Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine umfassende Verhaltenstestbatterie vor, einschließlich der neuartigen Aquarien-, Schwarm- und Sozialpräferenztests, um die potenziellen neurotoxischen Wirkungen von Chemikalien (z. B. Methamphetamin und Glyphosat) auf erwachsene Zebrafische mit einem einzigen Tank effektiv zu bestimmen. Diese Methode ist für die Neurotoxizität und die Umweltforschung relevant.

Zusammenfassung

Das Vorhandensein neuropathologischer Wirkungen erwies sich viele Jahre lang als Hauptendpunkt für die Beurteilung der Neurotoxizität einer chemischen Substanz. In den letzten 50 Jahren wurden jedoch die Auswirkungen von Chemikalien auf das Verhalten von Modellarten aktiv untersucht. Nach und nach wurden Verhaltensendpunkte in neurotoxikologische Screening-Protokolle integriert, und diese funktionellen Ergebnisse werden heute routinemäßig verwendet, um die potenzielle Neurotoxizität von Chemikalien zu identifizieren und zu bestimmen. Verhaltensassays bei erwachsenen Zebrafischen bieten ein standardisiertes und zuverlässiges Mittel, um eine breite Palette von Verhaltensweisen zu untersuchen, darunter Angstzustände, soziale Interaktion, Lernen, Gedächtnis und Sucht. Verhaltenstests bei erwachsenen Zebrafischen beinhalten in der Regel, dass die Fische in eine Versuchsarena gesetzt und ihr Verhalten mit Hilfe von Video-Tracking-Software aufgezeichnet und analysiert wird. Fische können verschiedenen Reizen ausgesetzt sein, und ihr Verhalten kann mit einer Vielzahl von Metriken quantifiziert werden. Der neuartige Aquarientest ist einer der am meisten akzeptierten und am weitesten verbreiteten Tests zur Untersuchung von angstähnlichem Verhalten bei Fischen. Die Schwarm- und Sozialpräferenztests sind nützlich, um das Sozialverhalten von Zebrafischen zu untersuchen. Dieser Assay ist besonders interessant, da das Verhalten des gesamten Schwarms untersucht wird. Diese Assays haben sich als hochgradig reproduzierbar und empfindlich gegenüber pharmakologischen und genetischen Manipulationen erwiesen, was sie zu wertvollen Werkzeugen für die Untersuchung der neuronalen Schaltkreise und molekularen Mechanismen macht, die dem Verhalten zugrunde liegen. Darüber hinaus können diese Assays im Arzneimittel-Screening verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die potenzielle Modulatoren des Verhaltens sein können.

In dieser Arbeit werden wir zeigen, wie Verhaltenswerkzeuge in der Neurotoxikologie von Fischen angewendet werden können, indem wir die Wirkung von Methamphetamin, einer Freizeitdroge, und Glyphosat, einem Umweltschadstoff, analysieren. Die Ergebnisse zeigen den signifikanten Beitrag von Verhaltensassays in erwachsenen Zebrafischen zum Verständnis der neurotoxikologischen Wirkungen von Umweltschadstoffen und Medikamenten und liefern Einblicke in die molekularen Mechanismen, die die neuronale Funktion verändern können.

Einleitung

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist eine beliebte Modell-Wirbeltierart für Ökotoxikologie, Arzneimittelforschung und sicherheitspharmakologische Studien. Seine geringen Kosten, die gut etablierten molekulargenetischen Werkzeuge und die Konservierung wichtiger physiologischer Prozesse, die an der Morphogenese und Aufrechterhaltung des Nervensystems beteiligt sind, machen den Zebrafisch zu einem idealen Tiermodell für die neurowissenschaftliche Forschung, einschließlich der neurobehavioralen Toxikologie ^1,2. Der Hauptendpunkt für die Bewertung der Neurotoxizität einer Chemikalie war bis vor kurzem das Vorhandensein neuropathologischer Wirkungen. In jüngster Zeit wurden jedoch Verhaltensendpunkte in neurotoxikologische Screening-Protokolle aufgenommen, und diese funktionellen Ergebnisse werden heute häufig verwendet, um die potenzielle Neurotoxizität von Chemikalien zu identifizieren und zu bestimmen ^3,4. Darüber hinaus sind Verhaltensendpunkte aus ökologischer Sicht von hoher Relevanz, da bereits eine sehr leichte Verhaltensänderung bei Fischen das Überleben des Tieres unter natürlichen Bedingungen gefährden könnte⁵.

Einer der am häufigsten verwendeten Verhaltenstests in der adulten Zebrafischforschung ist der neuartige Tanktest (NTT), der angstähnliches Verhalten misst ^6,7. In diesem Assay werden die Fische einer Neuheit ausgesetzt (Fische werden in ein unbekanntes Becken gesetzt), einem milden aversiven Reiz und ihre Verhaltensreaktionen beobachtet. NTT wird hauptsächlich zur Beurteilung der basalen Bewegungsaktivität, Geotaxis, des Einfrierens und der unberechenbaren Bewegungen von Fischen verwendet. Findling⁸ ist gekennzeichnet durch abrupte Richtungswechsel (Zickzack) und wiederholte Beschleunigungsepisoden (Darting). Es handelt sich um eine Alarmreaktion, die in der Regel vor oder nach dem Einfrieren beobachtet wird. Das Gefrierverhalten entspricht einer vollständigen Einstellung der Bewegungen des Fisches (mit Ausnahme der operkulären und okulären Bewegungen) auf dem Boden des Beckens, im Unterschied zu einer durch Sedierung verursachten Immobilität, die Hypolokomotion, Akinesie und Sinken verursacht⁸. Frieren ist in der Regel mit einem hohen Stress- und Angstzustand verbunden und gehört auch zum unterwürfigen Verhalten. Komplexe Verhaltensweisen sind hervorragende Indikatoren für den Angstzustand von Tieren. Es hat sich gezeigt, dass NTT empfindlich auf pharmakologische und genetische Manipulation reagiert⁹, was es zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der neuronalen Grundlagen von Angstzuständen und verwandten Störungen macht.

Zebrafische sind eine sehr soziale Spezies, so dass wir ein breites Spektrum an sozialem Verhalten messen können. Der Shoaling-Test (ST) und der Social Preference Test (SPT) sind die am häufigsten verwendeten Assays zur Beurteilung des Sozialverhaltens¹⁰. Der ST misst die Neigung von Fischen, sich zu gruppieren¹¹, indem er ihr räumliches Verhalten und ihre Bewegungsmuster quantifiziert. ST ist nützlich, um Gruppendynamik, Führung, soziales Lernen und das Verständnis des Sozialverhaltens vieler Fischarten zu untersuchen¹². Der SPT bei erwachsenen Zebrafischen wurde von Crawleys Präferenz für den sozialen Neuheitstest für Mäuse übernommen¹³ und wurde schnell zu einem beliebten Verhaltenstest für die Untersuchung der sozialen Interaktion bei dieser Modellspezies¹⁴. Diese beiden Tests wurden auch für den Einsatz in Drogenscreening-Assays angepasst und haben sich als vielversprechend für die Identifizierung neuer Verbindungen erwiesen, die das Sozialverhalten modulieren^15,16.

Im Allgemeinen sind Verhaltensassays bei erwachsenen Zebrafischen leistungsfähige Werkzeuge, die wertvolle Informationen über die Verhaltensmechanismen oder die Neurophänotypen von Wirkstoffen und missbrauchten Medikamenten liefern können¹⁷. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie diese Verhaltenswerkzeuge⁷ mit grundlegenden materiellen Ressourcen implementiert werden und wie sie in Toxizitätsassays angewendet werden, um die Auswirkungen einer Vielzahl neuroaktiver Verbindungen zu charakterisieren. Darüber hinaus werden wir sehen, dass die gleichen Tests angewendet werden können, um die neurologischen Auswirkungen einer akuten Exposition gegenüber einer neuroaktiven Verbindung (Methamphetamin) zu bewerten, aber auch, um diese Auswirkungen nach chronischer Exposition gegenüber Umweltkonzentrationen eines Pestizids (Glyphosat) zu charakterisieren.

Protokoll

Die strikte Einhaltung ethischer Standards garantiert das Wohlergehen und die richtige Behandlung der Zebrafische, die für die Experimente verwendet werden. Alle Versuchsverfahren wurden nach den Richtlinien der Institutional Animal Care and Use Committees (CID-CSIC) durchgeführt. Die unten dargestellten Protokolle und Ergebnisse wurden unter der von der lokalen Regierung erteilten Lizenz (Vertragsnummer 11336) durchgeführt.

1. Tierhaltung für Verhaltenstests

1. Führen Sie alle Tests (siehe Abbildung 1) in einem isolierten Verhaltensraum bei 27-28 °C zwischen 10:00 und 17:00 Uhr durch.
2. Waschen Sie sowohl Kontrollfische als auch exponierte Fische mehrmals in sauberem Fischwasser [Umkehrosmose-gereinigtes Wasser mit 90 mg/l Aquariensystemsalz, 0,58 mM CaSO_{4,2H 2O}und 0,59 mM NaHCO₃], bevor Sie mit den Experimenten beginnen, um eine mögliche Kontamination des Versuchsbeckens zu vermeiden.
3. Akklimatisieren Sie die Tiere 1 Stunde vor Beginn der Versuche im Verhaltensraum.
4. Stellen Sie sicher, dass die Tiere (≈50:50 Verhältnis Männchen zu Weibchen) experimentell naiv sind und führen Sie alle Verhaltenstests blind durch, wobei die Beobachter die Versuchsgruppe nicht kennen.
5. Um aussagekräftige Ergebnisse in Verhaltensassays zu erhalten, sollten Sie eine Gesamtzahl von 18 Probanden pro Bedingung (n = 18) verwenden, die idealerweise zwischen zwei oder mehr unabhängigen Experimenten gewonnen werden. Analysieren Sie beispielsweise in einzelnen Tests das Verhalten von 9 Tieren pro Bedingung, pro Replikation. Analysieren Sie in Gruppentests das Verhalten eines Schwarms von 6 bis 9 Tieren pro Bedingung, pro Wiederholung.
6. Führen Sie alle Tests nach einem Batterietestansatz durch (siehe Planungsvorschläge in Abbildung 2). Diese Methode ist ethisch besser geeignet und ermöglicht es, die Anzahl der für die Studie benötigten Tiere zu reduzieren, wobei das 3R-Reduktionsprinzip^{eingehalten wird 7}.
7. In den meisten Fällen sind Verhaltenstests mit biologischen Tests verbunden, daher sollten die Tiere gemäß den Euthanasie-Richtlinien¹⁸ geopfert werden, bevor Proben (OMICs oder Chemikalien) entnommen und analysiert werden. Wenn sich herausstellt, dass es sich bei dem Endpunkt nicht um eine Stichprobe handelt, wird die Kontrollgruppe am Ende des Experiments erneut stabilisiert. Verwenden Sie die Kontrolltiere nach einigen Tagen wieder für Zucht- oder Versuchszwecke.

Abbildung 1: Versuchsaufbauten. Drei Konfigurationen des quadratischen Aquariums, um ein breites Spektrum an Verhaltensweisen bei erwachsenen Zebrafischen zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Experimenteller Zeitplan. Zwei Planungsvorschläge für die Aufzeichnung von Verhaltensassays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Experimentelle Konfigurationen des Tanks

1. Angstähnliches Verhalten: Der neuartige Panzertest (NTT)
   1. Passen Sie den Versuchsaufbau (Anzahl der Aquarien, Kameras und Computer) an, um die maximale Anzahl von Fischen gleichzeitig zu erfassen. Individuelle Verhaltenstests sind zeitaufwändig, daher sollten Zeit, Material und Platz optimiert werden.
   2. Bereiten Sie die Versuchsbecken für NTT vor: Quadratischer Tank (20 cm Länge, 20 cm Breite, 25 cm Höhe), der an den Seitenwänden und am Boden mit Acrylplatten bedeckt ist, um Reflexionen und Interferenzen zwischen den Probanden zu vermeiden.
   3. Füllen Sie die Versuchsbecken mit 7 l (Wassersäulenhöhe: 20 cm Höhe) gut sauerstoffreichem Fischwasser bei 28 °C.
   4. Passen Sie die Position des Tanks vor der Kamera an, um ein verzerrtes Bild zu vermeiden.
   5. Überprüfen Sie die Beleuchtungseinstellung. Die LED-Hintergrundbeleuchtung (10000 Lux) sorgt für eine homogene Ausleuchtung des gesamten Tanks für Videoaufnahmen unter guten Bedingungen.
   6. Schalten Sie die Kameras ein und stellen Sie sie gemäß Abschnitt 3 ein.
   7. Führe die Versuchspersonen nacheinander in den Boden der Versuchstanks ein, bevor du so schnell wie möglich mit der Aufnahme beginnst.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Aufnahme mit dem Tier am Boden des Aquariums zu beginnen.
   8. Achten Sie darauf, die Tiere während der Aufnahme nicht zu stören. Verwendung eines Vorhangs oder einer Paneele, um die visuelle Interaktion nicht nur zwischen den Tanks, sondern auch zwischen der Stütze und der Außenseite zu begrenzen.
   9. Am Ende der Aufzeichnung (Standardaufzeichnungszeit beträgt 6 Minuten) werden die Tiere, die den Test bereits durchlaufen haben, in ein anderes Becken umgefüllt, um sie nicht mit den naiven Tieren zu vermischen.
   10. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen verfügbaren Probanden. Es ist ratsam, eine Gesamtanzahl von 18 Probanden pro Bedingung zu haben, um aussagekräftige Ergebnisse in einzelnen Studien (aus zwei oder mehr unabhängigen Replikaten) zu erhalten.
   11. Randomisieren Sie die Experimentalgruppe, die jedem Panzer zwischen den Versuchen zugewiesen ist, um mögliche Tankeffekte zu vermeiden (wenn Sie mehrere Bedingungen gleichzeitig aufzeichnen).
2. Soziales Gruppenverhalten: Der Shoaling-Test (ST)
   1. Die experimentelle Konfiguration von ST ist die gleiche wie die von NTT (die gleichen Tanks können direkt wiederverwendet werden).
   2. Befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.6. , um die ST.
   3. Führen Sie den Schwarm (6 bis 9 Probanden gleichzeitig) am Boden der Versuchsbecken ein, bevor Sie so schnell wie möglich mit der Aufnahme beginnen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Aufnahme mit dem Tier am Boden des Aquariums zu beginnen.
   4. Befolgen Sie die Schritte 2.1.8-2.1.11. , um die ST.
   5. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen verfügbaren Probanden. Um aussagekräftige Ergebnisse in diesem Assay zu erhalten, führen Sie in jedem Replikat mindestens zwei unabhängige Replikate mit der gleichen Bankgröße durch.
   6. Halten Sie die Größe des Schwarms für alle Versuchsgruppen und Replikate innerhalb desselben Experiments konstant.
3. Soziales individuelles Verhalten: Der Social Preference Test (SPT)
   1. Passen Sie den Versuchsaufbau an, um den experimentellen Raum und die Zeit der Aufnahme zu optimieren.
   2. Bereiten Sie die Versuchsbehälter für SPT vor: Quadratischer Tank (20 cm Länge, 20 cm Breite, 25 cm Höhe) transparent (Glas oder Kunststoff), um seitliche Sicht zu bieten. Dem einzelnen Fokusfisch steht es frei, mit einer konspezifischen virtuellen Zone zu interagieren - einem Fischschwarm, der in das einseitige externe Gehäusebecken gestellt wird, oder mit der unspezifischen virtuellen Zone - einem einseitigen externen leeren Gehäusetank.
   3. Füllen Sie die Versuchsbecken mit 5 L (Wassersäulenhöhe: 15 cm, gleiche Höhe wie die Wassersäule in den Außengehäusebecken) sauberem Fischwasser bei 28 °C.
   4. Passen Sie die Position des Tanks vor der Kamera an, um ein verzerrtes Bild zu vermeiden.
   5. Prüfen Sie, ob das System eine homogene Beleuchtung erhält.
   6. Führe die Versuchspersonen, einen nach dem anderen, in den Boden der Versuchsbecken ein, bevor du sofort mit der Aufnahme beginnst, wobei das Tier unten in der Mitte steht.
   7. Vermeiden Sie visuelle Interaktionen zwischen Beobachtern und Tieren während der Aufnahme.
   8. Am Ende der 6-minütigen Aufnahme setzen Sie die anwesenden Tiere in ein anderes Becken um, um sie nicht mit den naiven Tieren zu vermischen.
   9. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen verfügbaren Probanden. Sie müssen eine Gesamtzahl von 18 Probanden pro Bedingung haben, um aussagekräftige Ergebnisse in einzelnen Studien (aus zwei oder mehr unabhängigen Replikaten) zu erhalten.

3. Videoaufzeichnung für Verhaltenstests

1. Öffnen Sie den Kamera-Manager, um die Verfügbarkeit der GigE-Kamera auf jedem Computer zu überprüfen.
2. Starten Sie die GigE-Kamerasteuerungssoftware (z. B. uEye Cockpit, hier beschrieben). Öffnen Sie die Option Kamera , wählen Sie den Monochrommodus und passen Sie die Bildgröße an (1:2).
3. Kameraeigenschaften öffnen
   1. Stellen Sie unter "Kamera" den Pixeltakt auf "Maximum" ein, stellen Sie die Bildrate auf 30 Bilder pro Sekunde (fps) ein und passen Sie die Belichtung an (automatisch oder manuell anpassen, wenn das Bild zu dunkel ist).
   2. Stellen Sie unter Bild die Verstärkung auf 0 (Auto) und die Schwarzwerte (Auto oder Manuelle Anpassung, um einen guten Kontrast zu erzielen).
   3. Passen Sie unter Größe die Größe des Fensters an den Bereich an, der graviert werden soll (Breite: Breite-Links, Höhe: Höhe-Oben). Dieser Schritt ermöglicht es, die Größe des Bildes und damit die endgültige Größe des Videos zu reduzieren.
   4. Schließen Sie die Kameraeigenschaften.
4. Erstellen Sie einen allgemeinen Ordner für die Experimentsitzung, um die Kameraeinstellungen und Videos zu speichern.
5. Um die Kameraeinstellungen zu speichern, legen Sie Datei > Parameter speichern > auf Datei fest, und wählen Sie den kürzlich erstellten Experimentordner aus.
   HINWEIS: Die Kameraeinstellungsdatei kann somit in der Anwendung neu geladen werden, um jederzeit mit den gleichen Bildparametern weiterzuarbeiten (z.B. wenn die Kamera plötzlich ausgeschaltet wird oder um die gleichen Einstellungen wiederzuverwenden, wodurch die Rüstzeit verkürzt und die Versuchsbedingungen homogenisiert werden). Wenn die Kamera in einem Moment zwischen den Videos einfriert, beenden Sie die Aufnahme, beenden Sie die Kamera und schalten Sie sie aus. Schalten Sie es wieder ein, laden Sie die Kameraparameter neu, indem Sie zu Datei > Parameter laden > in Datei gehen, und starten Sie die Aufnahme erneut. Überprüfen Sie, ob das aktuelle Video vollständig aufgenommen wurde, um den Fisch zu verwerfen oder zu wiederholen (geben Sie den Tieren vor der Wiederholung etwas Zeit, sich wieder zu akklimatisieren).
6. Wiederholen Sie diesen Kamera-Setup-Vorgang (Schritte 3.1-3.5) auf allen Kameras.
7. Wenn alle Kameras korrekt konfiguriert sind, öffnen Sie die Option "Videosequenz aufnehmen".
8. Wählen Sie Erstellen aus , um die Datei als neue Videodatei zu speichern, wählen Sie den kürzlich erstellten Experimentordner aus, und geben Sie im Namen der Videodatei die Informationen zum Thema, die Art des Experiments und das Datum an.
9. Wählen Sie Max. Frames aus. Geben Sie 10800 in die Rahmenbox ein. Standardvideo ist die Aufnahme von 6 Minuten (Video 1) bei 30 fps im AVI-Format; Daher 6 min x 60 s x 30 fps = 10800 Bilder insgesamt.
10. Wählen Sie "Bildrate berechnen " oder geben Sie die Bildrate manuell an (Aufnahmegeschwindigkeit: 30 fps).
11. Wiederholen Sie den Vorgang zur Erstellung der Videodatei auf allen Computern.
12. Stellen Sie die Versuchspersonen nacheinander am Boden jedes Versuchsbeckens vor. Alle Assays werden gleichzeitig durchgeführt.
13. Starten Sie die Aufzeichnungen schnell, indem Sie auf Aufzeichnen klicken und warten, bis Sie die maximale Anzahl der angeforderten Frames erhalten (Schritt 3.10).
14. Sobald die Videos aufgenommen wurden, erscheint ein Chat-Fenster mit der Meldung Maximale Anzahl von Bildern erreicht!. Wählen Sie Akzeptieren aus.
15. Wählen Sie Schließen , um die Aufnahme zu beenden und die Videodatei zu schließen.
16. Entferne die Fische, die du gerade beobachtet hast. Achte darauf, sie von den naiven Fischen zu trennen.
17. Wählen Sie direkt Erstellen aus und wiederholen Sie den Vorgang, um mit der Aufnahme von Videos fortzufahren.
18. Sobald alle Aufnahmen abgeschlossen sind, wählen Sie Beenden aus.
19. Um die Kameras auszuschalten, wählen Sie Kamera schließen und Programm beenden .

4. Analyse der aufgezeichneten Videos

1. Starten Sie die Analysesoftware (siehe Materialtabelle).
2. Um eine neue Vorlage zu erstellen, klicken Sie auf Neu aus Vorlage > Angewendete vordefinierte Vorlage > aus Videodatei und wählen Sie ein Video aus, um mit der Einrichtung der Vorlage zu beginnen. Versuchen Sie, ein repräsentatives Video des Experiments mit einer Versuchsperson auszuwählen, die eine gute Beweglichkeit und gute Aufnahmebedingungen aufweist.
3. Konfigurieren Sie unter Parameter die Parameter in den folgenden Fenstern (1 bis 4/7). Wählen Sie das Modell Fisch > ausgewachsener Zebrafisch, die Arena Open Field Square > One Arena, die Anzahl der Motive pro Arena (für die ST ist ein Multi-Tracking-Paket erforderlich [Verfolgen Sie verschiedene Motive in einer Arena], die Art der Erkennung durch Center-Point und passen Sie schließlich die Bildrate auf 30 fps an. Ändern Sie in den folgenden Fenstern (5 bis 7/7) die Parameter nicht. Die Standardkonfiguration ist OK.
4. Benennen Sie das Experiment als Vorlage und legen Sie es im selben Ordner wie den Rest des gespeicherten Videos ab. Die Vorlage wird als Experimentordner mit mehreren Unterteilungen erstellt, die alle Setup-Informationen enthalten.
5. Überprüfen Sie unter Experimenteinstellungen das definierte Setup (aus Videodatei, Arena, Anzahl der Probanden, Bild pro Sekunde). Hier können die Systemeinheiten modifiziert werden.
6. Klicken Sie unter Arena-Einstellungen mit der rechten Maustaste auf die Mitte des Bildschirms und wählen Sie Grab. Aus Datei in der Anzeige. Wählen Sie ein Videobild in guter Qualität und klicken Sie auf Akzeptieren , um dieses Bild für die Hintergrundeinstellungen aufzunehmen. Kalibrieren Sie zunächst das Bild, und generieren Sie eine kalibrierte Regel. Verwenden Sie die Breite des Tanks als Maßstab (19 cm). Zeichne dann die Arena. Achten Sie darauf, dass das Quadrat gerade so groß ist, dass die Reflexionen des Tieres vermieden werden, wenn es sich der Oberfläche nähert, oder eine eventuelle Verwechslung der Fischsoftware mit den schwarzen Bereichen des Aquariums. Zum Schluss zeichnen Sie die Formzonen mit der Funktion Rahmen .
   1. Unterteilen Sie für NTT und ST die Vorderseite des Tanks in zwei gleiche virtuelle Zonen, oben und unten (siehe Abbildung 1). Zeichne zwei gleiche horizontale Kästchen. Die Boxen decken jeweils eine halbe Arena ab. Benennen Sie Top und Bottom für die obere bzw. untere Zone. Achten Sie darauf, dass die Boxen die gleiche Breite (9-10 cm) und Länge (8-9 cm) haben, die Arenagrenzen nicht überschreiten (orangefarbenes Quadrat) und sich nicht überlappen, und achten Sie darauf, dass jede Pfeilzone genau ihre Zonen angibt.
   2. Unterteilen Sie für SPT die Experimentierarena konzeptionell in drei gleich große Zonen: leer, zentriert und konspezifisch (siehe Abbildung 1). Zeichne drei gleiche vertikale Kästchen. Benennen Sie die Box, die auf den Schwarmtank ausgerichtet ist, als Conspecific, die Box, die auf den leeren Tank ausgerichtet ist, als Leer und die mittlere als Mitte. Achten Sie darauf, dass die Boxen die gleiche Breite (6 cm) und Länge (18-19 cm) haben, die Arenagrenzen nicht überschreiten und sich nicht überlappen.
7. Überprüfen Sie unter Erkennungseinstellungen, welches Video in der Videodatei behandelt werden soll. Prüfen Sie dann die Erkennungsqualität (Fisch in gelb, roter Mittelpunkt). Klicken Sie auf Automatische Erkennung , um die Erkennung anzupassen und das Tier neu zu fokussieren (wählen Sie ein Bild, auf dem das Tier im Profil auf dem weißen Hintergrund schwimmt, zeichnen Sie das Bild, indem Sie seinen gesamten Körper aufnehmen, und bestätigen Sie die Erkennung mit Ja). Öffnen Sie " Erweitert ", um die Erkennung zu verbessern, indem Sie "Dynamische Subtraktion", "Dunkleres Motiv", "Hintergrundeinstellungen", "Hintergrundlernen", "Motivgröße", "Rauschunterdrückung" usw. auswählen.
8. Legen Sie unter Testeinstellungen eine Testversion ab und löschen Sie die anderen (Rechtsklick und Löschen)
9. Erstellen Sie unter Dateneinstellungen Dialogfenster für Ergebnisse. Parametrisieren Sie die Ergebnisse pro Zeit und pro Zone. Erstellen Sie z. B. ein Ergebnisfenster für die Datenausgabe nach Minuten und ein weiteres für die Datenausgabe nach Gesamtzeit (6 Minuten). Fordern Sie die Datenausgabe für jede Zone an (fordern Sie sie an, wenn die Entfernung in jeder Zone benötigt wird). Verknüpfen Sie die verschiedenen Ergebnisfenster mit Pfeilen mit dem Startfenster.
10. Wählen Sie unter Analyseeinstellungen die zu analysierenden Parameter und den Statistiktyp für jeden Parameter aus. Diese Parameter werden automatisch auf der Grundlage der aus dem Tracking gewonnenen Daten berechnet.
    1. Wählen Sie für NTT und SPT die folgenden Optionen aus:
       1. Wählen Sie Zurückgelegte Distanz ( wählen Sie Gesamt), um die in der Arena zurückgelegte Distanz (cm) und die in den jeweiligen Zonen zurückgelegte Distanz (cm) zu erhalten.
       2. Wählen Sie In Zonen (wählen Sie Zonen, Frequenz, Kumulativ und Latenz auf Erste), um die in den Zonen verbrachte Zeit und die Latenz bis zum ersten Eintritt in die Zonen (Zonen) anzuzeigen.
       3. Wählen Sie den Zonenübergang (wählen Sie Schwellenwert: 0 cm, Zone 1 hinzufügen > Zone 2; Zone 2 > Zone 1, in allen Zonen, Frequenz), um die Anzahl der Eingänge in den Zonen zu erhalten.
       4. Wählen Sie Mobility Sate (füllen Sie Hoch mobil über 70%, Immobil unter 3%, mindestens 150 Frames aus und wählen Sie Frequenz, kumulativ und Latenz auf zuerst), um die Dauer der Hypermobilität(en) und die Dauer des Einfrierens (s) anzuzeigen.
          HINWEIS: Weitere Informationen zur Annäherung an das Einfrierverhalten mithilfe der automatisierten Analyse sowie zur Anzahl und Dauer der Einfrierepisoden finden Sie im Abschnitt Diskussion.
       5. Wählen Sie Beschleunigung und Drehwinkel (Frequenz und kumulativ auswählen), um das Auftreten komplexer Verhaltensweisen wie Pfeile und Unregelmäßigkeiten (schnelle Beschleunigungsbewegungen) zu bewerten.
    2. Wählen Sie für den ST zusätzlich zu den oben genannten Erkundungsparametern die Option Abstand zwischen Subjekten (wählen Sie alle Subjekte aus, Mittelwert, Maximum, Minimum), um den durchschnittlichen Abstand zwischen Fischen (cm), den durchschnittlichen Abstand zwischen dem nächsten Nachbarn (cm) und den durchschnittlichen Abstand zwischen dem am weitesten entfernten Nachbarn zu erhalten.
11. Die Vorlage ist einsatzbereit. Speichern Sie die letzten Änderungen und schließen Sie die Vorlage, ohne Daten aus dem Video zu übernehmen (behalten Sie die Vorlagendatei bei; sie ist leicht und einfach zu verwalten und zu kopieren). Wenn mehrere Softwarelizenzen vorhanden sind, analysieren Sie die Videos aus derselben Vorlage, die auf jeden Computer kopiert wurde.
12. Um die Vorlage zu kopieren und zu verwenden, gibt es zwei Möglichkeiten:
    1. Öffnen Sie die Vorlagendatei mit der Verhaltensanalyse-Software, gehen Sie zu Datei > Speichern unter , um eine neue identische Datei zu erstellen.
    2. Wählen Sie in der Willkommensoberfläche Neu aus Vorlage > Benutzerdefinierte Vorlage angewendet > aus Videodatei ( Vorlage auswählen. EthXV-Datei). Benennen Sie das neue Experiment, und wählen Sie seinen Speicherort aus. Es kann einige Minuten dauern, bis die Software die Informationen aus der Vorlagendatei kopiert hat.
13. Gehen Sie zu den Arena-Einstellungen , um die Vorlage anzupassen, wenn das Video mit einer anderen Kamera aufgenommen wurde (befolgen Sie die Schritte 4.6 und 4.7).
14. Gehen Sie zu Erkennungseinstellungen oder Erfassung , um zu überprüfen, welches Video ausgewählt ist, und ändern Sie die Videodatei bei Bedarf.
15. Wählen Sie unter Akquisition die Option DDS > Ready to Start aus. Es kann einige Minuten dauern, bis die Software das Video verarbeitet hat.
16. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, wechseln Sie zum Spur-Editor. Wählen Sie Beschleunigung x16, um das verarbeitete Video schneller zu lesen und zu überprüfen, ob das Tracking korrekt ist.
    HINWEIS: Manchmal kann es zu "Verlusten" bei der Nachverfolgung kommen (aufgrund von Reflexionen oder Verwechslungen der Software selbst). Sie können von diesem Teil aus manuell bearbeitet werden, wenn es nur wenige sind. Andernfalls ist es vorzuziehen, das gesamte Experiment erneut zu verarbeiten, um die Definition der Leinwand und die Detektion zu verbessern.
17. Klicken Sie unter Statistik auf Daten berechnen > exportieren. Der Datenexport befindet sich direkt im Experimentordner.
18. Generieren und exportieren Sie unter Track-Visualisierung oder Heatmaps (Rechtsklick, Bild exportieren, wählen Sie den Ordner Dateien des Experiments exportieren , um diese Daten mit dem Tabellenkalkulationsbericht zu speichern) Tracking-Bilder des Tieres.
19. Wechseln Sie zu Datei , um das aktive Experiment zu schließen , und wiederholen Sie diesen Vorgang für das nächste Video.

5. Statistische Analyse

1. Analysieren Sie die Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test) der Daten in jeder Gruppe.
2. Beurteilen Sie die Homoskedastik mit dem Levene-Test.
3. Verwenden Sie die unidirektionale ANOVA, gefolgt von den multiplen Vergleichstests von Dunnett und Tukey, um Unterschiede zwischen Gruppen zu testen, wenn Kriterien der Normalität und Homoskedastizität nicht zurückgewiesen werden können.
4. Verwenden Sie den Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von einem paarweisen Vergleich mit der Bonferroni-Korrektur, um Unterschiede zwischen Gruppen zu testen, wenn Kriterien der Normalität und Homoskedastizität abgelehnt werden.
5. Zeichnen Sie die Daten mit einer grafischen Software auf.

Ergebnisse

In diesem Abschnitt werden wir uns einige mögliche Anwendungen dieser Verhaltenswerkzeuge in der Neurotoxikologie von Fischen ansehen. Die folgenden Ergebnisse korrespondieren mit der Charakterisierung der akuten oder Binge-Wirkungen von Methamphetamin (METH), einer Freizeitdroge, und den subchronischen Wirkungen von Glyphosat, einem der wichtigsten Herbizide in aquatischen Ökosystemen.

Charakterisierung eines Methamphetamin-Binge-Neurotoxizitätsmodells in adulten Zebrafischen

Diskussion

Charakteristisches Angstverhalten, das bei NTT beobachtet wurde, wurde positiv mit dem Serotoninspiegel korreliert, der im Gehirn analysiert wurde²¹. Zum Beispiel zeigten Fische nach der Exposition gegenüber para-Chlorphenylalanin (PCPA), einem Inhibitor der 5-HT-Biosynthese, positive Geotaxis sowie verminderte 5-HT-Spiegel im Gehirn²², Ergebnisse, die denen mit METH sehr ähnlich sind. Daher deutet die Abnahme des Serotoninspiegels im Gehirn und die Anzeige positiver Geot...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquarium Cube shape	Blau Aquaristic	7782025	Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software	Noldus	Ethovision XT	Version 12.0 or newer
GigE camera	Imaging Development Systems	UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02	GraphPad software Inc	GraphPad Prism 9.02	For Windows
IDS camera manager	Imaging Development Systems
LED backlight illumination	Quirumed	GP-G2
SPSS Software	IBM	IBM SPSS v26
uEye Cockpit software	Imaging Development Systems	version 4.90