gehirn nicht sinnvoll modelliert und die Zellerträge ab dem 13. Embryotag (E13) das Rückenmark verengt. Dies schränkt die Anzahl der experimentellen Bedingungen ein, die untersucht werden können. Daher zielte diese Studie darauf ab, ein neues Zellkultursystem zu entwickeln, das die Eigenschaften des Gehirns mit erhöhter Zellausbeute rekapituliert, um die Anforderungen für Tiere zu reduzieren.

Ausgehend von Thomson et al. entwickelten wir ein Zellkulturmodell, das ausschließlich aus pränatalen Mäusegehirnen stammt. Diese Kulturen haben die gleichen Zellpopulationen, die gleiche Interkonnektivität und die gleichen Behandlungsmöglichkeiten wie die Rückenmarkskulturen, nur dass es im Vergleich weniger Myelinisierung gibt. Ein ZNS-In-vitro-Modell mit einer etwa dreimal höheren Zellausbeute ist jedoch effizienter, da weniger Mäuse und weniger Zeit für die Verarbeitung von Embryonen benötigt werden. Wir haben dieses einzigartige Kultursystem für mehrere nachgelagerte Anwendungen und Maßstäbe optimiert, einschließlich der Verwendung von Glasdeckgläsern für die Mikroskopieanalyse und verschiedener Größen von Kunststoff-Well-Platten, einschließlich 96-Well-Platten für die Hochdurchsatzforschung.

Protokoll

Alle Tierversuche entsprachen den lokalen Gesetzen und Richtlinien für die Verwendung von Tieren und wurden von der örtlichen Ethikkommission an der Universität Glasgow genehmigt. Die Tiere wurden unter bestimmten krankheitserregerfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit dem UK Animals Scientific Procedures Act 1986 unter der Schirmherrschaft einer Projektlizenz des britischen Innenministeriums untergebracht. Für diese Studie wurden selbst gezüchtete erwachsene C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Verwendung von jungen Weibchen (8-12 Wochen) wird aufgrund der höheren Erfolgsrate der Schwangerschaft empfohlen. Männchen können für mehrere Zuchtrunden wiederverwendet werden. Figur 1 stellt einen schematischen Überblick über das beschriebene Verfahren zur Erzeugung von gemischten neuronalen und glialen Kulturen dar.

1. Vorbereitung der Gewebekultur-Verbrauchsmaterialien

1. Bereiten Sie die Platten und/oder Schalen mit Mikroskopie-Deckgläsern in einer Sicherheitswerkbank der Klasse 2 vor. Sterilisieren Sie alle Reagenzien oder Autoklaven, um die Sterilität während der Kulturperiode zu gewährleisten.
2. Fügen Sie jedem Well das entsprechende Volumen BA-PLL (13,2 μg/ml Poly-L-Lysinhydrobromid [PLL] in Borsäurepuffer [BA] [50 mM Borsäure, 12,5 mM Natriumtetraborat, pH 8,5]; siehe Materialtabelle) hinzu (1.000 μl/Well in einer 6-Well-Platte, 100 μl/Well in einer 96-Well-Platte; Volumina sind in Tabelle 1 zusammengefasst). Geben Sie bei Deckgläsern für die Mikroskopie 20 ml BA-PLL in eine Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 9 cm, die 200 sterile Deckgläser enthält, und schwenken Sie sie, um sie gleichmäßig zu verteilen.
3. Bei 37 °C 1-2 h inkubieren.
4. Entfernen Sie die BA-PLL-Lösung aus jeder Vertiefung oder Schale, die Deckgläser für die Mikroskopie enthält, und waschen Sie sie, indem Sie 20 ml steriles Wasser hinzufügen, die Deckgläser schwenken und dann das Wasser entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Bei einer Schale mit Deckgläsern lassen Sie bei der letzten Wäsche steriles Wasser in der Gewebekulturschale, um die Deckgläser leicht zu entfernen.
5. Mit einer sterilen Pipette so viel Flüssigkeit wie möglich entfernen und mindestens 2 h bis über Nacht trocknen lassen.
6. Lagern Sie die beschichteten Platten bis zu 2 Monate bei 4 °C.
   HINWEIS: Die hergestellte Borsäure mit Poly-L-Lysin (BA-PLL)-Lösung kann bis zu dreimal wiederverwendet werden, wobei jedes Mal neue PLL hinzugefügt wird. Lagern Sie die BA-PLL bei 4 °C. Das Geschirr wird mit BA-PLL behandelt, da die PLL es den Zellen ermöglicht, sich festzukleben und zu wachsen. Ohne diese Behandlung heben sich die Zellen nach ca. 1 Woche Kultur und können sich nicht mehr differenzieren.

2. Sektion von E17-Embryonalgehirnen

1. Halte eine oder mehrere weibliche Mäuse zusammen mit einer männlichen Maus. Untersuchen Sie die Weibchen täglich auf einen Schleimpfropf, der anzeigt, dass die Paarung stattgefunden hat.
   HINWEIS: Alle "gestopften" weiblichen Mäuse müssen von den männlichen getrennt werden, um das korrekte Startdatum der Trächtigkeit zu gewährleisten. Mäuse können gewogen werden, um die Trächtigkeit zu bestätigen, oder visuell überwacht werden.
2. Keulen Sie die trächtige Maus bei E17 mit geeigneten Methoden in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzrichtlinien und -gesetzen, z. B. durch Erhöhung der Kohlendioxidkonzentration (CO₂), eine tödliche Überdosierung von Betäubungsmitteln oder eine Luxation des Halses.
   HINWEIS: Die gewählte Methode darf die Embryonen nicht stören. Für diese Studie wurde die Exposition gegenüber einer steigenden Konzentration von Kohlendioxidgas und der anschließenden Bestätigung des Todes durch Durchtrennung der Oberschenkelarterie verwendet, um trächtige Muttertiere zu keulen.
3. Legen Sie die aussortierte, trächtige Maus auf den Rücken auf ein Sezierbrett. Es ist zwar nicht erforderlich, es festzunageln, aber es könnte es für unerfahrene Forscher einfacher machen. Drücken Sie die Mittellinie des Bauches mit einer Pinzette zusammen. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere den Bauch durch die Haut und das Bauchfell über der Mittellinie von den Genitalien bis zum Brustkorb auf, wobei Sie darauf achten, die Gebärmutter nicht zu punktieren.
   1. Die Gebärmutter der Maus hat zwei Hörner, die in der Regel jeweils ein bis fünf Embryonen enthalten. Entfernen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen von der Mutter und legen Sie sie sofort auf Eis.
4. Schneiden Sie den Dottersack an der Seite der Plazenta durch, achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu beschädigen, und nehmen Sie die Embryonen aus ihrem Dottersack.
5. Enthaupten Sie die Embryonen sofort. Die enthaupteten Köpfe in eine Schüssel mit Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) ohne Calcium (Ca 2+) und Magnesium (Mg²⁺) (HBSS-/-) auf Eis geben.
   HINWEIS: Wenn eine Genotypisierung erforderlich ist, kann der Schwanz in diesem Stadium für die genetische Analyse entfernt werden. Wenn mehrere Genotypen zu erwarten sind, sollten die Köpfe jedes Embryos für die Kultivierung separat aufbewahrt werden.
6. Positionieren Sie den Kopf mit einer abgewinkelten Pinzette auf der Seite nach links.
7. Durchstechen Sie das Auge mit einer Kante der Pinzette und halten Sie mit der anderen das Kinn fest.
8. Beginnen Sie im Nacken und reißen Sie die Haut der Kopfhaut sanft entlang der Mittellinie in Richtung Schnauzenspitze.
9. Durch das Rückenmark eintretend, das als weißes Oval erkennbar ist, wird der Schädel mit der abgewinkelten Pinzette entlang der Mittellinie aufgebrochen und das Gehirn freigelegt.
10. Ziehe den Schädel vorsichtig auf der Seite nach oben ab und lege das Gehirn frei.
11. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und entsorgen Sie den Schädel, sobald das Gehirn vollständig entfernt wurde.
12. Entfernen Sie mit der Pinzette die Hirnhäute, die sich als dünne Membran mit dichten Blutgefäßen bemerkbar machen.
13. Legen Sie die Gehirne in ein Bijou (siehe Materialtabelle) mit 2 ml HBSS-/- auf Eis.
14. Wiederholen Sie die Schritte 2.6 bis 2.13 mit den restlichen Gehirnen, sodass Sie bis zu vier Gehirne pro Bijou addieren.
15. Geben Sie 250 μl 10-faches Trypsin in das Bijou und verreiben Sie das Gehirn durch Schütteln des Bijous. 15 min bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Alle Schritte ab diesem Zeitpunkt sollten in einer sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt werden.
16. 2 ml Sojabohnen-Trypsin (SD)-Inhibitor (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen, 40 μg/ml DNase I, 3 mg/ml Rinderserumalbumin [BSA] Fraktion V; siehe Materialtabelle) von -20 °C bei 37 °C auftauen.
17. Fügen Sie 2 ml SD-Hemmer zu jedem Bijou hinzu, das Gehirne enthält (pro Bijou mit bis zu vier Gehirnen), und schütteln Sie das Bijou erneut, um es gleichmäßig zu verteilen.
    HINWEIS: SD-Inhibitor verringert die Trypsinaktivität, um eine unnötige Verdauung der Proben zu verhindern und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
18. Entfernen Sie ohne Zentrifugation 2 ml des Überstands aus jedem Bijou und füllen Sie es in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei Sie darauf achten sollten, dass keine Zellklumpen übertragen werden.
19. Verreiben Sie die verbleibenden Zellen im Bijou mit einer 19-G-Nadel, die an einer 5-ml-Spritze befestigt ist, indem Sie die Suspension zweimal absaugen. Dadurch entsteht eine dicke, schleimartige Mischung.
    1. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal mit einer 21-G-Nadel. Wenn noch Klumpen vorhanden sind, reiben Sie noch einmal mit der 21 G-Nadel.
20. Übertragen Sie die Zellen mit einer 23-g-Nadel aus dem Bijou in dasselbe 15-ml-Zentrifugenröhrchen (ab Schritt 2.18).
21. Bei 200 x g bei Raumtemperatur (RT) 5 min zentrifugieren.
22. Entfernen Sie den gesamten Überstand mit einer serologischen 5-ml-Pipette und überführen Sie ihn in ein weiteres 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass das lose Pellet am Boden, das die erforderlichen Zellen enthält, nicht gestört wird.
23. Den Überstand erneut bei 200 x g RT für 5 min zentrifugieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht unbedingt erforderlich, aber wenn man viele Zellen benötigt oder nur wenige Embryonen hat, kann man diesen Schritt durchführen, um so viele Zellen wie möglich aus dem Überstand zu gewinnen.
24. Unter Verwendung von 10 ml Beschichtungsmedien (PM) (49 % Dulbeccos modifiziertes Adlermedium [DMEM], 1 % Penicillin/Streptomycin [Pen/Streptokokken], 25 % Pferdeserum, 25 % HBSS mit Ca 2+ und Mg² + [HBSS⁺ /+]; siehe Materialtabelle) werden die beiden Pellets kombiniert und resuspendiert, um eine Ganzzellsuspension zu erzeugen.
25. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und entweder einem Hämozytometer oder einem digitalen Zellzähler und verdünnen Sie die Zellsuspension mit PM auf eine Konzentration von 1,8 x 10⁶ Zellen/ml.

3. Plattierung der Zellen

1. Fügen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension dem erforderlichen Format hinzu, wie in Tabelle 1 beschrieben: 1.000 μl pro Well im 6-Well-Format, 50 μl pro Well im 96-Well-Format oder 100 μl pro Deckglas.
2. 2-4 h bei 37 °C mit 5%-7% CO₂ inkubieren. Überprüfen Sie, ob die Zellen mit einem inversen Mikroskop haften.
3. Entfernen Sie das Medium und füllen Sie es mit neuen Differenzierungsmedien (DM+: TM- einschließlich 10 μg/ml Insulin auf. DM-: DMEM, 1% Pen/Streptokokken, 50 nM Hydrocortison, 10 ng/ml Biotin, 2,5 ml 100x N1 Medienergänzung; siehe Materialtabelle). Die Volumina sind in Tabelle 1 aufgeführt. Drücken Sie alle schwimmenden Deckgläser mit einer sterilen Pipettenspitze nach unten.

4. Pflege der Kulturen

HINWEIS: Diese Kulturen müssen dreimal wöchentlich gefüttert werden, um ein optimales Wachstum und eine optimale Differenzierung zu unterstützen. Die Kulturen erreichen eine optimale Gesundheit und Reife für Experimente an DIV (Tage in vitro) 21. Die Zellen können bis zu 28 Tage in Kultur aufbewahrt werden, danach degenerieren die Kulturen schnell.

1. Ersetzen Sie dreimal pro Woche bis DIV12 einen Teil des Überstandes durch frisches DM+, indem Sie 500 μl pro Well im 6-Well-Format, 50 μl pro Well im 96-Well-Format oder 500 μl pro Schale mit drei Deckgläsern entfernen und 600 μl pro Well im 6-Well-Format, 60 μl pro Well im 96-Well-Format hinzufügen. oder 600 μl pro Deckglasschale (Tabelle 1).
2. Ersetzen Sie ab DIV13 dreimal pro Woche einen Teil des Überstandes durch frisches DM-, indem Sie 500 μl pro Well im 6-Well-Format, 50 μl pro Well im 96-Well-Format oder 500 μl pro Schale mit drei Deckgläsern entfernen und 600 μl pro Well im 6-Well-Format, 60 μl pro Well im 96-Well-Format hinzufügen. oder 600 μl pro Deckglasschale (Tabelle 1).

Ergebnisse

Mikroskopie
Kulturen, die auf Glasdeckgläsern gezüchtet wurden, eignen sich ideal für die mikroskopische Analyse. Um die Entwicklung der Kulturen zu visualisieren, wurden die Deckgläser zu mehreren Zeitpunkten von DIV0 (nach dem Anhängen der Zellen) bis DIV28 in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Die Kulturen wurden für die Immunfluoreszenzbildgebung wie zuvor beschrieben⁵ mit drei verschiedenen Färbekombinationen gefärbt: NG2 (unreife Oligodendrozyten) und Nestin (neuro...

Diskussion

Das ZNS ist ein komplexes Netzwerk, das sich vom Gehirn bis zum Rückenmark erstreckt und aus vielen Zelltypen besteht, vor allem Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia¹. Da jede Zelle eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Erzeugung angemessener Reaktionen auf Herausforderungen im ZNS^{spielt 9,10,11}, ist ein Kultursystem, das all diese Zelltypen enthält, ein nützliches und vielseitiges Werkzeug, um zu untersuchen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor