הערכת רעילות עצבית אצל מבוגרים Danio rerio באמצעות סוללה של מבחנים התנהגותיים במיכל יחיד

Summary

כאן, אנו מציגים סוללת בדיקות התנהגותית מקיפה, כולל מיכל חדשני, Shoaling ומבחני העדפה חברתית, כדי לקבוע ביעילות את ההשפעות הנוירוטוקסיות האפשריות של כימיקלים (למשל, מתאמפטמין וגלייפוסט) על דגי זברה בוגרים באמצעות מכל יחיד. שיטה זו רלוונטית לנוירוטוקסיות ולמחקר סביבתי.

Abstract

נוכחותן של השפעות נוירופתולוגיות הוכיחה את עצמה, במשך שנים רבות, כנקודת הקצה העיקרית להערכת הרעילות העצבית של חומר כימי. עם זאת, ב -50 השנים האחרונות, ההשפעות של כימיקלים על ההתנהגות של מיני מודל נחקרו באופן פעיל. בהדרגה, נקודות קצה התנהגותיות שולבו בפרוטוקולי סינון נוירוטוקסיקולוגיים, ותוצאות תפקודיות אלה משמשות כיום באופן שגרתי כדי לזהות ולקבוע את הרעילות העצבית הפוטנציאלית של כימיקלים. בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים מספקות אמצעי סטנדרטי ואמין לחקר מגוון רחב של התנהגויות, כולל חרדה, אינטראקציה חברתית, למידה, זיכרון והתמכרות. בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים כוללות בדרך כלל הצבת הדגים בזירת ניסוי והקלטה וניתוח של התנהגותם באמצעות תוכנת מעקב וידאו. דגים יכולים להיחשף לגירויים שונים, וניתן לכמת את התנהגותם באמצעות מגוון מדדים. מבחן המיכל החדשני הוא אחד המבחנים המקובלים והנפוצים ביותר לחקר התנהגות דמוית חרדה בדגים. מבחני הצליפה וההעדפה החברתית שימושיים בחקר ההתנהגות החברתית של דגי זברה. בדיקה זו מעניינת במיוחד מכיוון שנלמדת התנהגותו של השואל כולו. בדיקות אלה הוכיחו את עצמן כניתנות לשחזור ורגישות למניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות, מה שהופך אותן לכלים רבי ערך לחקר המעגלים העצביים והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתנהגות. בנוסף, בדיקות אלה יכולות לשמש בסינון סמים כדי לזהות תרכובות שעשויות להיות מודולטורים פוטנציאליים של התנהגות.

בעבודה זו נראה כיצד ליישם כלים התנהגותיים בנוירוטוקסיקולוגיה של דגים, תוך ניתוח ההשפעה של מתאמפטמין, סם פנאי, וגלייפוסט, מזהם סביבתי. התוצאות מדגימות את התרומה המשמעותית של בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים להבנת ההשפעות הנוירוטוקסיקולוגיות של מזהמים סביבתיים ותרופות, בנוסף למתן תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים שעשויים לשנות את התפקוד העצבי.

Introduction

דג הזברה (שם מדעי: Danio rerio) הוא מין של חולייתני מודל פופולרי לאקוטוקסיקולוגיה, גילוי תרופות ומחקרי פרמקולוגיה בטיחותית. עלותו הנמוכה, הכלים הגנטיים המולקולריים המבוססים היטב ושימור תהליכים פיזיולוגיים מרכזיים המעורבים במורפוגנזה ובתחזוקה של מערכת העצבים הופכים את דגי הזברה למודל אידיאלי של בעלי חיים למחקר מדעי המוח, כולל טוקסיקולוגיה נוירו-התנהגותית ^1,2. נקודת הקצה העיקרית להערכת הרעילות העצבית של כימיקל הייתה, עד לאחרונה, נוכחות של השפעות נוירופתולוגיות. לאחרונה, עם זאת, נקודות קצה התנהגותיות שולבו בפרוטוקולי סינון נוירוטוקסיקולוגיים, ותוצאות תפקודיות אלה משמשות כיום בדרך כלל כדי לזהות ולקבוע את הרעילות העצבית הפוטנציאלית של כימיקלים ^3,4. יתר על כן, נקודות קצה התנהגותיות רלוונטיות מאוד מבחינה אקולוגית, שכן אפילו שינוי התנהגותי קל מאוד בדגים עלול לסכן את הישרדות החיה בתנאים טבעיים⁵.

אחד המבחנים ההתנהגותיים הנפוצים ביותר במחקר דגי זברה בוגרים הוא מבחן טנק חדשני (NTT), המודד התנהגות דמוית חרדה ^6,7. בבדיקה זו, דגים נחשפים לחידוש (דגים ממוקמים במיכל לא מוכר), גירוי מרתיע קל ותגובותיהם ההתנהגותיות נצפות. NTT משמש להערכת פעילות מוטורית בסיסית, גיאוטקסים, קפיאה ותנועות לא יציבות של דגים, בעיקר. ⁸ לא יציב מאופיין בשינויי כיוון פתאומיים (זיגזג) ובאפיזודות חוזרות ונשנות של תאוצות (הטלת חצים). זוהי תגובת אזעקה והוא נצפה בדרך כלל לפני או אחרי פרקים הקפאה. התנהגות הקפאה מקבילה להפסקה מוחלטת של תנועות הדג (למעט תנועות אופרולריות ועיניות) בעודו בתחתית המיכל, להבדיל מחוסר תנועה הנגרם על ידי טשטוש, הגורם לתנועה היפולוקוציונית, אקינזיה ושקיעה⁸. הקפאה קשורה בדרך כלל למצב גבוה של מתח וחרדה והיא גם חלק מהתנהגות כנועה. התנהגויות מורכבות הן אינדיקטורים מצוינים למצב החרדה של בעלי חיים. NTT הוכח כרגיש למניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות⁹, מה שהופך אותו לכלי רב ערך לחקר הבסיס העצבי של חרדה והפרעות נלוות.

דגי זברה הם מין חברתי מאוד, כך שאנו יכולים למדוד מגוון רחב של התנהגויות חברתיות. מבחן השולינג (ST) ומבחן ההעדפה החברתית (SPT) הם המבחנים הנפוצים ביותר להערכת התנהגות חברתית¹⁰. ST מודד את הנטייה של דגים להתקבץ יחד¹¹ על ידי כימות ההתנהגות המרחבית שלהם ודפוסי התנועה שלהם. ST שימושי לחקר דינמיקה קבוצתית, מנהיגות, למידה חברתית והבנת ההתנהגות החברתית של מיני דגים רבים¹². ה-SPT בדגי זברה בוגרים הותאם מהעדפתו של קרולי למבחן חידוש חברתי עבור עכברים¹³ והפך במהרה למבחן התנהגותי פופולרי לחקר אינטראקציה חברתית במין מודל זה¹⁴. שתי בדיקות אלה הותאמו גם לשימוש בבדיקות סינון סמים והראו הבטחה לזיהוי תרכובות חדשות המווסתות התנהגות חברתית^15,16.

באופן כללי, בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לספק מידע רב ערך על מנגנוני ההתנהגות או על הנוירופנוטיפים של תרכובות פעילות וסמים שעברו התעללות¹⁷. פרוטוקול זה מפרט כיצד ליישם כלים התנהגותיים אלה⁷ עם משאבים חומריים בסיסיים וכיצד ליישם אותם במבחני רעילות כדי לאפיין את ההשפעות של מגוון רחב של תרכובות נוירואקטיביות. בנוסף, נראה כי ניתן ליישם את אותן בדיקות כדי להעריך את ההשפעות הנוירו-התנהגותיות של חשיפה חריפה לתרכובת נוירואקטיבית (מתאמפטמין), אך גם כדי לאפיין השפעות אלה לאחר חשיפה כרונית לריכוזים סביבתיים של חומר הדברה (גלייפוסט).

Protocol

עמידה קפדנית בסטנדרטים אתיים מבטיחה רווחה וטיפול נאות בדגי הזברה המשמשים לניסויים. כל הליכי הניסוי בוצעו על פי ההנחיות שנקבעו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (CID-CSIC). הפרוטוקולים והתוצאות המוצגים להלן בוצעו על פי רישיון שניתן על ידי השלטון המקומי (הסכם מספר 11336).

1. דיור לבעלי חיים לבדיקות התנהגותיות

1. בצעו את כל הבדיקות (המוצגות באיור 1) בחדר התנהגותי מבודד בטמפרטורה של 27-28 מעלות צלזיוס בין השעות 10:00 ל-17:00.
2. יש לשטוף הן את דגי הבקרה והן את הדגים החשופים מספר פעמים במי דגים נקיים [מים מטוהרים באוסמוזה הפוכה המכילים 90 מ"ג/ליטר מלח מערכות אקווריום, 0.58 mM CaSO₄·2H₂O ו-0.59 mM NaHCO₃] לפני תחילת הניסויים כדי למנוע זיהום פוטנציאלי של מיכל הניסוי.
3. התאקלם בעלי חיים לחדר ההתנהגות שעה לפני תחילת הניסויים.
4. יש לוודא שבעלי החיים (יחס ≈50:50 זכר: נקבה) הם נאיביים מבחינה ניסויית ומבצעים את כל הבדיקות ההתנהגותיות באופן עיוור כאשר משקיפים אינם מודעים לקבוצת הניסוי.
5. כדי להשיג תוצאות משמעותיות במבחני התנהגות, יש מספר כולל של 18 נבדקים לכל מצב (n = 18), המתקבלים באופן אידיאלי בין שני ניסויים עצמאיים או יותר. לדוגמה, בבדיקות בודדות, לנתח את ההתנהגות של 9 בעלי חיים לכל מצב, לכל לשכפל. בבדיקות קבוצתיות, לנתח את ההתנהגות של שועל של 6 עד 9 בעלי חיים לכל מצב, לכל משוכפל.
6. בצע את כל הבדיקות בהתאם לגישת בדיקת הסוללה (ראה הצעות תכנון באיור 2). מבחינה אתית מתאימה יותר, שיטה זו מאפשרת להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר, תוך עמידה בעיקרון הפחתת 3R⁷.
7. לרוב, בדיקות התנהגותיות קשורות לבדיקות ביולוגיות, לכן יש להקריב את בעלי החיים בהתאם להנחיות^{המתת חסד 18} לפני איסוף וניתוח דגימות (OMICs או כימיקלים). אם נקודת הקצה אינה מתגלה כדגימה, ייצב מחדש את קבוצת הביקורת בסוף הניסוי. שימוש חוזר בחיות הביקורת למטרות רבייה או ניסוי לאחר מספר ימים.

איור 1: מערכי ניסוי. שלוש תצורות של המיכל המרובע כדי לחקור מגוון רחב של התנהגויות בדגי זברה בוגרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ציר הזמן של הניסוי. שתי הצעות תכנון להקלטת מבחני התנהגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. תצורות ניסיוניות של הטנק

1. התנהגות דמוית חרדה: מבחן הטנק החדש (NTT)
   1. התאם את מערך הניסוי (מספר המכלים, המצלמות והמחשבים) כדי להקליט את המספר המרבי של דגים בו זמנית. מבחני התנהגות אינדיבידואליים גוזלים זמן, לכן מטב את הזמן, החומר והמרחב.
   2. הכינו את מיכלי הניסוי ל-NTT: מיכל מרובע (20 ס"מ אורך, 20 ס"מ רוחב, 25 ס"מ גובה) מכוסה לוחות אקריליים על קירות רוחביים ותחתית כדי למנוע השתקפות והפרעה בין הנבדקים.
   3. מלא את מיכלי הניסוי עם 7 L (גובה עמודת מים: 20 ס"מ גובה) של מי דגים מחומצנים היטב ב 28 ° C.
   4. התאם את מיקום המיכל מול המצלמה כדי למנוע תמונה מעוותת.
   5. בדוק את הגדרת התאורה. תאורת LED אחורית (10000 לוקס) מספקת תאורה הומוגנית בכל חלקי המיכל להקלטת וידאו בתנאים טובים.
   6. הפעל את המצלמות וכוונן אותן בהתאם לסעיף 3.
   7. הכניסו את הנבדקים, אחד אחד, לתחתית מיכלי הניסוי לפני שתתחילו להקליט מהר ככל האפשר.
      הערה: חשוב להתחיל להקליט עם בעל החיים בתחתית המיכל.
   8. היזהר לא להפריע לבעלי החיים במהלך ההקלטה. שימוש בווילון או פאנל כדי להגביל את האינטראקציה החזותית לא רק בין טנקים אלא גם בין התמיכה לחוץ.
   9. בסוף ההקלטה (זמן ההקלטה הסטנדרטי הוא 6 דקות), מעבירים את החיות שכבר עברו את הניסוי למכל אחר כדי לא לערבב אותן עם החיות התמימות .
   10. חזור על ההליך עם כל הנושאים הזמינים. מומלץ לקבל מספר כולל של 18 נבדקים בכל מצב כדי להשיג תוצאות משמעותיות בניסויים בודדים (משני עותקים בלתי תלויים או יותר).
   11. חלק באופן אקראי את קבוצת הניסוי שהוקצתה לכל טנק בין ניסויים כדי למנוע השפעות פוטנציאליות של טנק (אם אתה מקליט מספר תנאים בו זמנית).
2. התנהגות חברתית מקובצת: מבחן השולינג (ST)
   1. תצורת הניסוי של ST זהה לזו של NTT (ניתן לעשות שימוש חוזר באותם טנקים ישירות).
   2. בצע את השלבים 2.1.1-2.1.6. כדי להגדיר את ST.
   3. הציגו את השואל (6 עד 9 נבדקים בו זמנית) בתחתית מיכלי הניסוי לפני שתתחילו להקליט מהר ככל האפשר.
      הערה: חשוב להתחיל להקליט עם בעל החיים בתחתית המיכל.
   4. בצע את השלבים 2.1.8-2.1.11. כדי לבצע את ST.
   5. חזור על ההליך עם כל הנושאים הזמינים. כדי להשיג תוצאות משמעותיות בבדיקה זו, בצע לפחות שני עותקים משוכפלים עצמאיים עם אותו גודל בנק בכל שכפול.
   6. לשמור על גודל השואל עקבי עבור כל קבוצות הניסוי ולשכפל בתוך אותו ניסוי.
3. התנהגות אישית חברתית: מבחן העדפה חברתית (SPT)
   1. התאם את מערך הניסוי כדי לייעל את מרחב הניסוי ואת זמן ההקלטה.
   2. הכינו את מיכלי הניסוי ל-SPT: מיכל מרובע (20 ס"מ אורך, 20 ס"מ רוחב, 25 ס"מ גובה) שקוף (זכוכית או פלסטיק) כדי להציע ראות רוחבית. דג המוקד הבודד חופשי לקיים אינטראקציה עם אזור וירטואלי ספציפי - שול דג המוצב במיכל הדיור החיצוני החד-צדדי, או עם האזור הווירטואלי הלא ספציפי - מיכל דיור ריק חיצוני חד-צדדי.
   3. מלא את מיכלי הניסוי עם 5 L (גובה עמודת מים: 15 ס"מ, באותו גובה כמו עמוד המים במיכלי הדיור החיצוניים) של מי דגים נקיים ב 28 °C (75 °F).
   4. התאם את מיקום המיכל מול המצלמה כדי למנוע תמונה מעוותת.
   5. בדקו שהמערכת מקבלת תאורה הומוגנית.
   6. הכניסו את הנבדקים, אחד אחד, לתחתית מכלי הניסוי לפני שתתחילו מיד להקליט עם החיה למטה במרכז.
   7. הימנע מאינטראקציות חזותיות בין צופים לבעלי חיים במהלך ההקלטה.
   8. בסוף ההקלטה בת 6 הדקות, העבירו את החיות הנוכחיות לטנק אחר כדי לא לערבב אותן עם החיות התמימות .
   9. חזור על ההליך עם כל הנושאים הזמינים. יש מספר כולל של 18 נבדקים לכל מצב כדי להשיג תוצאות משמעותיות בניסויים בודדים (משני משכפלים עצמאיים או יותר).

3. הקלטת וידאו למבחנים התנהגותיים

1. פתח את מנהל המצלמה כדי לבדוק את זמינות מצלמת GigE בכל מחשב.
2. הפעל את תוכנת השליטה במצלמת GigE (כגון uEye Cockpit, המתוארת כאן). פתח את האפשרות מצלמה , בחר מצב מונוכרום והתאם את גודל התמונה (1:2).
3. פתח מאפייני מצלמה
   1. תחת מצלמה, הגדר את שעון הפיקסלים למרבי, הגדר את קצב הפריימים ל- 30 פריימים לשנייה (fps) וכוונן את החשיפה (התאמה אוטומטית או ידנית אם התמונה כהה מדי).
   2. תחת תמונה, הגדר את הרווח ל- 0 (אוטומטי) ואת רמות השחור (כוונון אוטומטי או ידני לקבלת חדות טובה).
   3. תחת גודל, התאם את גודל החלון לאזור שיש לחרוט (רוחב: רוחב-שמאל, גובה: גובה-למעלה). שלב זה מאפשר להקטין את גודל התמונה, ולכן, את הגודל הסופי של הסרטון.
   4. סגור את מאפייני המצלמה.
4. צור תיקייה כללית עבור הפעלת הניסוי כדי לשמור את הגדרות המצלמה ואת סרטוני הווידאו.
5. כדי לשמור את הגדרות המצלמה, הגדר File > Save Parameters > To File ובחר בתיקיית הניסוי שנוצרה לאחרונה.
   הערה: כך ניתן לטעון מחדש את קובץ הגדרות המצלמה ביישום כדי להמשיך לעבוד עם אותם פרמטרים של תמונה בכל עת (לדוגמה, כאשר המצלמה כבויה לפתע או לעשות שימוש חוזר באותן הגדרות, מה שמקצר את זמן ההתקנה ויוצר הומוגניות בתנאי הניסוי). אם, ברגע אחד, המצלמה קופאת בין סרטונים, הפסק להקליט, צא וכבה את המצלמה. הפעל אותו שוב, טען מחדש את פרמטרי המצלמה על ידי מעבר אל פרמטרים של טעינת קבצים > > לקובץ והפעל מחדש את ההקלטה. בדוק אם הסרטון הנוכחי נרכש לחלוטין כדי להשליך או לחזור על הדג (לפני החזרה, תן לבעלי החיים קצת זמן להתאקלם מחדש).
6. חזור על הליך הגדרת מצלמה זה (שלבים 3.1-3.5) בכל המצלמות.
7. כאשר כל המצלמות מוגדרות כראוי, פתח את הקלט רצף וידאו.
8. בחר צור כדי לשמור כקובץ וידאו חדש, בחר את תיקיית הניסוי שנוצרה לאחרונה ודווח בשם קובץ הווידאו על פרטי הנושא, סוג הניסוי והתאריך.
9. בחר Max. Frames. הקלד 10800 בתיבת המסגרות. וידאו סטנדרטי מקליט 6 דקות (וידאו 1) ב 30 fps בפורמט AVI; לכן, 6 דקות x 60 s x 30 fps = 10800 מסגרות בסך הכל.
10. בחר Calc. קצב פריימים או ציין את קצב המסגרות באופן ידני (מהירות הקלטה: 30 fps).
11. חזור על הליך יצירת קובץ הווידאו בכל המחשבים.
12. הציגו את הנבדקים, אחד אחד, בתחתית כל טנק ניסוי. כל הבדיקות יופעלו בבת אחת.
13. התחל את הרשומות במהירות על ידי לחיצה על הקלט והמתן לקבלת המספר המרבי של המסגרות המבוקשות (שלב 3.10).
14. לאחר הקלטת הסרטונים, מופיעה תיבת צ'אט עם ההודעה מספר מרבי של פריימים שהושגו!. בחר קבל.
15. בחר סגור כדי לסיים את ההקלטה ולסגור את קובץ הווידאו.
16. הסר את הדגים שנצפו זה עתה. היזהרו להפריד אותם מהדגים התמימים.
17. בחר ישירות צור וחזור על התהליך כדי להמשיך להקליט סרטונים.
18. לאחר סיום כל ההקלטות, בחר יציאה.
19. כדי לכבות את המצלמות, בחר סגור מצלמה וצא מהתוכנית.

4. ניתוח סרטונים מוקלטים

1. הפעל את תוכנת הניתוח (ראה טבלת חומרים).
2. כדי לפרט על תבנית חדשה, לחץ על חדש מתבנית > החלת תבנית מוגדרת מראש > מקובץ וידאו, ובחר סרטון כדי להתחיל בהגדרת התבנית. נסו לבחור סרטון מייצג של הניסוי עם נבדק המציג ניידות טובה ותנאי הקלטה טובים.
3. ב פרמטרים, הגדר את הפרמטרים בחלונות הבאים (1 עד 4/7). בחר את המודל דגים > דגי זברה בוגרים, את הזירה Open Field Square > One Arena, את מספר הנושא לכל זירה (עבור ST, נדרשת חבילת מעקב מרובת [עקוב אחר נושאים שונים בזירה אחת]), את סוג הזיהוי לפי נקודת מרכז ולבסוף התאם את קצב הפריימים ל- 30 fps. בחלונות הבאים (5 עד 7/7), אל תשנה פרמטרים; תצורת ברירת המחדל היא בסדר.
4. תן שם לניסוי כתבנית ומקם אותו באותה תיקייה כמו שאר הווידאו המאוחסן. התבנית תיווצר כתיקיית ניסוי עם מספר חלוקות משנה המכילות את כל מידע ההתקנה.
5. תחת הגדרות ניסוי, בדוק את ההגדרה שהוגדרה (מקובץ וידאו, זירה, מספר נושאים, מסגרת לשנייה). כאן, יחידות המערכת ניתן לשנות.
6. תחת הגדרות ארנה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מרכז המסך ובחר תפוס. מתוך קובץ בתצוגה. בחר תמונת וידאו באיכות טובה וקבל כדי לצלם תמונה זו עבור הגדרות הרקע. תחילה, כייל את התמונה וצור כלל מכויל. השתמש ברוחב הטנק כקנה מידה (19 ס"מ). לאחר מכן, ציירו את הזירה. היזהר לעשות את הריבוע בדיוק מספיק כדי למנוע השתקפויות של החיה כאשר האחרון מתקרב לפני השטח או כל בלבול בסופו של דבר של תוכנת הדג עם האזורים השחורים של המיכל. לבסוף, צייר את אזורי הצורה באמצעות הפונקציה מסגרת .
   1. עבור NTT ו-ST, חלקו את חזית המיכל לשני אזורים וירטואליים שווים, עליון ותחתון (ראו איור 1). צייר שתי תיבות אופקיות שוות. קופסאות מכסות חצי זירה לכל אחת. תן שם לעליון ולחלק התחתון עבור האזורים העליונים והתחתונים, בהתאמה. יש להקפיד שהתיבות יהיו באותו רוחב (9-10 ס"מ) ואורך (8-9 ס"מ), לא לחרוג מגבולות הזירה (ריבוע כתום), ולא לחפוף, לבדוק שכל אזור חץ מציין בדיוק את האזורים שלו.
   2. עבור SPT, חלקו את זירת הניסוי באופן מושגי לשלושה אזורים שווים בגודלם: ריק, מרכז וספציפי (ראו איור 1). צייר שלוש תיבות אנכיות שוות. תן שם לתיבה המכוונת למיכל השואל כ - Conspecific, התיבה המכוונת למיכל הריק כ - Empty, והאמצעית כ - Center. יש להקפיד שהקופסאות יהיו באותו רוחב (6 ס"מ) ואורך (18-19 ס"מ), לא יחרגו ממגבלות הזירה ולא יחפפו.
7. תחת הגדרות זיהוי, ודא באיזה וידאו לטפל בקובץ הווידאו. לאחר מכן, בדוק את איכות הזיהוי (דגים בצהוב, נקודת מרכז אדומה). לחץ על זיהוי אוטומטי כדי להתאים את הזיהוי, מיקוד מחדש של החיה (בחר תמונה שהחיה שוחה בפרופיל על הרקע הלבן, צייר את התמונה על ידי צילום כל גופו, ואמת את הזיהוי עם כן). פתח את 'מתקדם' כדי לשפר את הזיהוי על-ידי בחירה באפשרות חיסור דינמי, נושא כהה יותר, הגדרות רקע, למידת רקע, גודל נושא, הפחתת רעשים וכו'.
8. תחת הגדרות גירסאות ניסיון, העבר גירסת ניסיון אחת ומחק את האחרות (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ומחק)
9. תחת הגדרות נתונים, צור חלונות דו-שיח של תוצאות . פרמטר תוצאות לכל זמן ולכל אזור. לדוגמה, צור חלון תוצאות אחד לפלט נתונים לפי דקות וחלון אחר לפלט נתונים לפי זמן כולל (6 דקות). בקש את פלט הנתונים עבור כל אזור (בקש אותו אם יש צורך במרחק בכל אזור). קשר את חלונות התוצאות השונים לחלון התחל באמצעות חצים.
10. תחת נתח הגדרות, בחר את הפרמטרים לניתוח ואת סוג הנתונים הסטטיסטיים עבור כל פרמטר. פרמטרים אלה יחושבו באופן אוטומטי בהתבסס על הנתונים המתקבלים מהמעקב.
    1. עבור NTT ו- SPT, בחר אפשרויות כמוגדר להלן:
       1. בחר מרחק שהועבר (בחר סה"כ) כדי להשיג את המרחק שעבר בזירה (cm) ואת המרחק שעבר באזורים המתאימים (cm).
       2. בחר In Zones (בחר אזורים, תדירות, מצטבר והשהיה לראשון) כדי לקבל את הזמן המושקע באזורים (ים) ואת ההשהיה לכניסה הראשונה באזורים (ים).
       3. בחר מעבר אזור (בחר סף: 0 ס"מ, הוסף אזור 1 > אזור 2; אזור 2 > אזור 1, בכל אזור, תדירות) כדי לקבל את מספר הכניסות באזורים.
       4. בחר Mobility Sate (מלא נייד גבוה מעל 70%, Immobile מתחת ל- 3%, לפחות 150 מסגרות ובחר תדירות, מצטבר והשהיה לראשון) כדי לקבל את משך הניידות הגבוהה, משך ההקפאה (ים).
          הערה: עיין בסעיף דיון לקבלת פרטים נוספים אודות קירוב התנהגות הקפאה באמצעות הניתוח האוטומטי והמספר ומשך הזמן של אפיזודות הקפאה.
       5. בחר תאוצה וזווית סיבוב (בחר תדר וצבירה) כדי להעריך את התרחשותן של התנהגויות מורכבות כגון הטלת חצים ואי יציבות (תנועות תאוצה מהירות).
    2. עבור ST, בנוסף לפרמטרים הגישוש לעיל, בחר באפשרות מרחק בין נושאים (בחר את כל הנושאים, ממוצע, מקסימום, מינימום) כדי לקבל את המרחק הממוצע בין דגים (cm), המרחק הממוצע בין השכן הקרוב ביותר (cm), ואת המרחק הממוצע בין השכן הרחוק ביותר.
11. התבנית מוכנה לשימושה. שמור את השינויים האחרונים וסגור את התבנית מבלי לרכוש נתונים מהסרטון (שמור על קובץ התבנית; הוא קל וקל לניהול ולהעתקה). אם קיימים מספר רשיונות תוכנה, נתח את סרטוני הווידאו מאותה תבנית שהועתקה לכל מחשב.
12. כדי להעתיק את התבנית ולהשתמש בה, קיימות שתי אפשרויות:
    1. פתח את קובץ התבנית באמצעות תוכנת ניתוח ההתנהגות, עבור אל File > Save as כדי ליצור קובץ זהה חדש.
    2. בממשק הפתיחה, בחר חדש מתבנית > החלת תבנית מותאמת אישית > מקובץ וידאו (בחר תבנית. קובץ EthXV). תן שם לניסוי החדש ובחר את מיקומו. התוכנה עשויה להימשך מספר דקות כדי להעתיק את המידע מקובץ התבנית.
13. עבור אל הגדרות זירה כדי להתאים מחדש את התבנית אם הסרטון הוקלט במצלמה אחרת (בצע את שלבים 4.6 ו- 4.7).
14. עבור אל הגדרות זיהוי או רכישה כדי לבדוק איזה סרטון נבחר ושנה את קובץ הווידאו במידת הצורך.
15. תחת רכישה, בחר DDS > מוכן להתחיל. ייתכן שיחלפו מספר דקות עד שהתוכנה תעבד את הסרטון.
16. בסיום הרכישה, עבור אל עורך המסלולים. בחר תאוצה x16 כדי לקרוא את הסרטון המעובד מהר יותר ולבדוק אם המעקב נכון.
    הערה: לפעמים, ייתכנו "הפסדים" במעקב (עקב השתקפויות או בלבול של התוכנה עצמה). ניתן לערוך אותם ידנית מחלק זה אם הם מעטים; אחרת, עדיף לעבד מחדש את כל הניסוי, לשפר את ההגדרה של הבד ואת האיתור.
17. תחת סטטיסטיקה, לחץ על חשב > ייצוא נתונים. ייצוא הנתונים ממוקם ישירות בתיקיית הניסוי.
18. תחת מעקב אחר פריטים חזותיים או מפות חום, צור וייצא (לחיצה ימנית, ייצוא תמונה, בחר את התיקיה ייצוא קבצים של הניסוי כדי לשמור נתונים אלה עם דוח הגיליון האלקטרוני) מעקב אחר תמונות של החיה.
19. עבור אל קובץ כדי לסגור את הניסוי הפעיל וחזור על הליך זה עבור הווידאו הבא.

5. ניתוח סטטיסטי

1. לנתח את הנורמליות (מבחן שפירא-וילק) של נתונים בכל קבוצה.
2. להעריך הומוסדסטיות עם הבדיקה של לוין.
3. השתמש ב- ANOVA חד-כיווני ואחריו במבחני ההשוואה המרובים של דנט וטוקי כדי לבדוק הבדלים בין קבוצות כאשר לא ניתן לדחות קריטריונים של נורמליות והומוסדסטיות.
4. השתמש במבחן קרוסקל-וואליס ואחריו השוואה זוגית באמצעות תיקון בונפרוני כדי לבדוק הבדלים בין קבוצות כאשר קריטריונים של נורמליות והומוסדסטיות נדחים.
5. התווה את הנתונים באמצעות תוכנה גרפית.

תוצאות

בחלק זה, נבחן כמה יישומים אפשריים של כלים התנהגותיים אלה בנוירוטוקסיקולוגיה של דגים. התוצאות הבאות תואמות את אפיון ההשפעות החריפות או הבולמוסיות של מתאמפטמין (METH), סם פנאי, ואת ההשפעות התת-כרוניות של גלייפוסט, אחד מקוטלי העשבים העיקריים הנמצאים במערכות אקולוגיות ימיות.

Discussion

התנהגויות חרדה אופייניות שנצפו ב- NTT נמצאו בקורלציה חיובית עם רמות סרוטונין שנותחו במוח²¹. לדוגמה, לאחר חשיפה לפארא-כלורופנילאלנין (PCPA), מעכב של ביוסינתזה של 5-HT, דגים הציגו גיאוטקסיס חיובי כמו גם ירידה ברמות 5-HT במוח²², תוצאות דומות מאוד לאלה שהתקבלו עם METH. לכן, הירידה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquarium Cube shape	Blau Aquaristic	7782025	Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software	Noldus	Ethovision XT	Version 12.0 or newer
GigE camera	Imaging Development Systems	UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02	GraphPad software Inc	GraphPad Prism 9.02	For Windows
IDS camera manager	Imaging Development Systems
LED backlight illumination	Quirumed	GP-G2
SPSS Software	IBM	IBM SPSS v26
uEye Cockpit software	Imaging Development Systems	version 4.90