Создание смешанных культур нейрональных и глиальных клеток из эмбрионального мозга мыши для изучения инфекции и врожденного иммунитета

Резюме

Этот протокол представляет собой уникальный способ создания культур клеток центральной нервной системы из эмбрионального мозга мыши на 17-й день для нейро(иммуно)логических исследований. Эта модель может быть проанализирована с использованием различных экспериментальных методов, включая ОТ-кПЦР, микроскопию, ИФА и проточную цитометрию.

Аннотация

Модели центральной нервной системы (ЦНС) должны повторять сложную сеть взаимосвязанных клеток, обнаруженных in vivo. ЦНС состоит в основном из нейронов, астроцитов, олигодендроцитов и микроглии. В связи с растущими усилиями по замене и сокращению использования животных были разработаны различные системы культивирования клеток in vitro для изучения свойств врожденных клеток, которые позволяют разрабатывать терапевтические средства для инфекций и патологий ЦНС. В то время как некоторые исследовательские вопросы могут быть решены с помощью систем культивирования клеток человека, таких как (индуцированные) плюрипотентные стволовые клетки, работа с клетками человека имеет свои собственные ограничения в отношении доступности, затрат и этики. Здесь мы описываем уникальный протокол выделения и культивирования клеток из эмбрионального мозга мыши. Полученные смешанные культуры нервных клеток имитируют несколько клеточных популяций и взаимодействий, обнаруженных в мозге in vivo. По сравнению с текущими эквивалентными методами, этот протокол более точно имитирует характеристики мозга, а также собирает больше клеток, что позволяет исследовать больше экспериментальных условий на одной беременной мыши. Кроме того, протокол относительно прост и легко воспроизводим. Эти культуры были оптимизированы для использования в различных масштабах, включая высокопроизводительные экраны на 96 лунок, 24-луночный микроскопический анализ и 6-луночные культуры для проточной цитометрии и количественного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР). Этот метод культивирования является мощным инструментом для исследования инфекции и иммунитета в контексте некоторой сложности ЦНС с удобством методов in vitro .

Введение

Улучшение нашего понимания центральной нервной системы (ЦНС) имеет решающее значение для улучшения терапевтических возможностей для многих нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний. ЦНС, сложная сеть взаимосвязанных клеток в головном, спинном мозге и зрительных нервах, включает нейроны, олигодендроциты, астроциты и их врожденные иммунные клетки, микроглию¹. Подход in vitro часто может резко сократить количество мышей, необходимых для проведения значимых исследований; однако сложная природа ЦНС делает невозможным повторение ситуации in vivo с использованием клеточных линий. Смешанные культуры нервных клеток представляют собой чрезвычайно ценный исследовательский инструмент для изучения вопросов нейро(иммуно)логии в соответствующей модели в соответствии с принципами замены, сокращения и уточнения (3R) ^2,3.

Thomson et al. описали метод культивирования клеток с использованием пренатальных клеток спинного мозга, которые дифференцируются во все вышеупомянутые основные типы клеток ЦНС⁴. Эта система также имеет образование синапсов, миелинизированные аксоны и узлы Ранвье. Основным ограничением этого метода культивирования является то, что, будучи спинным мозгом, он не может с пользой моделировать головной мозг, и клетки, полученные на 13-й день эмбриона (E13), сжимают спинной мозг. Таким образом, это ограничивает количество экспериментальных условий, которые могут быть исследованы. Таким образом, это исследование было направлено на разработку новой системы клеточных культур, которая повторяет характеристики мозга с повышенным выходом клеток, чтобы снизить требования к животным.

Используя Thomson et al. в качестве отправной точки, мы разработали модель клеточной культуры, полученную исключительно из пренатального мозга мыши. Эти культуры имеют те же клеточные популяции, взаимосвязь и варианты лечения, что и культуры спинного мозга, за исключением того, что по сравнению с ними миелинизация меньше. Однако наличие модели ЦНС in vitro с примерно в три раза более высоким выходом клеток является более эффективным, требуя меньшего количества мышей и меньшего времени на обработку эмбрионов. Мы оптимизировали эту уникальную систему культивирования для различных последующих применений и масштабов, в том числе с использованием стеклянных покровных стекол для микроскопического анализа и пластиковых луночных пластин различных размеров, включая 96-луночные планшеты для высокопроизводительных исследований.

протокол

Все эксперименты на животных соответствовали местным законам и рекомендациям по использованию животных и были одобрены местным комитетом по этической экспертизе в Университете Глазго. Животные были размещены в особых условиях, свободных от патогенов, в соответствии с Законом Великобритании о научных процедурах животных 1986 года под эгидой лицензии на проект Министерства внутренних дел Великобритании. Для этого исследования были использованы взрослые мыши C57BL/6J, выведенные собственными силами. Использование молодым женщинам (8-12 недель) рекомендуется из-за более высокой успешности беременности; Самцов можно повторно использовать для нескольких раундов разведения. На фиг.1 представлен схематический обзор описанного способа получения смешанных культур нейронов и глии.

1. Подготовка расходных материалов для тканевых культур

1. Подготовьте пластины и/или посуду, содержащие покровные стекла для микроскопии, в шкафу безопасности класса 2. Стерилизуйте все реагенты или автоклав, чтобы обеспечить стерильность в период культивирования.
2. Добавьте соответствующий объем БА-ФАПЧ (13,2 мкг/мл поли-L-лизинегидробромида [ФАПЧ] в буфере борной кислоты [БА] [50 мМ борной кислоты, 12,5 мМ тетрабората натрия, рН 8,5]; см. Таблицу материалов) в каждую лунку (1000 мкл / лунка в 6-луночном планшете, 100 мкл / лунка в 96-луночном планшете; объемы обобщены в таблице 1). Для микроскопических покровных стекол добавьте 20 мл BA-PLL в чашку для культивирования тканей диаметром 9 см, содержащую 200 стерильных покровных стекол, и перемешайте для равномерного распределения.
3. Инкубировать при 37 °C в течение 1-2 часов.
4. Удалите раствор BA-PLL из каждой лунки или чашки, содержащей покровные стекла для микроскопии, и промойте, добавив 20 мл стерильной воды, взбалтывая покровные стекла, а затем удаляя воду. Повторите этот шаг стирки три раза. Для посуды, содержащей покровные стекла, оставьте стерильную воду в чашке для культивирования тканей при окончательной стирке, чтобы легко удалить покровные стекла.
5. Удалите как можно больше жидкости стерильной пипеткой и дайте высохнуть не менее 2 часов на ночь.
6. Храните пластины с покрытием при температуре 4 °C до 2 месяцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовленную борную кислоту с раствором поли-l-лизина (BA-PLL) можно использовать повторно до трех раз, каждый раз добавляя новый ФАПЧ. Хранить BA-PLL при температуре 4 °C. Чашки обрабатываются BA-PLL, так как PLL позволяет клеткам прилипать и расти. Без этого лечения клетки поднимутся примерно через 1 неделю культивирования и больше не смогут дифференцироваться.

2. Вскрытие эмбрионального мозга Е17

1. Разместите одну или несколько самок мышей вместе с мышью-самцом. Ежедневно проверяйте самок на наличие слизистой пробки, указывающей на то, что спаривание состоялось.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любые «заткнутые» самки мышей должны быть отделены от самца, чтобы обеспечить правильную дату начала беременности. Мышей можно взвешивать для подтверждения беременности или контролировать визуально.
2. Выбраковка беременной мыши на E17 с использованием соответствующих методов в соответствии с местными рекомендациями и законами о защите животных, например, путем повышения концентрации углекислого газа (CO₂), передозировки смертельного анестетика или вывиха шеи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный метод не должен нарушать эмбрионы. Для этого исследования воздействие растущей концентрации углекислого газа с последующим подтверждением смерти путем разрыва бедренной артерии использовалось для отбраковки беременных маток.
3. Положите выбракованную беременную мышь на спину на доску для вскрытия; Хотя закрепление его не требуется, это может облегчить задачу неопытным исследователям. Ущипните среднюю линию живота с помощью щипцов. С помощью острых ножниц разрежьте живот через кожу и брюшину по средней линии от гениталий до грудной клетки, стараясь не проколоть матку.
   1. Матка мыши имеет два рога, каждый из которых обычно содержит от одного до пяти эмбрионов. Извлеките матку, содержащую эмбрионы, из матери и сразу же поместите ее на лед.
4. Разрежьте желточный мешок сбоку от плаценты, стараясь не повредить эмбрионы, и извлеките эмбрионы из желточного мешка.
5. Немедленно обезглавливают эмбрионы. Добавьте обезглавленные головы в чашку со сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) без кальция (Ca 2+) и магния (Mg²⁺) (HBSS-/-) на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется генотипирование, на этом этапе можно удалить хвост для генетического анализа. Когда ожидается несколько генотипов, головки каждого эмбриона следует хранить отдельно для культивирования.
6. Используя угловые щипцы, расположите голову на боку, обращенном влево.
7. Проткните глаз одним краем щипцов, крепко придерживая подбородок другим.
8. Начиная с затылка, аккуратно разорвите кожу кожи головы по средней линии к кончику морды.
9. Войдя через спинной мозг, заметный как белый овал, используйте угловые щипцы, чтобы расколоть череп по средней линии, обнажив мозг.
10. Аккуратно снимите череп со стороны, обращенной вверх, обнажая мозг.
11. Извлеките мозг из черепа, избавившись от черепа, как только мозг будет полностью удален.
12. С помощью щипцов удаляют мозговые оболочки, которые заметны как тонкая мембрана с плотными кровеносными сосудами.
13. Поместите мозг в бижутерию (см. Таблицу материалов), содержащую 2 мл HBSS-/- на льду.
14. Повторите шаги с 2.6 по 2.13 с оставшимися мозгами, добавив до четырех мозгов на бижутерию.
15. Добавьте 250 мкл 10-кратного трипсина в бижутерию и тритуируйте мозг, встряхивая бижутерию. Выдерживать 15 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, начиная с этого момента, должны выполняться в стерильном капюшоне для культивирования тканей.
16. Разморозьте 2 мл ингибитора трипсина (SD) сои (Leibovitz L-15, 0,52 мг/мл ингибитора трипсина из сои, 40 мкг/мл ДНКазы I, 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина [BSA] фракции V; см. Таблицу материалов) от -20 °C, поместив его при 37 °C.
17. Добавьте 2 мл ингибитора SD к каждому бижутерии, содержащему мозг (на бижутерию, содержащую до четырех мозгов), снова встряхивая бижутерию, чтобы равномерно распределить ее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибитор SD снижает активность трипсина, предотвращая ненужное переваривание образцов и сохраняя жизнеспособность клеток.
18. Без центрифугирования удалите 2 мл надосадочной жидкости из каждого бижутерии и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл, стараясь не переносить клеточные сгустки.
19. Тритуируйте оставшиеся клетки в бижутерии иглой 19 г, прикрепленной к шприцу объемом 5 мл, путем двойной аспирации суспензии. Это создаст густую слизеобразную смесь.
    1. Повторите еще дважды, используя иглу 21 G. Если остались комки, тритуируйте еще раз иглой 21 G.
20. Перенесите клетки из бижутерии в ту же центрифужную пробирку объемом 15 мл (из шага 2.18) с помощью иглы 23 G.
21. Центрифуга при 200 x g при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
22. Удалите всю надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и перенесите ее в другую центрифужную пробирку объемом 15 мл, стараясь не нарушить рыхлую гранулу на дне, содержащую необходимые клетки.
23. Снова центрифугируйте надосадочную жидкость при 200 x g при RT в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является существенным, но если требуется много клеток или мало эмбрионов, можно выполнить этот шаг, чтобы извлечь как можно больше клеток из надосадочной жидкости.
24. Используя 10 мл гальванических сред (PM) (49% модифицированной орлиной среды Дульбекко [DMEM], 1% пенициллина/стрептомицина [Pen/Strep], 25% лошадиной сыворотки, 25% HBSS с Ca 2+ и Mg² + [HBSS⁺ /+]; см. Таблицу материалов), объедините и ресуспендируйте две гранулы вместе, чтобы создать целую клеточную суспензию.
25. Подсчитайте клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра или цифрового счетчика клеток и разбавьте клеточную суспензию PM до концентрации 1,8 x 10⁶ клеток / мл.

3. Покрытие ячеек

1. Добавьте требуемый объем суспензии ячейки к требуемому формату, как указано в таблице 1: 1000 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 100 мкл на покровное стекло.
2. Инкубировать в течение 2-4 ч при 37 °C с 5%-7%_CO2. Проверьте прилипание клеток с помощью инвертированного микроскопа.
3. Удалите среду и долейте ее новой дифференцировочной средой (СД+: СД, включая инсулин 10 мкг/мл. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 нМ гидрокортизон, 10 нг/мл биотина, 2,5 мл 100x N1 добавки среды; см. Таблицу материалов). Объемы приведены в таблице 1. Прижмите все плавающие покровные стекла стерильным наконечником пипетки.

4. Уход за культурами

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти культуры требуют подкормки три раза в неделю для поддержания оптимального роста и дифференциации. Культуры достигнут оптимального здоровья и зрелости для экспериментов на DIV (дни in vitro) 21. Клетки могут храниться в культуре до 28 дней, после чего культуры быстро вырождаются.

1. Три раза в неделю до DIV12 заменяйте часть надосадочной жидкости свежим DM+, удаляя 500 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 500 мкл на посуду, содержащую три покровных стекла, и добавляя 600 мкл на лунку в 6-луночном формате, 60 мкл на лунку в 96-луночном формате, или 600 мкл на чашку с покровным стеклом (таблица 1).
2. Три раза в неделю, начиная с DIV13, заменяйте часть надосадочной жидкости свежим DM-, удаляя 500 мкл на лунку в 6-луночном формате, 50 мкл на лунку в 96-луночном формате или 500 мкл на чашку, содержащую три покровных стекла, и добавляя 600 мкл на лунку в 6-луночном формате, 60 мкл на лунку в 96-луночном формате, или 600 мкл на чашку с покровным стеклом (таблица 1).

Результаты

Микроскопия
Культуры, выращенные на стеклянных покровных стеклах, идеально подходят для анализа с помощью микроскопии. Чтобы визуализировать развитие культур, покровные стекла фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в нескольких временных точках от DIV0 (после присоединения к?...

Обсуждение

ЦНС представляет собой сложную сеть, которая простирается от головного мозга до спинного мозга и состоит из многих типов клеток, преимущественно нейронов, олигодендроцитов, астроцитов и микроглии¹. Поскольку каждая клетка играет важную роль в поддержании гомеостаза и выр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor