在单个水箱中使用一系列行为测试对成年 Danio rerio 进行神经毒性评估

摘要

在这里，我们提出了一个全面的行为测试电池，包括新型水箱、浅滩和社会偏好测试，以有效确定使用单个水箱的化学物质（例如甲基苯丙胺和草甘膦）对成年斑马鱼的潜在神经毒性作用。这种方法与神经毒性和环境研究有关。

摘要

多年来，神经病理学效应的存在被证明是评估化学物质神经毒性的主要终点。然而，在过去的 50 年里，人们积极研究了化学物质对模式物种行为的影响。渐渐地，行为终点被纳入神经毒理学筛查方案，这些功能结果现在通常用于识别和确定化学品的潜在神经毒性。成年斑马鱼的行为测定提供了一种标准化和可靠的方法来研究广泛的行为，包括焦虑、社交互动、学习、记忆和成瘾。成年斑马鱼的行为测定通常涉及将鱼置于实验场中，并使用视频跟踪软件记录和分析它们的行为。鱼可以暴露在各种刺激下，它们的行为可以使用各种指标来量化。这种新型的鱼缸测试是研究鱼类焦虑样行为的最被接受和广泛使用的测试之一。浅滩和社会偏好测试有助于研究斑马鱼的社会行为。这种测定特别有趣，因为研究了整个浅滩的行为。这些检测已被证明具有高度可重复性，并且对药理学和遗传操作敏感，使其成为研究行为背后的神经回路和分子机制的宝贵工具。此外，这些测定可用于药物筛选，以鉴定可能成为行为潜在调节剂的化合物。

在这项工作中，我们将展示如何在鱼类神经毒理学中应用行为工具，分析甲基苯丙胺（一种娱乐性药物）和草甘膦（一种环境污染物）的影响。结果表明，成年斑马鱼的行为测定对理解环境污染物和药物的神经毒理学影响做出了重大贡献，此外还提供了对可能改变神经元功能的分子机制的见解。

引言

斑马鱼 （Danio rerio） 是一种流行的模式脊椎动物物种，用于生态毒理学、药物发现和安全药理学研究。斑马鱼成本低廉，分子遗传工具完善，对神经系统形态发生和维持的关键生理过程的保护，使斑马鱼成为神经科学研究的理想动物模型，包括神经行为毒理学^1,2。直到最近，评估化学品神经毒性的主要终点是神经病理学效应的存在。然而，最近，行为终点已被纳入神经毒理学筛查方案，这些功能结果现在通常用于识别和确定化学品的潜在神经毒性 ^3,4。此外，从生态学的角度来看，行为终点具有高度相关性，因为即使是鱼类非常轻微的行为变化也可能危及动物在自然条件下的生存⁵.

成年斑马鱼研究中最常用的行为测定之一是新型水箱测试 （NTT），它测量焦虑样行为 ^6,7。在这种测定中，鱼暴露于新奇事物（鱼被放置在不熟悉的水箱中），轻微的厌恶刺激并观察它们的行为反应。NTT 主要用于评估鱼类的基础运动活动、地质趋向性、冻结和不稳定的运动。飘忽不定的⁸ 的特征是....

研究方案

严格遵守道德标准保证了用于实验的斑马鱼的福利和适当待遇。所有实验程序均根据机构动物护理和使用委员会（CID-CSIC）制定的指南进行。下面介绍的协议和结果是在当地政府授予的许可下进行的（协议编号 11336）。

1. 用于行为测试的动物圈舍

1. 在10：00至17：00之间，在27-28°C的隔离行为室中进行所有测试（如 图1所示）。
2. 在开始实验之前，在干净的鱼水中多次清洗对照鱼和暴露的鱼[含有 90 mg/L 水族箱系统盐、0.58 mM CaSO₄·2H₂O 和 0.59 mM NaHCO₃ 的反渗透纯化水]，以避免对实验罐的任何潜在污染。
3. 在开始实验前1小时使动物适应行为室。
4. 确保动物（≈50：50雄性：雌性比例）在实验上是幼稚的，并以盲目的方式进行所有行为测试，观察者不知道实验组。
5. 为了在行为测定中获得有意义的结果，每个条件总共有 18 名受试者 （n = 18），最好是在两个或多个独立实验之间获得。例如，在单个测试中，分析每个条件、每个重复的 9 只动物的行为。在组测试中，分析每个条件、每个重复 6 到 9 只动物的浅滩的行为。
6. 按照电池测试方法执行所有测试（参见

讨论

在 NTT 中观察到的特征性焦虑行为与大脑中分析的血清素水平呈正相关²¹.例如，在暴露于对氯苯丙氨酸（PCPA），一种5-HT生物合成的抑制剂后，鱼类表现出积极的趋向性以及大脑5-HT水平的降低²²，结果与MEH获得的结果非常相似。因此，暴露于甲基苯丙胺的斑马鱼中大脑血清素水平的降低和正向地理趋向性的表现表明，药物产生的焦虑行为是由血清素能途径介导的.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquarium Cube shape	Blau Aquaristic	7782025	Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software	Noldus	Ethovision XT	Version 12.0 or newer
GigE camera	Imaging Development Systems	UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02	GraphPad software Inc	GraphPad Prism 9.02	For Windows
IDS camera manager	Imaging Development Systems
LED backlight illumination	Quirumed	GP-G2
SPSS Software	IBM	IBM SPSS v26
uEye Cockpit software	Imaging Development Systems	version 4.90