Agrobacterium rhizogenes 기반 털이 많은 뿌리 형질전환에 의한 복합 식물 생산을 위한 효율적이고 재현 가능한 방법

요약

여기에서는 복합 식물을 생산하기 위해 Agrobacterium tumefaciens 가 매개하는 원스텝 형질전환 방법의 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

아그로박테리움 뿌리 유전자 매개 털이 많은 뿌리 형질전환을 사용하여 형질전환 뿌리와 비형질전환 줄기 및 새싹이 있는 복합 식물을 생산하는 것은 뿌리 관련 생물학을 연구하는 강력한 도구입니다. 털이 많은 뿌리 변형은 광범위한 쌍떡잎 식물과 여러 외떡잎 식물 종에서 확립되며 유전자형과 거의 무관합니다. 복합 식물을 얻기 위해 A. rhizogenes로 배축을 주사하는 전통적인 방법은 비효율적이고 시간이 많이 걸리며 힘들고 부드럽고 작은 배축 식물이 자주 죽습니다. A. rhizogenes에 의해 매개되는 매우 효율적인 1단계 털이 많은 뿌리 변형이 이전에 확립되어 털이 많은 뿌리를 생산한 후 이식할 필요가 없습니다. 본 연구에서는 부분적인 배축과 일차뿌리를 제거하고 배축 절개 부위를 A. rhizogenes로 코팅한 후 멸균 질석에 배축을 심었다. 재배 12일 후, 배축 절개가 확장되고 새로운 털이 많은 뿌리가 유도되었습니다. 이 기사는 A. rhizogenes에 의해 매개되는 원스텝 형질전환 방법의 상세한 프로토콜을 제공하며, 그 효과는 야생 대두, Solanum americanum 및 호박의 복합 식물을 생산함으로써 입증되었습니다.

서문

Agrobacterium rhizogenes는 Rhizobiaceae 계통의 그람 음성 토양 박테리아입니다. A. rhizogenes는 상처를 통해 거의 모든 쌍떡잎식물, 소수의 외떡잎식물 및 개별 겉씨식물을 감염시켜 감염된 식물에 털이 많은 뿌리를 생성할 수 있습니다. 박테리아는 Ri(root-inducing) 플라스미드를 운반하고, Ri 플라스미드의 T-DNA는 오핀 합성 유전자와 rol 유전자(root locus genes)를 운반합니다. Ri 플라스미드의 T-DNA가 식물 세포에 들어가 숙주 염색체에 집적된 후, 롤롤 유전자의 발현은 털이 많은 뿌리¹의 생성을 유도한다. 표적 유전자를 담지한 식물 이진 발현 벡터를 A. rhizogenes로 형질전환시키고, 형질전환된 A. rhizogenes를 이용하여 식물을 감염시킨다. 형질전환 뿌리는 감염된 식물에서 유도될 수 있으며, 형질전환 뿌리 및 비형질전환 줄기 및 새싹을 포함하는 복합 식물을 생산할 수 있습니다. 일반적으로 복합 식물은 14-20 일 이내에 얻을 수 있습니다. A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 형질전환은 일반적으로 쌍떡잎식물에서 유전자형에....

프로토콜

1. 식물 생장 조건 및 A. rhizogenes 배양

1. 종자 파종
   참고: 야생 콩 종자는 중국 랴오청시 양구현에서 수집되었습니다. S. americanum 과 호박 지역 품종 Yinsu의 씨앗은 시장에서 구입했습니다.
   1. 야생 콩, S. americanum 및 현지 품종의 호박의 씨앗을 모아 1cm 깊이의 질석에 뿌리고 철저히 물을줍니다. 8cm x 11cm x 9cm 플라스틱 상자에 20 개의 씨앗을 심습니다. 약 70 % 상대 습도에서 16 시간 빛 / 8 시간 어둠주기로 24 ± 2 ° C의 성장 챔버에서 식물을 재배합니다.
      알림: 야생 콩 씨앗의 코트는 파종 전에 깨뜨려야 합니다. 연구 질문이 식물과 미생물 간의 상호 작용에 초점을 맞추는 경우 씨앗, 질석, 플라스틱 상자 및 물을 사용하기 전에 멸균해야 합니다.
   2. A. rhizogenes K599의 활성화 및 배양
      참고: A. rhizogenes K599 균주는 적색 형광 리포터 유전자 DsRed2를 운반하는 하나의 이진 벡터 pRed1305²를 가졌습니다.
      1. A. rhizogenes 균주....

토론

원스텝 A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 방법은 배축 주입 방법보다 복합 식물을 생산하는 더 간단하고 효율적인 방법입니다. 원스텝 ARM 방법은 털이 많은 뿌리 변형의 효율성을 크게 향상시키고, 털이 많은 뿌리를 생성하는 시간을 단축하고, 털이 많은 뿌리의 수를 늘리고, 관련된 작업량을 줄입니다. 개선된 형질전환 프로토콜은 콩과 식물과 근경 사이, 식물과 arbuscular mycorrhizal 균류 사이?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
kanamycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A506636
LB medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113
plastic box	LiaoSu		8 cm x 11 cm x 9 cm
pumpkin			local variety Yinsu
streptomycin	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610494
Tanon-5200Multi machine	Tanon Co., Ltd., China	5200Multi	chemiluminescence imaging system
tomato			local variety Zhongshu4
wild soybean			collected in Yanggu County, Liaocheng, China