Procedimento de operação e precauções da terapia com agulha de fogo Lingnan em ratos modelo de osteoporose

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a aplicação da terapia com agulha de fogo Lingnan na intervenção de ratos modelo de osteoporose.

Resumo

Em comparação com a terapia com agulha filiforme, a terapia com agulha de fogo tem tanto a estimulação de agulhas quanto o efeito de aquecimento do calor, fazendo com que tenha efeitos inesperados em algumas doenças crônicas e doenças incuráveis. A osteoporose (PO) tem alta incidência em mulheres na pós-menopausa e homens de meia-idade e idosos, e o ciclo de tratamento é longo. De acordo com a Medicina Tradicional Chinesa (MTC), a terapia com agulha de fogo Lingnan mostrou potencial no tratamento da osteoporose. No entanto, ainda há um longo caminho a percorrer antes que possa ser amplamente utilizado. Este artigo enfoca a aplicação da terapia com agulha de fogo de Lingnan na intervenção de PO em ratos. Abrange a seleção de ferramentas de agulha, seleção de pontos de acupuntura, posicionamento de corpos de ratos e métodos de fixação. Também descrevemos as etapas e precauções a serem tomadas durante e após o agulhamento com agulhas de fogo. O experimento foi feito com três grupos: um grupo normal, um grupo modelo e um grupo de agulhas de fogo, cada um contendo 10 ratos. Os ratos do grupo com agulha de fogo foram tratados com intervenção com agulha de fogo por seis sessões. Após o período de intervenção, coletamos amostras femorais e realizamos microtomografias. Os resultados sugerem que o agulhamento de fogo pode melhorar a morfologia óssea e a densidade mineral em ratos OP. Essas informações podem servir como base metodológica para a realização de pesquisas básicas sobre a terapia com agulha de fogo.

Introdução

A medicina chinesa acredita que fatores como clima e meio ambiente podem afetar o físico de uma pessoa, o que, por sua vez, afeta a ocorrência e o desenvolvimento de doenças. A região de Lingnan da China, incluindo principalmente Guangdong, Guangxi e Ilha de Hainan, está localizada na região de clima tropical de monções. Como resultado, as pessoas que vivem nesta região por muito tempo são propensas a uma forma de deficiência do baço. Em alguns casos, ela se espalha para o rim e fígado, levando à prevalência de osteoporose¹. O baço e o estômago funcionam no transporte e absorção de água e grãos, que são a fonte de qi e bioquímica do sangue, enquanto o fígado ajuda a manter as medulas. Portanto, a nutrição óssea depende do suprimento do baço, estômago e fígado. Na medicina chinesa, o rim é capaz de gerar medula e fortalecer os ossos, e sua vitalidade afeta diretamente a força e a função dos ossos. Portanto, a deficiência renal está diretamente relacionada à osteoporose. De acordo com a MTC, a deficiência de fígado (Gan)-rim (Shen) e a falta de essência (Jing) são as causas subjacentes. Em alguns casos, a desnutrição pode ocorrer devido a uma deficiência de baço (Pi) e estômago (Wei) ou a um desequilíbrio dos dois. Ou seja, a deficiência do fígado (Gan), rins (Shen), baço (Pi) e estômago (Wei) são as causas principais, enquanto o qi externo (Xie qi) bloqueia os meridianos e danifica ossos e músculos. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a PO é uma condição médica caracterizada por baixa massa óssea e deterioração tecidual², o que é uma séria preocupação para os idosos. A seleção de intervenções apropriadas é crucial para a prevenção e tratamento da osteoporose.

Os acupunturistas modernos desenvolveram uma característica única de Lingnan da terapia de agulhamento de fogo, combinando o clima de Lingnan e as características físicas do povo Lingnan³. A terapia com agulha de fogo é um tipo de método de tratamento no qual agulhas especiais são queimadas em vermelho e rapidamente perfuradas em partes específicas ou pontos de acupuntura do corpo humano para tratar várias doenças. Esse método é amplamente utilizado em doenças de pele, doenças musculoesqueléticas e articulares, doenças neurológicas e outras doenças sistêmicas e apresenta boa eficácia⁴. O tratamento da osteoporose com agulhas de fogo é utilizado em clínicas há muito tempo e tem um efeito curativo melhor do que a simples acupuntura ou a administração oral da medicina tradicional chinesa ^5,6,7. A terapia com agulha de fogo Lingnan integra acupuntura, agulhas de três gumes e moxabustão cicatricial. Pode melhorar o qi e a circulação sanguínea nos meridianos enquanto aquece o rim. Este tratamento pode tratar tanto a estase sanguínea quanto a deficiência renal (Shen), que contribuem para a patogênese da PO na MTC. Além disso, tem as vantagens de ser de baixo custo, ter efeitos rápidos, um curto período de tratamento e ser seguro. No entanto, há uma falta de pesquisas sobre seu mecanismo. Este artigo apresenta um procedimento específico de Lingnan Fire-Needle em ratos modelo de osteoporose e fornece uma base metodológica para a realização de pesquisas básicas relacionadas.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados seguindo o National Institutes of Health - Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de TCM de Hubei. Foram utilizadas ratas Sprague-Dawley (SD) adultas, pesando 220 ± 20 g, para o teste. Todos os ratos foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h a 23 ± 1 °C e umidade de 40%-50%, com livre acesso a comida e água.

1. Preparo pré-operatório

1. Design de grupo
   1. Após a genotipagem de 30 ratas de 3 meses de idade, divida-as aleatoriamente em três grupos (n = 10 em cada grupo): o grupo normal, o grupo modelo e o grupo agulha de fogo. Trate os ratos do grupo da agulha de fogo com intervenção com agulha de fogo 1x ao dia durante 6 sessões, com 1 dia de descanso entre as sessões.
      NOTA: O grupo normal e o grupo modelo suspenderam o rato amarrado com uma pelagem segura de acordo com a mesma frequência e a mesma duração do grupo agulha de fogo, mas sem o tratamento com agulha de fogo.
2. Preparação do modelo de osteoporose de rato
   1. Para os ratos do grupo modelo e do grupo agulha de fogo, remova cirurgicamente seus ovários para estabelecer um modelo de osteoporose, conforme descrito em ^8,9,10.
      1. Para a ovariectomia, administre anestesia por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 2% (0,2 mL/100 g) antes da operação e considere a anestesia bem-sucedida quando os animais não respondem em um plano cirúrgico de anestesia com base na falta de resposta de um teste de pinça do dedo do pé. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Injete buprenorfina (0,05 mg / kg) por via subcutânea como analgésico antes da cirurgia. Mantenha as condições assépticas durante a operação.
         NOTA: Se a cirurgia não tiver sido concluída e o rato apresentar sinais de ressuscitação, a injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital sódico a 2% pode ser suplementada temporária e adequadamente, com cada dose suplementar não excedendo 20% da quantidade total injetada.
      2. Após a cirurgia, coloque os ratos em uma almofada de aquecimento para pequenos animais e ajuste a temperatura para 32 °C. Não deixe os ratos sozinhos até que eles recuperem a consciência e possam rastejar livremente. Não os devolva à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
      3. Quando os ratos forem revividos, verifique a integridade das suturas e coloque-os de volta na gaiola. Injetar penicilina sódica em todos os ratos por via intramuscular (50.000 U por dia, por 3 dias) e injetar por via intraperitoneal 0,1 mL de solução de diclofenaco sódico a 0,05% (por dia, por 3 dias) para prevenir a infecção e acelerar a cicatrização ^9,10.
   2. Observar o ciclo estral de acordo com o esfregaço de células esfoliadas vaginais de ratas, conforme descrito em¹¹. Se o ciclo estiver desordenado, o modelo é estabelecido com sucesso¹¹.
      NOTA: Leva aproximadamente 8-12 semanas para os ratos desenvolverem osteoporose após a ovariectomia.
3. Seleção de ferramentas de agulha
   1. Compre agulhas de fogo de fabricantes de dispositivos médicos. Certifique-se de que as ferramentas de agulha sejam feitas de liga de tungstênio-manganês, que é resistente à temperatura, não é maleável, não é fácil de deformar e é aquecida uniformemente. A agulha de fogo tem a forma de uma agulha de filamento. Certifique-se de que a agulha seja grossa, a ponta afiada e reta e o cabo seja enrolado com fio de cobre, que é isolante térmico e não queima as mãos.
   2. Escolha uma agulha de fogo de cabeça única com um tamanho de 0,40 mm x 13 mm porque os ratos são pequenos. Verifique se a agulha de fogo tem farpas e rachaduras.
      NOTA: Na prática clínica, a maioria das agulhas de fogo utilizadas são as desenvolvidas por He Puren, um mestre médico nacional¹². Com base nisso, Lin Guohua criou a Agulha de Fogo de Cabeça Longa Lingnan e a Agulha de Fogo de Três Cabeças Lingnan¹³. Escolha diferentes tamanhos de agulhas de fogo com base na necessidade do experimento.
4. Seleção e posicionamento de pontos de acupuntura
   1. De acordo com os dados e a literatura relevantes, selecione pontos de acupuntura para o tratamento da osteoporose pós-menopausa.
      NOTA: Os pontos de acupuntura mais usados são, em ordem de frequência, Shenshu (BL 23), Zusanli (ST 36), Pishu (BL 20), Xuanzhong (GB 39) e Dazhu (BL 11)^14,15. Na pesquisa básica sobre intervenção de acupuntura para osteoporose em ratos modelo desovulatório, os pontos de acupuntura mais utilizados são Shenshu (BL 23), Sanyinjiao (SP 6), Guanyuan (CV 4) e Zusanli (ST 36)16,17,18.
   2. Determine os pontos de acupuntura selecionados para este experimento. Referindo-se aos pontos de acupuntura selecionados em estudos anteriores14,15,16,17,18 e à patogênese da osteoporose, selecione quatro pontos de acupuntura, a saber, Shenshu (BL 23), Pishu (BL 20), Zusanli (ST 36) e Sanyinjiao (SP 6), para este estudo. Estes correspondem ao meridiano da bexiga, ao meridiano Du, ao meridiano do baço e ao meridiano do rim.
      NOTA: É proibido o uso de agulhas de fogo em peças com grandes vasos e troncos nervosos.
   3. Raspe o local da acupuntura com um cortador elétrico para animais de estimação antes de posicionar para expor o ponto de acupuntura.
   4. A localização dos pontos de acupuntura refere-se aos nomes e localização dos pontos de acupuntura comumente usados em¹⁹. Localize os pontos de acupuntura da seguinte forma: o Shenshu (BL 23) está localizado nos dois lados inferiores da segunda vértebra lombar, a 6 mm da linha dorsal média; o Pishu (BL 20) está localizado entre as costelas nos dois lados inferiores da^12ª vértebra torácica, a 6 mm da linha médio-dorsal; o Zusanli (ST 36) está localizado na face posterior e lateral do joelho, cerca de 3 mm abaixo da pequena cabeça da fíbula; e Sanyinjiao (SP 6) está localizado a cerca de 10 mm em linha reta da ponta do tornozelo interno do membro posterior.
   5. Marque-os com um marcador à base de óleo depois de localizar os pontos.
5. Método de contenção de ratos
   NOTA: A fim de reduzir o estresse durante a imobilização e tratamento de ratos, os ratos suspensos amarrados com uma pelagem segura^20,21 foram escolhidos como método de imobilização. O método de suspensão de pelagem de rato tem as seguintes vantagens: Em primeiro lugar, aproveita ao máximo o hábito do rato de preferir um ambiente escuro e reduz a reação de estresse do rato durante a fixação. Em segundo lugar, os ratos suspensos são mais silenciosos e cooperativos durante todo o processo de tratamento com agulhas de fogo devido à falta de pontos de força em seus membros e dedos dos pés. Em terceiro lugar, os pontos de acupuntura nas costas e nos membros dos ratos foram suficientemente expostos para facilitar o tratamento. Um único tratamento requer a contenção do rato por 5 a 10 minutos. Quando seguros na pelagem, os ratos não lutam na contenção e ficam calmos.
   1. Prepare a pelagem de rato. Costure o tecido limpo e transforme-o em um casaco de rato em forma de tubo de 50 cm x 13 cm. Faça furos para cada um dos quatro membros e para a parte de trás do casaco de rato e costure os laços nos quatro cantos.
   2. Coloque luvas, coloque o rato em uma mesa que não seja escorregadia, segure o rabo do rato com a mão esquerda e puxe suavemente para trás. Abra a porta do casaco de rato com a mão direita. Usando o hábito do rato de escurecer e cavar, coloque-o na boca do casaco de rato, o rato se enterraria nele por conta própria.
   3. Quando o rato se enterrar no meio da pelagem do rato, use a mão esquerda para segurar os dois lados das omoplatas do rato e puxe os dois membros anteriores do rato com a mão direita.
   4. Aperte as cordas na frente da pelagem, cruze as cordas e enrole-as nas costas do rato. Ajuste a elasticidade das cordas e dê o nó nas costas do rato. Finalmente, fixe a extremidade posterior do corpo do rato de maneira semelhante, de modo que seus membros posteriores bilaterais fiquem localizados fora da pelagem do rato.
   5. Para a suspensão do tipo balanço, pegue dois ganchos em S e prenda-os no nó na parte de trás do casaco de rato e prenda os ganchos na estrutura de ferro. Nesse ponto, o rato é suspenso da tira de pano, em um estado levemente oscilante (Figura 1).
      NOTA: A altura da tira de pano do solo é de cerca de 70 cm, para que o experimentador sentado em um banquinho opere confortavelmente e sem esforço. Coloque um acolchoamento grosso na superfície plana abaixo do rato como precaução se o animal escorregar.

2. Tratamento de acupuntura

1. Desinfecção
   1. Esterilize a área local com solução desinfetante de iodóforo a 5% 3x antes da acupuntura. Adicione álcool após cada esfoliação iodófora.
2. Queimando agulhas
   NOTA: Precauções de segurança devem ser tomadas para evitar queimaduras e ferimentos.
   1. Pegue a pinça hemostática para pegar a bola de algodão, embebida em álcool 95%, com a mão esquerda e acenda com um isqueiro.
   2. Segure o cabo da agulha com o polegar, o indicador e o dedo médio da mão direita em uma posição ligeiramente curvada, como se estivesse segurando uma caneta.
   3. Coloque a ponta da agulha e o corpo da agulha nas bolas de algodão com álcool e aqueça; Primeiro aqueça o corpo da agulha e, em seguida, aqueça a ponta da agulha. Queime a agulha até que fique branca ou vermelha brilhante, dependendo da finalidade do tratamento (Figura 2).
      NOTA: O corpo da agulha deve ser totalmente queimado em branco brilhante ou vermelho, caso contrário, afetará a eficácia da acupuntura ou causará infecção pós-operatória e outros problemas.
3. Acupuntura
   NOTA: De acordo com a velocidade, profundidade, alcance, tempo de retenção da agulha e finalidade do tratamento, a Lingnan Fire-Needle pode ser dividida em várias técnicas operacionais, como acupuntura pontual, acupuntura de dispersão, acupuntura densa, acupuntura rápida e acupuntura lenta²². A chave para operar com a Lingnan Fire-Needle é vermelha, precisa e rápida.
   1. Espere até que a agulha queime em vermelho, afaste-a da chama e segure-a acima do ponto de acupuntura.
   2. Aponte a ponta da agulha verticalmente para o ponto de acupuntura, perfure e puxe rapidamente para fora. Certifique-se de que todo o processo seja concluído em 1 s.
   3. A profundidade de penetração dos pontos de acupuntura é de cerca de 1-2 mm, perfure apenas a ponta da agulha em brasa.
      NOTA: A profundidade da acupuntura deve ser determinada de acordo com a condição, constituição, idade, espessura muscular do ponto de acupuntura, profundidade dos vasos sanguíneos e distribuição dos nervos.
   4. Perfure cada ponto de acupuntura 3x-5x. Repita isso para todos os pontos de acupuntura (Figura 3).
      NOTA: Ao realizar a operação, esteja totalmente focado e ágil. No mesmo procedimento em um rato, a mesma agulha de fogo deve ser usada, com a agulha sendo reesterilizada por chama entre duas punções; A agulha não deve ser colocada no chão ou tornar-se não estéril.

3. Gerenciamento pós-acupuntura

1. Levante a agulha de fogo da pele e segure uma bola de algodão seca estéril para pressionar o orifício da agulha para evitar sangramento. Após a terapia com agulha de fogo, os ratos apresentaram mobilidade intacta e sem complicações detectáveis.
   NOTA: Se ocorrer sangramento após o agulhamento de fogo, não há necessidade de parar o sangramento, basta limpar com uma bola de algodão seca depois que ele parar naturalmente.

4. Coleta e análise dos dados

1. Após 6 ciclos de intervenção de agulhamento de fogo, eutanasiar os ratos por injeção intraperitoneal de alta dose de pentobarbital sódico (150-200 mg / kg). Colete amostras de fêmur e realize microtomografias computadorizadas²³.
2. Analise os dados estatisticamente, usando software de análise. Mostrar as medidas como média e analisar por meio de ANOVA one-way, sendo considerado p <0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

Os dados da Tabela 1 mostram que, em comparação com o grupo normal, a espessura do osso trabecular (Tb.Th), o número de osso trabecular (Tb.N) e o parâmetro estático fração volumétrica do osso trabecular (BV/TV) no grupo modelo foram significativamente reduzidos (p <0,05), e a separação do osso trabecular (Tb.Sp) foi elevada (p <0,05); indicando que a estrutura óssea do osso trabecular em áreas enriquecidas com osso trabecular da epífise femoral do rato foi ...

Discussão

A terapia com agulha de fogo Lingnan tem um profundo histórico histórico. Registros sobre agulhas de fogo e métodos de agulhamento podem ser rastreados até Huangdi Neijing. Os acupunturistas modernos Situ Bell e Zhang Jiawei combinaram o clima de Lingnan e as características físicas de seu povo para criar a terapia com agulha de fogo de Lingnan³. Lin Guohua resumiu a terapia Lingnan Fire-Needle, como aquecimento, dragagem, tonificação, limpeza e eliminaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% Alcohol	Shandong Lircon medicaltechnology co., ltd		Disinfection
95% Alcohol	Shandong Lircon medicaltechnology co., ltd		Burn needles
Adult female Sprague-Dawley (SD) rats	Liaoning Changsheng biotechnology co., Ltd.	SCXK 2020-0001	Modeling of osteoporosis
Deluxe thermostat heat mat	Zhenhua Instruments		For maintaining the body temperature of rats.
Diclofenac sodium injection	Shandong Province Jianmu Bio-pharmaceutical Co.	150182913	Antipyretic and analgesic
Elevated fixation rack	Taizhou Shi Ai Scientific and Educational Instruments and Equipment Co.		Fix rats
Fire needles	Beijing Luoya Shanchuan Medical Equipment Co., Ltd.	20190240	A tool of needling
Hemostatic forceps	Qingdao Schultz Biotechnology Co.		Fix rats
Liguter	Shanghai Machi Trading Co.	H5	Ignite alcohol
Lodophor disinfecting solution	Qingdao Hai's Hainuo Inovation Disinfection Technology Co., Ltd.	2016-0604	Disinfection
Medical cotton ball	Jiangsu Misawa Medical Supplies Co., Ltd.	20172142357	Disinfection
pentobarbital sodium	Beijing Jiehui Biotechnology Co.	P3761	anesthesia
Pet electric clipper	Fenghua Xikou Lubao Knives & Scissors Electrical Appliance Factory		Shave the hair of rats
Self-made rat coat			Fix rats
Tweezers	Qingdao Schultz Biotechnology Co.		Pinch cotton balls