Un metodo efficiente e riproducibile per la produzione di piante composite mediante trasformazione delle radici pelose a base di Agrobacterium rhizogenes

Riepilogo

Qui, forniamo il protocollo dettagliato di un metodo di trasformazione in un'unica fase mediato da Agrobacterium tumefaciens per produrre piante composite.

Abstract

La produzione di piante composite con radici transgeniche e steli e gemme non transgenici utilizzando la trasformazione delle radici pelose mediata da Agrobacterium rhizogenes è un potente strumento per studiare la biologia correlata alle radici. La trasformazione della radice pelosa è stabilita in una vasta gamma di dicotiledoni e in diverse specie di monocotiledoni ed è quasi indipendente dal genotipo. Il metodo tradizionale di iniezione di ipocotile con A. rhizogenes per ottenere piante composite è inefficiente, richiede tempo, laborioso e spesso causa la morte di piante ipocotiliche tenere e minuscole. In precedenza è stata stabilita una trasformazione delle radici pelose in un solo passaggio altamente efficiente, mediata da A. rhizogenes , che elimina la necessità di trapianto dopo aver prodotto radici pelose. In questo studio, un ipocotile parziale e la radice primaria sono stati rimossi, il sito di incisione ipocotilicica è stato rivestito con A. rhizogenes, e quindi gli ipocotili sono stati piantati in vermiculite sterile. Dopo 12 giorni di coltivazione, l'incisione ipocotilicica si è espansa e sono state indotte nuove radici pelose. Questo articolo fornisce il protocollo dettagliato di un metodo di trasformazione in un'unica fase mediato da A. rhizogenes, con la sua efficacia dimostrata dalla produzione di piante composite di soia selvatica, Solanum americanum e zucca.

Introduzione

Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo gram-negativo della famiglia Rhizobiaceae. A. rhizogenes può infettare quasi tutte le dicotiledoni, alcune monocotiledoni e singole gimnosperme attraverso le ferite, producendo radici pelose nelle piante infette. Il batterio trasporta il plasmide Ri (che induce la radice) e il T-DNA del plasmide Ri trasporta il gene di sintesi dell'opina e i geni rol (geni del locus radicale). Dopo che il T-DNA del plasmide Ri entra in una cellula vegetale ed è integrato in un cromosoma ospite, l'espressione dei geni rol induce la produzione di radici pelose¹. Un vettore di espressione binaria vegetale che trasporta un gene bersaglio viene trasformato in A. rhizogenes e l'A. rhizogenes trasformato viene utilizzato per infettare una pianta. Le radici transgeniche possono essere indotte nelle piante infette, producendo piante composite contenenti radici transgeniche e steli e gemme non transgenici. Generalmente, una pianta composita può essere ottenuta entro 14-20 giorni. A. La trasformazione delle radici pelose mediata da rizogeni non è generalmente limitata dal genotipo nelle piante dicotiledoni². Le radici pelose prodotte da piante infette da A. rhizogenes sono caratterizzate da un rapido tasso di crescita, ereditarietà stabile e facilità d'uso. La trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes è attualmente ampiamente utilizzata per studiare la biologia correlata alle radici. Inoltre, la trasformazione delle radici pelose può anche essere utilizzata per convalidare e ottimizzare l'efficienza di target-editing del sistema CRISPR/Cas9 ^3,4,5 e la localizzazione subcellulare delle proteine. Pertanto, la trasformazione delle radici pelose è uno strumento importante nella ricerca sulla funzione genica delle piante, sull'ingegneria metabolica e sulle interazioni tra radici e microrganismi della rizosfera ^6,7,8.

Le piante composite contenenti radici transgeniche ottenute attraverso la trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente prodotte nelle piante dicotiledoni, specialmente nei legumi. Il metodo tradizionale di iniezione dell'ipocotile con A. rhizogenes è stato utilizzato per produrre Lotus corniculatus 9, soia 10, pomodoro¹¹, patate dolci¹² e molte altre piante ^5,8. Il metodo di iniezione di ipocotile è inefficiente ed è probabile che causi la morte di piante ipocotiliche giovani o minuscole. Pertanto, il metodo è stato migliorato tagliando le radici embrionali, rivestendo l'incisione della piantina con A. rhizogenes e quindi posizionando l'ipocotile su terreno di coltura sterile per la coltivazione del radicamento¹³. Tuttavia, questi passaggi vengono eseguiti in un ambiente sterile e le fasi operative sono relativamente ingombranti. In particolare, le piante composite risultanti devono essere trapiantate, il che aumenta la quantità di lavoro. Nel lavoro precedente, la trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes (ARM) è stata stabilita in cetriolo, soia, Lotus japonicus, Medicago truncatula e pomodoro 2,14,15,16,17. La radice primaria e l'ipocotile parziale sono stati rimossi, il sito di incisione dell'ipocotile rimanente è stato rivestito con A. rhizogenes trasformato e la piantina è stata quindi piantata in vermiculite sterile umida. Dopo 12 giorni di coltivazione, le radici pelose sono state prodotte nel sito di incisione. Il metodo ARM one-step è altamente efficiente e richiede meno tempo per produrre radici pelose. Anche il trapianto dopo aver formato radici pelose non è necessario. Poiché la contaminazione microbica può essere evitata senza trapianto, il metodo ARM in un'unica fase può essere particolarmente utile quando si studiano le interazioni tra piante e microrganismi, come la fissazione simbiotica dell'azoto tra leguminose e rizobia e le simbiosi tra piante e funghi micorrizici arbuscolari. In questo articolo, viene fornito un dettagliato protocollo di trasformazione delle radici pelose mediato da A. rhizogenes con esempi di piante composite prodotte in soia selvatica, Solanum americanum e zucca. Con il protocollo, i ricercatori possono eseguire senza problemi la trasformazione ARM in un solo passaggio.

Protocollo

1. Condizioni di crescita delle piante e coltura di A. rhizogenes

1. Semina di semi
   NOTA: I semi di soia selvatica sono stati raccolti nella contea di Yanggu, Liaocheng, Cina; semi di S. americanum e zucca varietà locale Yinsu sono stati acquistati da un mercato.
   1. Raccogli semi di soia selvatica, S. americanum e la varietà locale di zucca, seminali in vermiculite ad una profondità di 1 cm e annaffiali accuratamente. Pianta 20 semi in scatole di plastica da 8 cm x 11 cm x 9 cm. Coltivare le piante in una camera di crescita a 24 ± 2 °C con un ciclo di 16 ore di luce/8 ore di buio a circa il 70% di umidità relativa.
      NOTA: I manti di semi di soia selvatica devono essere rotti prima della semina. Se la domanda di ricerca si concentra sulle interazioni tra piante e microrganismi, semi, vermiculite, scatole di plastica e acqua devono essere sterilizzati prima dell'uso.
   2. Attivazione e coltura di A. rhizogenes K599
      NOTA: Il ceppo A. rhizogenes K599 aveva un vettore binario pRed1305² portatore di un gene reporter fluorescente rosso DsRed2.
      1. Rimuovere il ceppo K599 di A. rhizogenes da un congelatore a -80 °C e attivare i batteri su un terreno solido LB (con 50 mg/L di kanamicina e 50 mg/L di streptomicina) a 28 °C per 48 ore.
      2. Prelevare un singolo clone del ceppo K599 e coltivarlo in 1 mL di terreno liquido contenente antibiotici LB per 12 ore.
      3. Distribuire uniformemente 500 μL della sospensione batterica su terreno solido contenente antibiotico, seguito da incubazione a 28 °C per 24 ore.

2. Metodo di trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes

1. Incisione ipocotilicica
   1. Dopo 7 giorni (definire la semina dei semi come giorno 0), le cotiledoni della piantina si sono appena dispiegate (Figura 1A), utilizzare un bisturi sterilizzato e affilato per tagliare circa 0,5-1 cm dell'ipocotile (Figura 1B). Scartare la radice primaria e parte dell'ipocotile parziale.
      NOTA: Utilizzare il bisturi con cura.
2. Inoculazione K599
   1. Rivestire l'incisione ipocotilicica con batteri K599 (Figura 1C).
   2. Piantare le piantine in vermiculite umida (Figura 1D).
   3. Infettare 30 piante di ogni specie attraverso la trasformazione delle radici pelose mediata da A. rhizogenes. Innaffia ogni pianta con 5 ml di sospensione batterica K599 risospesa (OD₆₀₀ = 0,5-0,6) in un quarto di forza (0,25x) Gamborg B-5 terreno di base (Figura 1E).
   4. Coprire i vasi con un sacchetto di plastica altamente trasparente (Figura 1F) e metterli in una camera di crescita.

3. Produzione di radici pelose

1. Coltiva le piante per ~ 12 giorni dopo l'inoculazione, nuove radici pelose saranno indotte e generate nel sito di incisione. Dopo 15 giorni, le lunghezze delle radici pelose raggiungono tipicamente i 2-5 cm (Figura 2).
2. Per determinare se le radici pelose prodotte sono transgeniche, esaminare l'espressione dei geni reporter dipendenti dal vettore trasformato in K599.
   1. Rilevare l'espressione del gene reporter DsRed2 utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza con luce di eccitazione verde a 540 nm ed emissione a 600 nm (Figura 2B, Figura 2D e Figura 2F).

Risultati

Trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes altamente efficiente
Le radici pelose sono state prodotte nel sito di incisione ipocotilicica 12 giorni dopo l'inoculazione con K599 ingegnerizzato. Le radici pelose transgeniche sono state determinate in base all'espressione del gene reporter contenuto nel vettore binario. Le radici transgeniche trasformate con il gene reporter DsRed2 della soia selvatica composita, S. americanum e la zucca sono state osservate sot...

Discussione

Il metodo della radice pelosa mediata da A. rhizogenes è un metodo più semplice ed efficiente per la produzione di piante composite rispetto al metodo di iniezione ipocotile. Il metodo ARM in un'unica fase migliora significativamente l'efficienza della trasformazione delle radici pelose, riduce il tempo per produrre radici pelose, aumenta il numero di radici pelose e riduce la quantità di lavoro coinvolto. Il protocollo di trasformazione migliorato è ottimale per studi sulle simbiosi tra leguminose e rizobie...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
kanamycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A506636
LB medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113
plastic box	LiaoSu		8 cm x 11 cm x 9 cm
pumpkin			local variety Yinsu
streptomycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610494
Tanon-5200Multi machine	Tanon Co., Ltd., China	5200Multi	chemiluminescence imaging system
tomato			local variety Zhongshu4
wild soybean			collected in Yanggu County, Liaocheng, China