用于研究多深度烧伤伤口愈合过程的猪烧伤模型

摘要

该协议描述了尤卡坦迷你猪中可重复的多深度烧伤创面模型。

摘要

烧伤伤口愈合是一个复杂而漫长的过程。尽管拥有丰富的经验，但烧伤中心的整形外科医生和专业团队仍然面临重大挑战。在这些挑战中，烧伤软组织的程度可以在早期阶段发生变化，从而在保守治疗和坏死组织切除之间形成微妙的平衡。热灼烧是最常见的类型，灼烧深度因温度和曝光时间等多个参数而异。烧伤深度也随时间变化，"阴影区"的二次恶化仍然是一个知之甚少的现象。为了应对这些挑战，已经研究了几种创新疗法，还有更多疗法处于早期开发阶段。现代伤口敷料和人造皮肤中的纳米颗粒是这些仍在评估中的现代疗法的例子。综上所述，烧伤诊断和烧伤治疗都需要重大进步，研究团队需要一个可靠且相关的模型来测试新的工具和疗法。在动物模型中，猪是最相关的，因为它们的皮肤结构与人类非常相似。更具体地说，尤卡坦迷你猪表现出有趣的特征，例如黑色素沉着和生长缓慢，可以研究高光型和长期愈合。本文旨在描述一种可靠且可重复的方案来研究尤卡坦小型猪的多深度烧伤创面，从而实现长期随访并为诊断和治疗研究提供相关模型。

引言

烧伤是一个重大的公共卫生问题，根据国家烧伤储存库的数据，美国每年影响超过 480,000 名患者 ^1,2。这导致每年有超过 50,000 人因需要深度护理的非致命性复杂病例而住院²。此外，烧伤是军人死亡和发病的根本原因，占军队伤亡的 10% 至 30% ^3,4。尽管烧伤对患者的影响巨大而多样，从身体到心理和情感⁵，但烧伤的管理长期以来几乎没有变化。

烧伤的初步诊断和评估导致根据烧伤类型（第一次、第二次和第三次）或受影响组织的深度（浅表、部分厚度和深部烧伤）进行基线分类^6,7,8。部分厚度烧伤（一度和二度烧伤）涉及表皮和真皮的不同深度（浅层或深层真皮，即浅层和深层二度烧伤）⁹。特别是，对深层真皮中附件的损伤排除了附件上皮再上皮化的可能性¹⁰。根据定义，全层烧伤到达皮下脂肪、筋膜和/或下面的肌肉（三度烧伤），有时到达骨骼（也称为四度烧伤）^11,12。

住院后，烧伤患者接受特殊护理，包括组织清创和保存之间的微妙平衡。受损和/或继发感染的软组织需要逐渐去除，直到健康组织暴露出来，允许使用特定的敷料和皮肤移植物来改善愈合过程 13,14,15,16。然而，手术过程中需要小心，以避免意外切除愈合组织并减少并发症以实现最佳恢复。从生物学上讲，烧伤表现出一个被"阴影"或"停滞"区包围的中央坏死区域，表明潜在的可逆性缺血。该区域可以恶化，导致坏死区扩大，也可以通过逆转凋亡过程来愈合^17,18。这种不同的烧伤严重程度给外科医生准确评估带来了挑战，使保守治疗和手术切除之间的平衡复杂化¹⁹。迄今为止，还没有有效的工具可以帮助描述燃烧转换之前的这个 "阴影区域" 的特征。开发此类工具对于优化这种微妙的平衡至关重要。

已经测试了几种治疗方法有助于减少继发性烧伤转换。然而，目前临床上没有可用的特定疗法¹⁸.烧伤治疗进步的其他例子包括现代伤口敷料和纳米材料的发展 ^20,21、组织工程皮肤^22,23 和新型表皮培养方法^24,25。此外，现代重建手术和筋膜皮瓣改善了对长期后遗症的管理，尤其是皱襞区域病理愈合后的烧伤挛缩^26,27。这些进步为烧伤患者提供了光明的前景，改善了他们的治疗策略和生活质量，但最近的结果表明，在生理和心理领域，功能影响仍然很大²⁸。综上所述，对烧伤诊断和烧伤治疗创新进步的需求是巨大的。

总体而言，许多方法旨在改善复杂烧伤病例的诊断、管理和治疗，研究人员需要一个可重复且相关的模型来测试这些新方法。由于其生物学复杂性，涉及多个器官和全身反应，没有体外模型证明自己与研究烧伤创面过程相关²⁹。由于生物学、皮肤结构、弹性和缺乏对底层结构的粘附性存在重大差异，啮齿动物模型显示出与人类的重大差异²⁹。相比之下，由于猪皮肤的结构相似性，猪模型已被证明是相关的 30,31,32。它具有相似的血管形成、弹性纤维组成和更新时间。此外，毛囊和大汗腺附件允许岛状再上皮化，如临床浅表烧伤中观察到的那样^33,34。更具体地说，尤卡坦迷你猪模型提供了有趣的特征，使它们与研究色素沉着的皮肤³⁵ 和身体变化最小的长期结果³⁶ 相关。

本文的目的是描述尤卡坦猪中可靠的多度烧伤模型，从而能够研究同一主题的几种二度和三度烧伤。这为研究烧伤管理的诊断和治疗创新提供了一个相关且可重复的模型。此外，该模型具有不同的烧伤类型和严重程度，长期随访允许研究烧伤挛缩和病理愈合，以及已知具有特定特征的色素沉着皮肤差异行为。

研究方案

所有动物工作均按照 ARRIVE（动物研究:体内实验报告）清单³⁷ 进行，并符合马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 根据协议 #2021N000271。按照《实验动物护理和使用指南》³⁸ 为动物提供人道照顾。这些实验使用了 5 只 30 公斤的雌性尤卡坦迷你猪。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 术前护理和麻醉

1. 全身麻醉前将动物禁食 12 小时。
2. 通过肌肉注射 2-4 mg/kg 盐酸平达明和盐酸唑拉西泮以及 1-2 mg/kg 甲苯噻嗪来启动麻醉，然后吸入异氟醚（2-3% 的氧气）（见 材料表）以在手术过程中维持麻醉。

2. 烧伤创面设计和随机化

1. 为了研究对同一只动物进行阴性对照的部分和全层烧伤（无个体间差异），在每头猪的椎旁区域背部创建 8 个伤口。执行 3 个全层伤口、3 个部分厚度伤口和 2 个对照伤口。
2. 将伤口从 1 到 8 编号，并执行随机化以将不同的烧伤程度（部分厚度、全层、对照）分配到背部的不同解剖位置。
   注意:对每个伤口（深度和位置）进行随机化以提高显着性:已知猪真皮在厚度和胶原蛋白组成方面有所不同³⁹。因此，对每只动物进行随机化以减少潜在的偏差。

3. 纹身伤口划定

注意:第一个程序包括在猪的背部创建圆形纹身，以便定位和编号随机伤口（图 1）。这是在初始烧伤手术前两天进行的，以便更好地适应环境，但也可以在烧伤手术当天进行。

1. 麻醉（参见步骤 1）和仰卧位经口气管插管^{后 40}，将猪置于俯卧位，并在动物下方放置软楔子（床单）以使其舒适和稳定（在前肢、脐带区域和后肢下方）⁴¹。在动物的头部和颈部放置强制空气加热毯，以保持足够的体温。
2. 在猪背中央放置一条直线，以使图纸对称。
3. 使用皮肤笔（见 材料表）在中心线的两侧画两条垂直线，距离中心线横向 6.5 厘米。两条侧线将用于放置圆的中心。
4. 对称绘制每对直径为 4.5 厘米的圆圈，两个不同的圆圈之间保持 4 厘米的最小距离（图 1A）。
5. 图纸完成后，进行单步皮肤准备（聚维酮碘 7.5%）以减少皮肤细菌菌群。
6. 使用针刺纹身机、无菌黑色墨水和消毒的⁴² 点针头执行八个 4.5 厘米圆圈中的 5 个纹身程序（见 材料表）。最终结果如图 1B 所示。
7. 如果延迟烧伤产生程序，请在纹身上涂抹三重抗生素软膏，并用透明粘合剂敷料覆盖。

4. 烧伤创面创建和高级伤口敷料

注意:将黄铜块与皮肤接触 30 秒（随机化）放在专用点（不变）上，从而产生燃烧。温度将决定燃烧深度。

1. 在烧伤手术当天，一旦动物被麻醉并按照步骤 1 中的讨论处于俯卧位，将圆柱形黄铜块放入装满铝珠的不锈钢容器中（参见 材料表）。将容器放在温控热板上。将一个热板设置为 65 °C（对于部分厚度燃烧），将第二个设置为 93 °C（对于全层燃烧， 图 2）。
   注意:容器可以保持干燥以避免烫伤（需要 2-3 小时才能达到温度平衡）或半装满水（30 分钟才能达到温度平衡）。如果使用水，则需要在步骤 4.5 之前彻底干燥黄铜块，以避免随后因烫伤而灼伤。
2. 通过黄铜圆柱体的中央开口将温度计插入黄铜圆柱体中，以监测其中心温度，并用温度枪确认表面温度。如果需要，将圆筒中的热板温度提高到 65 °C 或 93°C，尽管散热很小。
   注意:铝箔可用于覆盖容器并进一步减少散热，从而更快地达到所需温度。
3. 同时，将动物置于俯卧位进行燃烧程序，类似于纹身程序（步骤 3.1）。
4. 一旦动物准备好俯卧位，分三个步骤准备皮肤（聚维酮碘 7.5%、生理盐水溶液 0.9%、干燥）。
5. 用耐热手套抓住黄铜块，并将其放在专门的纹身点上，具体取决于随机化。黄铜块一接触到皮肤就启动计时器。小心不要对皮肤施加超过黄铜块自身重量的压力。
6. 30 秒后，从皮肤上取下黄铜块，然后将其放回专用的加热容器中。监测温度直到达到目标，然后对所有伤口重复该过程。
7. 进行高级多层敷料，以确保动物康复后敷料的稳定性。
   1. 在每个烧伤部位（包括对照）上放置一块石油浸渍纱布，并用干燥的无纺布纱布和大的透明粘合剂敷料覆盖。
   2. 将安息香溶液酊剂喷洒在周围的皮肤上，以使透明敷料更好地粘附在皮肤上。
   3. 用自粘性粘合包裹敷料包裹动物，同时注意不要过度拧紧（限制肺容量）。
   4. 通过添加最后一层管状弹力袜（适合动物的大小）来完成敷料（参见 材料表）。或者，如果动物在研究期间无法保持敷料清洁，则可以使用定制的猪夹克
   5. 注射单剂量丁丙诺啡（0.05-0.1 mg/kg，IM）和单剂量卡洛芬（2-4 mg/kg，IM）后，通过在动物的颈部放置透皮阿片类药物（芬太尼）贴剂来确保正确的镇痛。
   6. 每次麻醉后，密切监测动物直至恢复后 2 小时。如果需要，请使用热垫，并在达到完全站立姿势后自由提供食物。

5. 全层烧伤焦痂切开术

注意:术后 1 至 3 天，动物将在三度烧伤后接受焦痂的全层手术切除。

1. 在对动物进行类似的准备（包括麻醉、插管和将动物置于仰卧位）后，通过三步皮肤准备准备皮肤，对动物背部进行无菌悬垂。
2. 对伤口进行 4 mm 穿刺活检（ 材料 表）以确认损伤类型。
3. 用无菌手术刀刀片 （n°43^） 在焦痂上做一个圆形切口，进行焦痂切开术^45,44，直到到达深层真皮。
4. 用一对无菌 Adson 组织镊子（有 2/1 个齿）牢牢抓住焦痂的一侧（见 材料表），并将其向上连接，露出焦痂的深部极限。
5. 使用手术刀刀片继续焦痂切开术，同时保持在深真皮/下筋膜内的同一平面内。出血的真皮被认为是组织活力的标志。
   1. 如果在此过程中切开了小动脉，请使用双极凝血钳进行最小烧灼（见 材料表）。注意:对创建的伤口床进行大面积烧灼会导致延迟愈合，应严格避免。
6. 在放置最终敷料之前，将第一套干敷料放在伤口床上 5 分钟以增强局部止血。
7. 与以前类似地包扎伤口（步骤 4.7），并添加几块干纱布以填充空腔。应用与前面提到的相同的层:酊剂安息香喷雾剂、粘合透明敷料、自粘包装、管状弹力袜。
8. 通过更换阿片类透皮贴剂和注射卡洛芬（2-4 mg/kg，IM）来提供镇痛。

6. 后续伤口敷料

注意:随后的敷料每 2 至 7 天进行一次，具体取决于实验治疗设计和动物的耐受性。伤口敷料可在 21 天后停止使用，以便在干燥环境中重新上皮化并提高动物的耐受性。或者，如果治疗组需要潮湿或潮湿的环境，则可以延长敷料直到研究结束。随访期延长至长达 10 周，以研究急性和延长的愈合过程。

1. 对动物进行短时间麻醉，并用鼻锥（异氟醚 2-5 L/min）置于仰卧位。
2. 去除之前的敷料，并使用无菌 0.9% 盐水和无菌纱布清洁伤口。
3. 如果适用，应用实验性治疗。
4. 同样，如果研究需要，在此过程中进行后续活检。然后，动物应接受止痛药，如卡洛芬（2-4 mg/kg，IM，24 小时效应）。
5. 用石油浸渍或等效物的纱布、干燥的无纺布纱布和粘性透明敷料覆盖所有伤口部位，包括对照伤口。

结果

图 2A、B 显示了尤卡坦迷你猪背部多次烧伤的结果。伤口 （I） 和 （VII） 是对照伤口 （37 °C）。二度伤口 （II;III 和 VIII） 表现为强烈的发红和水疱。相比之下，三度伤口 （IV;V;和 VI） 面色苍白且难以触及。需要注意的是，伤口 VIII 看起来介于 2 度和 3 度之间:为了进行一项正在进行的研究，我们在 45 度时将接触时间增加到 65 秒。

讨论

烧伤后的伤口愈合是一个漫长的过程，可能需要长达数月的时间，有多种治疗方案和患者护理注意事项 ^2,13。为了研究它，需要一个可靠且可重复的模型。已经描述了几种动物模型，主要包括啮齿动物 29,45,46 和猪^29,47

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson tissue forceps	Jarit	130-234
Aluminum beads	Lab Armor	42370-002	Lab Armor Beads
Buprenorphine hydrochloride	Ranbaxy Pharmaceuticals	NDC:12469-0757-01	Buprenex Injectable
Carprofen	Pfizer	NADA 141-199	Rymadyl 50mg/ml injectable
Cylindric brass block	Hand-made	N/A	Engineering drawing included in the manuscript
Dermographic pen	McKesson	Surgical Skin Marker Sterile
Disposable #15 surgical scalpels	Medline	MDS15315	Scalpel blades
Fentanyl patch	Mylan	NDC:60505-7082	Fentanyl Transdermal System
Isoflurane	Piramal	NDC:66794-013-25	Isoflurane, USP
McPherson Bipolar coagulation forceps	Bovie	A842	Reusable, autoclavable
Miltex assorted biopsy punches (3,4 and 5 mm)	Integra	33-38	Biopsy punches- size to adapt to the study
Non woven gauze	Starryshine	GZNW22	2 x 2" non woven 4 ply medical gauze pads
Povidone-Iodine	Betadine	NDC:0034-9200-88	Surgical scrub 7.5%
Sterile isotonic sodium chloride solution 0.9%	Aqualite System	RL-2095	Sterile saline solution
Tattoo ink	Spaulding & Rogers	Black - 2 oz - #9053
Tattoo marker	Spaulding & Rogers	Special Electric Tattoo Marker
Tattoo needle	Spaulding & Rogers	1310251	Tattoo 5 point needle
Tegaderm Transparent Film Dressing	3M	1.628	Large transparent adhesive dressing
Temperature-controlled hot plate	Cole-Parmer	03407-11	StableTemp hot plate stirrer
Thermometer	American Scientific	U14295	Tube mercury thermometerr
Tiletamine and zolazepam hydrochloride	Zoetis	NDC:54771-9050	Telazol
Tincture of Benzoin Spray	Smith&Nephew	407000	Adhesive layer spray
Triple Antibiotic ointment	Fougera	NDC 0168-0012-31	Triple antibiotic ointment
Tubular stockinette	Medline	NONNET02	Curad Medline Latex Free Elastic Nets
Warming blanket	3M	Bair Hugger 750 warming unit
Xeroform Occlusive Gauze Strip	Covidien	8884433301	Xeroform petrolatum wound dressings
Xylazine	Vetone	NDC:13985-704-10	AnaSed LA
Yucatàn minipigs (female, 30 kg)	Sinclair Bio Resources	N/A	Full pigmentation