一种基于根 茎农杆菌毛根转化生产复合植物的高效且可重复的方法

摘要

在这里，我们提供了由 根癌农杆菌 介导的一步转化方法的详细协议，以生产复合植物。

摘要

使用根茎农杆菌介导的毛根转化生产具有转基因根和非转基因茎芽的复合植物是研究 根相关生物学的有力工具。毛根转化在广泛的双子叶植物和几种单子叶植物中建立，并且几乎独立于基因型。传统的下胚轴注射根 茎得到 复合植株的方法效率低下、耗时、费力，且经常导致嫩小下胚轴植株死亡。此前建立了以根 茎曲霉 介导的高效一步法毛根转化，无需在产生毛根后进行移植。本研究切除部分下胚轴和主根，下胚轴切口部位涂有 根茎曲霉， 然后将下胚轴种植在无菌蛭石中。栽培12天后，下胚轴切口扩大，诱导新的毛根。本文提供了由 根茎介导的一步转化方法的详细方案，其有效性通过生产野生大豆、 美洲茄和南瓜的复合植物来证明。

引言

根茎农杆菌是根茎科革兰氏阴性土壤细菌。 A. rhanzogenes可以通过伤口感染几乎所有的双子叶植物，少数单子叶植物和单个裸子植物，在受感染的植物中产生毛根。细菌携带Ri（发根）质粒，Ri质粒的T-DNA携带opine合成基因和rol基因（根位点基因）。Ri质粒的T-DNA进入植物细胞并整合到宿主染色体中后，rol基因的表达诱导毛根的产生¹。携带靶基因的植物二元表达载体转化为根茎曲霉，转化后的根茎曲霉用于感染植物。转基因根可以在受感染的植物中诱导，产生含有转基因根和非转基因茎和芽的复合植物。通常，复合植物可以在14-20天内获得。根茎介导的毛根转化在双子叶植物中一般不受基因型^{的限制2。}根茎感染植物产生的毛根具有生长速度快、遗传稳定、操作方便等特点。由根茎A. rhizogene介导的毛根转化目前广泛用于研究与根相关的生物学。此外，毛根的转化也可用于验证和优化CRISPR/Cas9系统^3,4,5和蛋白质亚细胞定位的靶点编辑效率。因此，毛根转化是研究植物基因功能、代谢工程以及....

研究方案

1. 植物生长条件与根茎培养

1. 播种
   注：野生大豆种子采自中国聊城阳谷县;美洲南瓜和 南 瓜当地品种银苏的种子是从市场上购买的。
   1. 收集野生大豆，美洲南瓜和当地 南瓜品种的种子，将它们播种在1厘米深的蛭石中，并彻底浇水。将 20 颗种子种植在 8 厘米 x 11 厘米 x 9 厘米的塑料盒中。在24±2°C的生长室中以约70%相对湿度进行16小时光照/ 8小时黑暗循环培养植物。
      注意：播种前必须打破野生大豆种子的外套。如果研究问题集中在植物和微生物之间的相互作用上，种子、蛭石、塑料盒和水在使用前必须进行消毒。
   2. 根茎曲霉K599的活化和培养
      注意：根茎A. rhizogenes K599菌株有一个二元载体pRed1305² 携带红色荧光报告基因 DsRed2。
      1. 从-80°C冰箱中取出根 茎曲霉 菌株K599，并在固体LB培养基（用50mg / L卡那霉素和50mg / L链霉素）上在28°C下活化细菌48小时。
      2. 挑选菌株K599的单个克隆，并将其在1mL含液体抗生素的LB培养基中培养12小时。
      3. 将500μL细菌悬浮液均匀地散布在含有固体抗生素的LB培养基上，然后在28°C下孵育24小时。

讨论

一步法根茎介导的毛根法是比下胚轴注射法更简单、更有效的复合植物生产方法。一步法ARM方法显著提高了毛根转化效率，缩短了产生毛根的时间，增加了毛根的数量，减少了所涉及的工作量。改进的转化方案最适合研究豆科植物与根瘤菌之间以及植物与丛枝菌根真菌之间的共生关系。这可以归因于这样一个事实，即在产生毛根后不需要移植复合植物，这避免了移植过程中发生的非接种菌?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
kanamycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A506636
LB medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113
plastic box	LiaoSu		8 cm x 11 cm x 9 cm
pumpkin			local variety Yinsu
streptomycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610494
Tanon-5200Multi machine	Tanon Co., Ltd., China	5200Multi	chemiluminescence imaging system
tomato			local variety Zhongshu4
wild soybean			collected in Yanggu County, Liaocheng, China