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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello riproducibile di ustione multi-profondità in un minipig dello Yucatan.

Abstract

La guarigione delle ferite da ustione è un processo complesso e lungo. Nonostante la vasta esperienza, i chirurghi plastici e le équipe specializzate nei centri ustionati devono ancora affrontare sfide significative. Tra queste sfide, l'estensione dei tessuti molli ustionati può evolvere nella fase iniziale, creando un delicato equilibrio tra trattamenti conservativi e rimozione necrosa del tessuto. Le ustioni termiche sono il tipo più comune e la profondità di combustione varia a seconda di molteplici parametri, come la temperatura e il tempo di esposizione. Anche la profondità dell'ustione varia nel tempo e l'aggravamento secondario della "zona d'ombra" rimane un fenomeno poco compreso. In risposta a queste sfide, sono stati studiati diversi trattamenti innovativi e altri sono in fase iniziale di sviluppo. Le nanoparticelle nelle moderne medicazioni per ferite e nella pelle artificiale sono esempi di queste terapie moderne ancora in fase di valutazione. Nel loro insieme, sia la diagnosi che i trattamenti delle ustioni necessitano di progressi sostanziali e i team di ricerca hanno bisogno di un modello affidabile e pertinente per testare nuovi strumenti e terapie. Tra i modelli animali, i suini sono i più rilevanti a causa delle loro forti somiglianze nella struttura della pelle con gli esseri umani. Più specificamente, i maialini dello Yucatan mostrano caratteristiche interessanti come la pigmentazione della melanina e la crescita lenta, che consentono di studiare fototipi elevati e la guarigione a lungo termine. Questo articolo si propone di descrivere un protocollo affidabile e riproducibile per studiare le ferite da ustione multi-profondità nei minipig dello Yucatan, consentendo un follow-up a lungo termine e fornendo un modello rilevante per la diagnosi e gli studi terapeutici.

Introduzione

Le ustioni sono un grave problema di salute pubblica e colpiscono più di 480.000 pazienti negli Stati Uniti ogni anno, secondo il National Burn Repository 1,2. Ciò porta a più di 50.000 ricoveri all'anno per casi complessi non fatali che richiedono cure approfondite2. Inoltre, le ustioni sono una causa fondamentale di mortalità e morbilità militare e sono responsabili del 10-30% delle vittime militari 3,4. La gestione delle ustioni è rimasta pressoché invariata per molto tempo, nonostante i suoi impatti immensi e diversificati sui pazienti, che vanno da quelli fisici a quelli psicologici ed emotivi.

La diagnosi iniziale e la valutazione delle lesioni da ustione portano a una classificazione di base in base al tipo di ustioni (prima, seconda e terza) o alla profondità del tessuto interessato (ustioni superficiali, a spessore parziale e profonde)6,7,8. Le ustioni a spessore parziale (di primo e secondo grado) coinvolgono l'epidermide e diverse profondità del derma (derma superficiale o profondo, cioè ustioni superficiali e profonde di secondo grado)9. In particolare, il danno alle appendici nel derma profondo esclude la possibilità di riepitelizzazione dall'epitelio annessiale10. Per definizione, le ustioni a tutto spessore raggiungono il grasso sottocutaneo, la fascia e/o il muscolo sottostante (ustioni di terzo grado) e talvolta l'osso (dette anche ustioni di quarto grado)11,12.

Dopo il ricovero in ospedale, i pazienti ustionati ricevono un'assistenza speciale che prevede una strategia che consiste in un delicato equilibrio tra lo sbrigliamento dei tessuti e la conservazione. I tessuti molli danneggiati e/o secondariamente infetti devono essere progressivamente rimossi fino a quando il tessuto sano non viene esposto, consentendo l'uso di medicazioni specifiche e innesti cutanei per migliorare il processo di guarigione 13,14,15,16. Tuttavia, è necessaria cautela durante l'intervento chirurgico per evitare la rimozione involontaria del tessuto in via di guarigione e ridurre le complicanze per un recupero ottimale. Biologicamente, le ustioni mostrano un'area necrotica centrale circondata da una zona "ombra" o "stasi", che indica un'ischemia potenzialmente reversibile. Quest'area può deteriorarsi, provocando un'estensione della zona di necrosi, o guarire invertendo il processo apoptotico17,18. Questa gravità variabile delle ustioni presenta sfide per i chirurghi da valutare con precisione, complicando l'equilibrio tra trattamenti conservativi ed escissione chirurgica19. Ad oggi, non è disponibile alcuno strumento efficiente per aiutare a caratterizzare questa "zona d'ombra" che precede la conversione della combustione. Lo sviluppo di tali strumenti è fondamentale per ottimizzare questo delicato equilibrio.

Diversi trattamenti sono stati testati per aiutare a ridurre la conversione dell'ustione secondaria. Tuttavia, nessuna terapia specifica è attualmente disponibile nella clinica18. Altri esempi di progressi nei trattamenti delle ustioni includono lo sviluppo di moderne medicazioni per ferite e nanomateriali20,21, pelle ingegnerizzata tissutale22,23 e nuovi approcci di coltura epidermica24,25. Inoltre, la moderna chirurgia ricostruttiva e i lembi fasciocutanei hanno migliorato la gestione dei postumi a lungo termine, in particolare le contratture da ustione a seguito di guarigione patologica delle aree di piega26,27. Questi progressi offrono prospettive promettenti per i pazienti ustionati, migliorando le loro strategie di trattamento e la qualità della vita, ma risultati recenti mostrano che l'impatto funzionale rimane ancora sostanziale, sia nella sfera fisica che in quella psicologica28. Nel complesso, la domanda di progressi innovativi sia nella diagnosi che nel trattamento delle ustioni è sostanziale.

Nel complesso, molti approcci mirano a migliorare la diagnosi, la gestione e il trattamento di casi di ustioni complessi e i ricercatori hanno bisogno di un modello riproducibile e pertinente per testare questi nuovi approcci. A causa della sua complessità biologica, che coinvolge diversi organi e reazioni sistemiche, nessun modello in vitro si è dimostrato rilevante per studiare il processo della ferita da ustione29. I modelli di roditori hanno mostrato importanti discrepanze con gli esseri umani a causa di importanti differenze nella biologia, nell'architettura della pelle, nell'elasticità e nella mancanza di aderenza alle strutture sottostanti29. Al contrario, il modello suino si è dimostrato rilevante a causa della somiglianza strutturale della pelle suina con la pelle umana 30,31,32. Si presenta con una vascolarizzazione, una composizione elastica delle fibre e tempi di rinnovamento simili. Inoltre, il follicolo pilifero e gli annessi apocrini consentono la riepitelizzazione isolata, come si può osservare nelle ustioni superficiali cliniche 33,34. Più specificamente, i modelli di minipig dello Yucatan forniscono caratteristiche interessanti, che li rendono rilevanti per lo studio della pelle pigmentata35 e risultati a lungo termine con cambiamenti fisici minimi36.

Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere un modello affidabile di ustione multi-grado nei suini dello Yucatán, consentendo lo studio di diverse ustioni di secondo e terzo grado sullo stesso argomento. Ciò fornisce un modello rilevante e riproducibile per lo studio delle innovazioni diagnostiche e terapeutiche per la gestione delle ustioni. Inoltre, questo modello presenta diversi tipi e gravità di ustioni, un follow-up a lungo termine che consente lo studio della contrattura dell'ustione e della guarigione patologica e un comportamento differenziale della pelle pigmentata, che è noto per avere caratteristiche specifiche.

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali è stato eseguito in conformità con la lista di controllo ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments)37 ed è stato conforme al Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) secondo il protocollo #2021N000271. Agli animali è stata fornita un'assistenza umanitaria, seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio38. Per questi esperimenti sono state utilizzate cinque femmine di maialino dello Yucatán da 30 kg. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Cure preoperatorie e anestesia

  1. Digiunare gli animali per 12 ore prima dell'anestesia generale.
  2. Iniziare l'anestesia con un'iniezione intramuscolare di 2-4 mg/kg di tiletamina cloridrato e zolazepam cloridrato e 1-2 mg/kg di xilazina, seguita da inalazione di isoflurano (2-3% in ossigeno) (vedi Tabella dei materiali) per mantenere l'anestesia durante la procedura.

2. Progettazione e randomizzazione delle ferite da ustione

  1. Al fine di studiare sia le ustioni parziali che quelle a tutto spessore con controlli negativi sullo stesso animale (nessuna variazione interindividuale), creare otto ferite sul dorso di ciascun maiale nella zona paravertebrale. Esegui tre ferite a tutto spessore, tre ferite a spessore parziale e due ferite di controllo.
  2. Numerare le ferite da 1 a 8 ed eseguire la randomizzazione per assegnare diversi gradi di ustione (spessore parziale, spessore completo, controllo) a diverse posizioni anatomiche sulla schiena.
    NOTA: La randomizzazione di ciascuna ferita (profondità e posizione) viene eseguita per migliorarne il significato: è noto che il derma di maiale varia in termini di spessore e composizione del collagene39. Pertanto, la randomizzazione su ciascun animale viene utilizzata per ridurre i potenziali pregiudizi.

3. Delimitazione della ferita del tatuaggio

NOTA: La prima procedura consiste nella creazione di tatuaggi circolari sul dorso del maiale al fine di localizzare e numerare le ferite randomizzate (Figura 1). Questo viene eseguito due giorni prima della procedura di ustione iniziale per consentire una migliore acclimatazione, ma può essere eseguito il giorno della procedura di ustione.

  1. Dopo l'anestesia (vedi Passaggio 1) e l'intubazione orotracheale in posizione supina40, posizionare il suino in posizione prona e posizionare cunei morbidi (lenzuola) sotto l'animale per il suo comfort e la sua stabilizzazione (sotto gli arti anteriori, l'area ombelicale e gli arti posteriori)41. Posizionare una coperta riscaldante ad aria forzata sulla testa e sul collo dell'animale per mantenere una temperatura corporea adeguata.
  2. Posiziona una linea retta centralmente sul dorso del maiale per consentire la simmetrizzazione dei disegni.
  3. Tracciare due linee verticali con una penna dermografica (vedi Tabella dei Materiali) su entrambi i lati della linea centrale, posta a 6,5 cm lateralmente da essa. Le due linee laterali serviranno per posizionare il centro dei cerchi.
  4. Disegna simmetricamente ogni coppia di cerchi di 4,5 cm di diametro, mantenendo una distanza minima di 4 cm tra due cerchi distinti (Figura 1A).
  5. Una volta terminati i disegni, eseguire una preparazione cutanea in un unico passaggio (povidone-iodio 7,5%) per diminuire la flora batterica cutanea.
  6. Esegui la procedura del tatuaggio42 degli otto cerchi di 4,5 cm utilizzando una macchinetta per tatuaggi ad ago, inchiostro nero sterile e un ago sterilizzato a 5 punte (vedi Tabella dei materiali). Il risultato finale è presentato nella Figura 1B.
  7. In caso di ritardo nella procedura di creazione dell'ustione, applicare un unguento triplo antibiotico sui tatuaggi e coprirlo con medicazioni adesive trasparenti.

4. Creazione di ferite da ustione e medicazione avanzata delle ferite

NOTA: Le ustioni verranno create ponendo il blocco di ottone a contatto con la pelle sul punto dedicato (randomizzazione) per 30 s (invariabile). La temperatura determinerà la profondità di combustione.

  1. Il giorno della procedura di ustione, una volta che l'animale è stato anestetizzato e posto in posizione prona come discusso nel passaggio 1, posizionare blocchi cilindrici di ottone in contenitori di acciaio inossidabile riempiti con perline di alluminio (vedi Tabella dei materiali). Posizionare i contenitori su una piastra riscaldante a temperatura controllata. Impostare una piastra riscaldante a 65 °C (per le ustioni a spessore parziale) e la seconda a 93 °C (per le ustioni a tutto spessore, Figura 2).
    NOTA: Il contenitore può essere mantenuto asciutto per evitare scottature (2-3 ore necessarie per raggiungere l'equilibrio termico) o riempito a metà con acqua (30 min per raggiungere l'equilibrio termico). Se si utilizza acqua, i blocchi di ottone devono essere accuratamente asciugati prima del passaggio 4.5 per evitare successive ustioni dovute a scottature.
  2. Inserire un termometro nel cilindro di ottone attraverso la sua apertura centrale per monitorare la sua temperatura interna e confermare la temperatura superficiale con una pistola termica. Se necessario, aumentare la temperatura della piastra riscaldante a 65 °C o 93 °C nel cilindro nonostante una minore dissipazione del calore.
    NOTA: Il foglio di alluminio può essere utilizzato per coprire il contenitore e ridurre ulteriormente la dissipazione del calore, raggiungendo la temperatura desiderata più velocemente.
  3. Parallelamente, posizionare l'animale in posizione prona per la procedura di bruciatura, simile alla procedura del tatuaggio (passaggio 3.1).
  4. Una volta che l'animale è pronto in posizione prona, preparare la pelle in tre passaggi (povidone-iodio 7,5%, soluzione salina 0,9%, essiccazione).
  5. Afferra il blocco di ottone con guanti resistenti al calore e posizionalo sul punto dedicato al tatuaggio, a seconda della randomizzazione. Avvia il timer non appena il blocco di ottone tocca la pelle. Fare attenzione a non applicare sulla pelle una pressione superiore al peso del blocco di ottone.
  6. Dopo 30 s, rimuovere il blocco di ottone dalla pelle e riporlo nell'apposito contenitore riscaldante. Monitorare la temperatura fino a raggiungere il bersaglio e ripetere la procedura per tutte le ferite.
  7. Eseguire una medicazione multistrato avanzata per garantire la stabilità della medicazione dopo che l'animale si è ripreso.
    1. Posizionare una garza impregnata di petrolio su ogni punto di ustione, compresi i controlli, e coprirla con una garza asciutta in tessuto non tessuto e una grande medicazione adesiva trasparente.
    2. Spruzzare una tintura di soluzione di benzoino sulla pelle circostante per una migliore aderenza delle medicazioni trasparenti alla pelle.
    3. Avvolgere l'animale in una medicazione adesiva autoaderente facendo attenzione a non stringerla eccessivamente (restrizione dei volumi polmonari).
    4. Completare la medicazione aggiungendo un ultimo strato di rasato tubolare (misura adattata all'animale) (vedi Tabella dei Materiali). In alternativa, potrebbero essere utilizzate giacche suine su misura se l'animale non è in grado di mantenere pulita la medicazione per tutta la durata dello studio
    5. Garantire una corretta analgesia posizionando un cerotto transdermico per oppioidi (fentanil) sul collo dell'animale dopo aver iniettato una singola dose di buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, IM) e una singola dose di carprofene (2-4 mg/kg, IM).
    6. Dopo ogni anestesia, monitorare attentamente gli animali fino a 2 ore dopo il recupero. Se necessario, utilizzare un cuscinetto caldo e fornire cibo liberamente dopo aver raggiunto una posizione completamente eretta.

5. Escarotomia da ustione a tutto spessore

NOTA: Tra 1 e 3 giorni dopo l'intervento, gli animali riceveranno l'escissione chirurgica a tutto spessore dell'escara dopo le ustioni di terzo grado.

  1. Dopo una preparazione simile dell'animale, compresa l'anestesia, l'intubazione e il posizionamento dell'animale in posizione supina, preparare la pelle tramite la preparazione della pelle in tre fasi, eseguire il drappeggio sterile della schiena dell'animale.
  2. Eseguire biopsie con punzone da 4 mm (vedi Tabella dei materiali) sulla ferita per confermare il tipo di lesione.
  3. Eseguire l'escarotomia43,44 mediante un'incisione circolare dell'escara con una lama di bisturi sterile (n°15) fino a raggiungere il derma profondo.
  4. Afferrare saldamente un lato dell'escara con un paio di pinze sterili per tessuti Adson (con 2/1 denti) (vedi Tabella dei materiali) e agganciarla verso l'alto per rivelare il limite profondo dell'escara.
  5. Continuare l'escarotomia utilizzando la lama del bisturi rimanendo sullo stesso piano all'interno del derma profondo/fascia sottostante. Un derma sanguinante è considerato un segno di vitalità dei tessuti.
    1. Se un'arteriola viene tagliata durante il processo, eseguire una cauterizzazione minima utilizzando una pinza per coagulazione bipolare (vedi Tabella dei materiali). ATTENZIONE: Un'estesa cauterizzazione del letto della ferita creato può provocare una guarigione ritardata e deve essere rigorosamente evitata.
  6. Mettere una prima serie di guaze asciutti sul letto della ferita per 5 minuti per migliorare l'emostasi locale prima di posizionare la medicazione definitiva.
  7. Medicare le ferite in modo simile a come prima (passaggio 4.7), con l'aggiunta di diverse garze asciutte per riempire la cavità. Applicare gli stessi strati menzionati in precedenza: tintura spray al benzoino, medicazione adesiva trasparente, involucro autoadesivo, rasato tubolare.
  8. Fornire analgesia cambiando il cerotto transdermico oppioide e iniettando Caprofene (2-4 mg/kg, IM).

6. Medicazioni di follow-up

NOTA: Le medicazioni successive vengono eseguite ogni 2-7 giorni, a seconda del disegno del trattamento sperimentale e della tolleranza dell'animale. Le medicazioni delle ferite possono essere interrotte dopo 21 giorni per consentire la riepitelizzazione in un ambiente asciutto e migliorare la tolleranza dell'animale. In alternativa, se il gruppo di trattamento necessita di un ambiente umido o bagnato, le medicazioni possono essere prolungate fino alla fine dello studio. Il periodo di follow-up è stato prolungato fino a 10 settimane al fine di studiare sia i processi di guarigione acuti che quelli prolungati.

  1. Anestetizzare l'animale per un breve periodo e porlo in posizione supina con un cono nasale (isoflurano 2-5 L/min).
  2. Rimuovere le medicazioni precedenti e pulire le ferite utilizzando soluzione fisiologica sterile allo 0,9% e garza sterile.
  3. Applicare il trattamento sperimentale, se applicabile.
  4. Allo stesso modo, eseguire biopsie successive durante questa procedura, se necessario per lo studio. L'animale dovrebbe quindi ricevere farmaci antidolorifici come il carprofene (2-4 mg/kg, IM, effetto 24 ore).
  5. Coprire tutte le sedi delle ferite, comprese le ferite di controllo, con garze impregnate di petrolio o equivalenti, garze asciutte in tessuto non tessuto e medicazioni trasparenti adesive.

Risultati

Le figure 2A, B mostrano i risultati di ustioni multiple sul dorso di un maialino di Yucatàn. Le ferite (I) e (VII) sono ferite di controllo (37 °C). Ferite di secondo grado (II; III e VIII) si presentano con arrossamento intenso e vesciche. Al contrario, le ferite di terzo grado (IV; V; e VI) sono pallide e indurite alla palpazione. Va notato che la ferita VIII sembra intermedia tra il secondo e il terzo grado: ai fini di uno studio in co...

Discussione

La guarigione delle ferite a seguito di ustioni è un processo lungo che può richiedere fino a diversi mesi, con varie opzioni di trattamento e considerazioni per la cura del paziente 2,13. Per studiarlo è necessario un modello affidabile e riproducibile. Sono stati descritti diversi modelli animali, tra cui principalmente roditori 29,45,46 e suini

Divulgazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da un generoso finanziamento da Shriners Children's Research Grant a S.N.T. Y.B. è stato sostenuto da Shriners Hospital for Children. Riconosciamo anche con gratitudine il finanziamento a S.N.T. da parte del National Institute of Health degli Stati Uniti (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R01DK134590, R24OD034189), American Heart Association (18CDA34110049), Harvard Medical School Eleanor and Miles Shore Fellowship, Polsky Family Foundation e il Claflin Distinguished Scholar Award per conto del Dipartimento di Chirurgia MGH e/o del Comitato Esecutivo MGH per la Ricerca. Inoltre, riconosciamo il sostegno fornito dal Comitato Esecutivo di Ricerca del Massachusetts General Hospital per l'assegnazione del premio Fund for Medical Discovery (FMD) a R.J. Infine, il sostegno della "Fondation des Gueules Cassées" (Francia), dell'Università di Rennes (Francia), del CHU de Rennes (Francia) e della Società Francese di Chirurgia Plastica a Y.B. è molto apprezzato. Gli autori ringraziano il Knight Surgery Research Laboratory per il loro contributo e aiuto con l'anestesia degli animali.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Adson tissue forcepsJarit130-234
Aluminum beadsLab Armor42370-002Lab Armor Beads 
Buprenorphine hydrochlorideRanbaxy PharmaceuticalsNDC:12469-0757-01Buprenex Injectable
CarprofenPfizerNADA 141-199Rymadyl 50mg/ml injectable 
Cylindric brass blockHand-madeN/AEngineering drawing included in the manuscript
Dermographic penMcKessonSurgical Skin Marker Sterile
Disposable #15 surgical scalpelsMedlineMDS15315Scalpel blades
Fentanyl patchMylanNDC:60505-7082Fentanyl Transdermal System
Isoflurane PiramalNDC:66794-013-25Isoflurane, USP
McPherson Bipolar coagulation forcepsBovieA842Reusable, autoclavable
Miltex assorted biopsy punches (3,4 and 5 mm)Integra33-38Biopsy punches- size to adapt to the study
Non woven gauzeStarryshineGZNW222 x 2" non woven 4 ply medical gauze pads
Povidone-IodineBetadineNDC:0034-9200-88Surgical scrub 7.5% 
Sterile isotonic sodium chloride solution 0.9%Aqualite SystemRL-2095Sterile saline solution
Tattoo inkSpaulding & RogersBlack - 2 oz - #9053
Tattoo markerSpaulding & RogersSpecial Electric Tattoo Marker
Tattoo needleSpaulding & Rogers1310251Tattoo 5 point needle
Tegaderm Transparent Film Dressing3M1.628Large transparent adhesive dressing
Temperature-controlled hot plateCole-Parmer03407-11StableTemp hot plate stirrer
ThermometerAmerican ScientificU14295Tube mercury thermometerr
Tiletamine and zolazepam hydrochlorideZoetisNDC:54771-9050Telazol
Tincture of Benzoin SpraySmith&Nephew407000Adhesive layer spray
Triple Antibiotic ointmentFougeraNDC 0168-0012-31Triple antibiotic ointment
Tubular stockinetteMedlineNONNET02Curad Medline Latex Free Elastic Nets
Warming blanket3MBair Hugger 750 warming unit
Xeroform Occlusive Gauze StripCovidien8884433301Xeroform petrolatum wound dressings
XylazineVetoneNDC:13985-704-10AnaSed LA
Yucatàn minipigs (female, 30 kg)Sinclair Bio ResourcesN/AFull pigmentation 

Riferimenti

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