岭南火针疗法治疗骨质疏松模式大鼠的操作流程及注意事项

摘要

在这里，我们提出了一个 Lingnan Fire-Needle 疗法在骨质疏松症模型大鼠干预中的应用方案。

摘要

与丝状针疗法相比，火针疗法既有针的刺激，又有热的温热作用，使其对一些慢性病和疑难杂症产生了意想不到的效果。骨质疏松症 （OP） 在绝经后女性和中老年男性中发病率高，治疗周期长。根据中医 （TCM） 的说法，岭南火针疗法在治疗骨质疏松症方面显示出潜力。然而，要得到广泛应用，还有很长的路要走。本文重点介绍岭南火针疗法在大鼠 OP 干预中的应用。它涵盖了针工具的选择、穴位的选择、大鼠身体的定位和固定方法。我们还概述了使用火针针刺期间和之后应采取的步骤和预防措施。实验分为 3 组：正常组、模型组和火针组，每组 10 只大鼠。火针组大鼠接受火针干预治疗 6 个疗程。干预期后，我们收集股骨标本并进行显微 CT 扫描。结果表明，火针可以增强 OP 大鼠的骨形态和矿物质密度。这些信息可以作为进行火针疗法基础研究的方法论基础。

引言

中医认为，气候、环境等因素会影响人的体质，进而影响疾病的发生和发展。中国的岭南地区，主要包括广东、广西和海南岛，位于热带季风气候区。因此，长期居住在该地区的人容易出现一种形式的脾虚。在某些情况下，它会扩散到肾脏和肝脏，导致骨质疏松症¹ 的患病率。脾胃的作用是运输和吸收水和谷物，这是气血生化的来源，而肝脏则帮助维持马脾。因此，骨骼营养依赖于脾、胃和肝脏的供应。在中医中，肾脏能够产生骨髓和强健骨骼，其生命力直接影响骨骼的强度和功能。因此，肾虚与骨质疏松症直接相关。根据中医的说法，肝（甘）肾（神）虚和缺精（精）是根本原因。在某些情况下，营养不良可能是由于脾 （Pi） 和胃 （Wei） 缺乏或两者失衡而发生的。也就是说，肝虚（甘）、肾（神）、脾（Pi）、胃（Wei）是根本原因，而外气（Xie Qi）则阻塞经络，损害骨骼和肌肉。根据世界卫生组织 （WHO） 的说法，OP 是一种以低骨量和组织退化² 为特征的疾病，这是老年人非常关心的问题。选择合适的干预措施对于预防和治疗骨质疏松症至关重要。

现代针灸师结合岭南的气候和岭南人的身体特征，发展出独特的岭南特色火针疗法³。火针疗法是将特殊的针头烧成红色，迅速刺入人体的特定部位或穴位，以治疗各种疾病的一种治疗方法。该方法广泛用于皮肤病、肌肉骨骼和关节疾病、神经系统疾病和其他全身性疾病，并显示出良好的疗效⁴.用火针治疗骨质疏松症在临床上已经使用了很长时间，它比单纯的针灸或口服中药具有更好的疗效 ^5,6,7。岭南火针疗法结合了针灸、三戊针和疤痕艾灸。它可以改善经络中的气血循环，同时暖肾。这种治疗可以解决血瘀和肾（神）虚，这导致了中医 OP 的发病机制。更重要的是，它具有成本低、见效快、治疗时间短、安全性好等优点。然而，对其机制缺乏研究。本文介绍了岭南火针在骨质疏松模型大鼠中的具体操作方法，并为开展相关基础研究提供了方法学依据。

研究方案

所有实验均按照美国国立卫生研究院 - 实验动物护理和使用指南进行，并得到湖北中医药大学 - 机构动物护理和使用委员会的批准。采用体重 220 ± 20 g 的成年雌性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠进行试验。所有大鼠均在 23 ± 1 °C 和 40%-50% 湿度下维持 12 小时的光照/黑暗循环，可自由获取食物和水。

1. 术前准备

1. 组设计
   1. 对 30 只 3 个月大的雌性大鼠进行基因分型后，将它们随机分为三组 （每组 n = 10）：正常组、模型组和火针组。用火针干预治疗火针组中的大鼠，每天 1 次，持续 6 次，两次之间休息 1 天。
      注意：正常组和模型组按照与火针组相同的频率和相同的持续时间将用安全外套束缚的大鼠悬浮起来，但没有火针处理。
2. 大鼠骨质疏松模型的制备
   1. 对于模型组和火针组的大鼠，手术切除卵巢以建立骨质疏松症模型，如 ^8,9,10 所述。
      1. 对于卵巢切除术，术前腹膜内注射 2% 戊巴比妥钠 （0.2 mL/100 g） 进行麻醉，当动物在手术麻醉平面内无反应时，由于脚趾捏试验无反应，认为麻醉成功。在麻醉下在眼睛上使用兽医软膏以防止干燥。手术前皮下注射丁丙诺啡 （0.05 mg/kg） 作为镇痛剂。在操作过程中保持无菌条件。
         注意：如果手术尚未完成且大鼠出现复苏迹象，可暂时适当补充腹腔注射 2% 戊巴比妥钠溶液，每次补充剂量不超过注射总量的 20%。
      2. 手术后，将大鼠放在小动物加热垫上，并将温度设置为 32 °C。 不要让老鼠无人看管，直到它们恢复意识并可以自由爬行。在它们完全康复之前，不要将它们送回其他动物的陪伴处。
      3. 当老鼠苏醒时，检查缝合线的完整性，并将老鼠放回笼子里。向所有大鼠肌肉注射青霉素钠（每天 50,000 U，持续 3 天），并腹膜内注射 0.1 mL 0.05% 双氯芬酸钠溶液（每天，持续 3 天）以防止感染并加速愈合 ^9,10。
   2. 根据¹¹ 中描述的雌性大鼠阴道脱落细胞涂片观察发情周期。如果循环无序，则模型建立成功¹¹.
      注意：大鼠在卵巢切除术后大约需要 8-12 周才会发展为骨质疏松症。
3. 针工具的选择
   1. 从医疗器械制造商处购买消防针。确保针工具由钨锰合金制成，耐温、无延展性、不易变形且受热均匀。火针的形状像一根细丝针。确保针头粗，尖端锋利笔直，手柄用铜丝缠绕，隔热不烫手。
   2. 选择尺寸为 0.40 mm x 13 mm 的单头火针，因为大鼠很小。检查火针是否有倒钩和裂纹。
      注：在临床实践中，使用的火针大多是国家医师¹² 何普仁研制的。基于此，林国华创造了岭南长头火针和岭南三头火针¹³。根据实验需要选择不同尺寸的火针。
4. 穴位的选择和定位
   1. 根据相关数据和文献，选择治疗绝经后骨质疏松症的穴位。
      注：最常用的穴位按频率顺序依次为：神书 （BL 23）、足三里 （ST 36）、辟书 （BL 20）、玄中 （GB 39） 和大竹 （BL 11）^14,15。在针灸干预排卵模型大鼠骨质疏松症的基础研究中，最常用的穴位是神舒 （BL 23）、三阴角 （SP 6）、关源 （CV 4） 和足三里 （ST 36）16,17,18。
   2. 确定为该实验选择的穴位。参考前人研究中选取的穴位^{14、15、16、17、18} 和骨质疏松症的发病机制，选取神书 （BL 23）、辟树 （BL 20）、足三里 （ST 36） 和三阴角 （SP 6） 4 个穴位进行本研究。这些对应于膀胱经、Du 经、脾经和肾经。
      注意： 禁止在具有大血管和神经干的部位使用火针。
   3. 定位前用宠物电动剪刀剃掉针灸部位，露出穴位。
   4. 穴位是指¹⁹ 中常用穴位的名称和位置。穴位定位如下：神舒（BL 23）位于第二腰椎下两侧，距背中线 6 mm;Pishu （BL 20） 位于^第 12 胸椎下两侧的肋骨之间，距背中线 6 毫米;Zusanli （ST 36） 位于膝盖的后侧和外侧，腓骨小头下方约 3 毫米;而三阴角 （SP 6） 位于后肢内踝尖端垂直向上约 10 毫米处。
   5. 找到点后，用油基记号笔标记它们。
5. 大鼠约束法
   注：为了减轻大鼠固定和治疗过程中的压力，选择用安全外套^20,21 捆绑的悬浮大鼠作为固定方法。大鼠外套悬吊法具有以下优点：首先，它充分利用了大鼠喜欢黑暗环境的习惯，减少了大鼠在固定过程中的应激反应。其次，由于四肢和脚趾上没有力点，悬浮大鼠在火针治疗的整个过程中更安静、更合作。第三，大鼠背部和四肢的穴位充分暴露，便于治疗。单次治疗需要将大鼠束缚 5-10 分钟。当被固定在外套中时，老鼠不会在约束中挣扎并且很平静。
   1. 准备老鼠外套。将清洁后的织物缝合并制成 50 厘米 x 13 厘米的管状大鼠外套。为老鼠外套的四个肢体和背面各剪孔，并在四个角缝制领带。
   2. 戴上手套，将老鼠放在不滑的桌子上，用左手握住老鼠的尾巴，轻轻向后拉。用右手打开鼠毛的端口。利用老鼠黑暗和挖洞的习惯，将其放在老鼠外套的口下，老鼠会自己钻进去。
   3. 当老鼠钻入老鼠皮毛中间时，用左手握住老鼠肩胛骨的两侧，用右手拉出老鼠的两条前肢。
   4. 拉紧外套前面的绳索，将绳索交叉并将它们缠绕在老鼠的背上。调整绳索的弹性，在老鼠的背上打结。最后，以类似的方式固定大鼠身体的后端，使其双侧后肢位于大鼠外套外。
   5. 对于摆动式悬架，取两个 S 形钩子，将它们钩入老鼠外套背面的结中，然后将钩子钩在铁架上。此时，大鼠以轻微摆动的状态悬挂在布条上（图 1）。
      注意：布条离地的高度约为 70 厘米，以便坐在凳子上的实验者舒适轻松地操作。在大鼠下方的平坦表面上放置厚垫子，以防动物滑倒。

2. 针灸治疗

1. 消毒
   1. 针灸前用 5% 碘伏消毒液消毒局部 3 次。每次碘伏擦洗后加入酒精擦洗。
2. 灼痛针头
   注意： 应采取安全预防措施以防止烧伤和受伤。
   1. 拿起止血钳，用左手拿起浸泡了 95% 酒精的棉球，用打火机点燃。
   2. 用右手的拇指、食指和中指以略微弯曲的位置握住针柄，就像拿着笔一样。
   3. 将针尖和针体放在酒精棉球上加热;先加热针体，再加热针尖。根据治疗目的，将针头燃烧至亮白色或红色（图 2）。
      注意：针体应充分燃烧亮白色或红色，否则会影响针灸疗效或引起术后感染等问题。
3. 针刺
   注：根据速度、深度、范围、持针时间和治疗目的，岭南火针可分为穴位针、散针、密集针、快针、慢针等各种操作技术²².使用 Lingnan Fire-Needle 操作的关键是红色、准确和快速。
   1. 等到针头燃烧成红色，将针头从火焰上移开，并将其保持在穴位上方。
   2. 将针尖垂直对准穴位，快速穿刺并拔出。确保整个过程在 1 s 内完成。
   3. 穴位穿透深度约为 1-2 毫米，仅刺穿炽热的针尖。
      注意事项：针灸的深度应根据病情、体质、年龄、穴肌厚、血管深度、神经分布等因素确定。
   4. 穿刺每个穴位 3 次至 5 次。对所有穴位重复此操作（图 3）。
      注意：执行操作时，请全神贯注和敏捷。在对大鼠的相同程序中，应使用相同的火针，每两次穿刺之间通过燃烧对针头进行重新消毒;针头不应放下或变得不无菌。

3. 针灸后管理

1. 将火针从皮肤上提起，握住无菌的干燥棉球按压针孔，防止出血。火针疗法后，大鼠表现出活动能力未受损，无可检测的并发症。
   注意：如果火针后出血，无需止血，自然止血后用干棉球擦拭即可。

4. 数据收集和分析

1. 经过 6 个疗程的火针干预后，通过大剂量腹腔注射戊巴比妥钠 （150-200 mg/kg） 对大鼠实施安乐死。收集股骨标本并进行显微 CT 扫描²³.
2. 使用分析软件对数据进行统计分析。将测量值显示为平均值并使用单因子方差分析进行分析，其中 p <0.05 被视为具有统计显著性。

结果

表 1 中的数据显示，与正常组相比，模型组小梁骨厚度 （Tb.Th）、小梁骨数量 （Tb.N） 和静态参数骨小梁骨体积分数 （BV/TV） 均显著降低 （p <0.05），骨小梁分离 （Tb.Sp） 升高 （p <0.05）;表明去骨质疏松后大鼠股骨骨骺小梁骨丰富区域的骨小梁结构明显中断，表明损伤明显。

与模型组相比，火针组股骨小梁厚度、小梁数量和股骨小梁静?...

讨论

岭南火针疗法具有深厚的历史背景。关于火针和针刺方法的记录可以追溯到黄帝内经。现代针灸师司徒钟和张佳伟结合岭南的气候和当地居民的身体特征，创造了岭南火针疗法³。林国华将岭南火针疗法总结为温、疏、补、清、消，以温为精华²⁴.

使用 Fire Needles 的第一步是选择合适的针头类型。火针可分为三大类：?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% Alcohol	Shandong Lircon medicaltechnology co., ltd		Disinfection
95% Alcohol	Shandong Lircon medicaltechnology co., ltd		Burn needles
Adult female Sprague-Dawley (SD) rats	Liaoning Changsheng biotechnology co., Ltd.	SCXK 2020-0001	Modeling of osteoporosis
Deluxe thermostat heat mat	Zhenhua Instruments		For maintaining the body temperature of rats.
Diclofenac sodium injection	Shandong Province Jianmu Bio-pharmaceutical Co.	150182913	Antipyretic and analgesic
Elevated fixation rack	Taizhou Shi Ai Scientific and Educational Instruments and Equipment Co.		Fix rats
Fire needles	Beijing Luoya Shanchuan Medical Equipment Co., Ltd.	20190240	A tool of needling
Hemostatic forceps	Qingdao Schultz Biotechnology Co.		Fix rats
Liguter	Shanghai Machi Trading Co.	H5	Ignite alcohol
Lodophor disinfecting solution	Qingdao Hai's Hainuo Inovation Disinfection Technology Co., Ltd.	2016-0604	Disinfection
Medical cotton ball	Jiangsu Misawa Medical Supplies Co., Ltd.	20172142357	Disinfection
pentobarbital sodium	Beijing Jiehui Biotechnology Co.	P3761	anesthesia
Pet electric clipper	Fenghua Xikou Lubao Knives & Scissors Electrical Appliance Factory		Shave the hair of rats
Self-made rat coat			Fix rats
Tweezers	Qingdao Schultz Biotechnology Co.		Pinch cotton balls