다발성 화상(Multiple Depth Burn Wounds)의 치유 과정을 조사하기 위한 돼지 화상 모델(A Swine Burn Model for Investigating the healing process in Multiple Depth Burn Wounds)

요약

이 프로토콜은 유카탄 미니피그에서 재현 가능한 다중 깊이 화상 상처 모델을 설명합니다.

초록

화상으로 인한 상처 치유는 복잡하고 긴 과정입니다. 광범위한 경험에도 불구하고 화상 센터의 성형외과 의사와 전문 팀은 여전히 심각한 문제에 직면해 있습니다. 이러한 어려움 중 화상을 입은 연조직의 범위는 초기 단계에서 진화할 수 있으며, 보존적 치료와 괴사 조직 제거 사이의 섬세한 균형을 이룰 수 있습니다. 열 화상은 가장 흔한 유형이며 화상 깊이는 온도 및 노출 시간과 같은 여러 매개 변수에 따라 달라집니다. 연소 깊이도 시간에 따라 달라지며, "그림자 영역"의 2차 악화는 잘 이해되지 않은 현상으로 남아 있습니다. 이러한 도전에 대응하기 위해 몇 가지 혁신적인 치료법이 연구되었으며 더 많은 치료법이 초기 개발 단계에 있습니다. 현대의 상처 드레싱과 인공 피부의 나노 입자는 아직 평가 중인 이러한 현대 치료법의 예입니다. 종합하면, 화상 진단과 화상 치료는 모두 상당한 발전이 필요하며, 연구팀은 새로운 도구와 치료법을 테스트하기 위해 신뢰할 수 있고 관련성 있는 모델이 필요합니다. 동물 모델 중에서 돼지는 인간과 피부 구조가 매우 유사하기 때문에 가장 관련성이 높습니다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 유카탄 미니피그는 멜라닌 색소 침착 및 느린 성장과 같은 흥미로운 특징을 보여 높은 광형과 장기적인 치유를 연구할 수 있습니다. 이 기사는 Yucatan minipigs의 다중 심도 화상 상처를 연구하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 프로토콜을 설명하여 장기 추적 관찰을 가능하게 하고 진단 및 치료 연구를 위한 관련 모델을 제공하는 것을 목표로 합니다.

서문

National Burn Repository ^1,2에 따르면 화상은 주요 공중 보건 문제이며 매년 미국에서 480,000명 이상의 환자에게 영향을 미칩니다. 이로 인해 치명적이지 않은 복합 사례로 인한 연간 50,000명 이상의 입원이 발생하고 있으며, 이는 심층적인 치료가 필요한 사례로 이어지고 있다². 더욱이, 화상은 군인 사망률과 이환율의 근본적인 원인이며, 군인 사상자의 10%에서 30%를 차지한다 ^3,4. 화상의 관리는 신체적 영향에서 심리적, 정서적 영향에 이르기까지 환자에게 미치는 엄청나고 다양한 영향에도 불구하고 오랫동안 거의 변하지 않았다⁵.

화상 부상의 초기 진단 및 평가는 화상 유형(1차, 2차 및 3차) 또는 영향을 받는 조직의 깊이(표재성, 부분 두께 및 깊은 화상)에 따라 기본 분류로 이어집니다^6,7,8. 부분 두께 화상(1도 및 2도 화상)은 표피와 진피의 다양한 깊이(표재성 또는 심층 진피, 즉 표재성 및 심층성 2도 화상)^를 포함합니다9. 특히, 심부 진피의 부속기에 대한 손상은 부속 상피(^{adnexal epithelium)(10})로부터의 재상피화(re-epithelialization)의 가능성을 배제한다. 정의에 따르면, 전층 화상은 피하 지방, 근막 및/또는 기저 근육(3도 화상)에 도달하며, 때로는 뼈(4도 화상이라고도 함)에 도달합니다^11,12.

입원 후, 화상 환자는 조직 괴사조직 제거와 보존 사이의 섬세한 균형으로 구성된 전략과 관련된 특수 치료를 받습니다. 손상되거나 이차적으로 감염된 연조직은 건강한 조직이 노출될 때까지 점진적으로 제거해야 하며, 이를 통해 특정 드레싱 및 피부 이식편을 사용하여 치유 과정을 개선할 수 있다 13,14,15,16. 그러나 수술 중에는 치유 조직이 의도치 않게 제거되지 않도록 주의하고 최적의 회복을 위해 합병증을 줄여야 합니다. 생물학적으로 화상은 '그림자' 또는 '정지' 영역으로 둘러싸인 중앙 괴사 영역을 나타내며 이는 잠재적으로 가역적인 허혈을 나타냅니다. 이 부위는 악화되어 괴사 영역이 확장되거나 세포 사멸 과정을 역전시켜 치유될 수 있습니다^17,18. 이처럼 화상의 정도가 다양하면 외과의가 정확하게 평가하기 어려워 보존적 치료와 외과적 절제 사이의 균형을 복잡하게 만든다¹⁹. 현재까지 소각 변환 전의 이 "그림자 영역"을 특성화하는 데 도움이 되는 효율적인 도구는 없습니다. 이러한 도구를 개발하는 것은 이 섬세한 균형을 최적화하는 데 매우 중요합니다.

2차 화상 전환을 줄이는 데 도움이 되는 몇 가지 치료법이 테스트되었습니다. 그러나 현재 임상에서 사용할 수 있는 특정 치료법은 없다¹⁸. 화상 치료의 발전의 다른 예로는 현대식 상처 드레싱 및 나노 물질^20,21, 조직 공학 피부 ^22,23 및 새로운 표피 배양 접근법^24,25의 개발이 있습니다. 또한, 현대의 재건 수술과 피부 근막 피판은 장기적인 후유증, 특히 접힌 부위의 병리학적 치유에 따른 화상 구축의 관리를 개선했다^26,27. 이러한 발전은 화상 환자에게 치료 전략과 삶의 질을 개선하여 유망한 전망을 제공하지만, 최근의 결과는 신체적 및 심리적 영역 모두에서 기능적 영향이 여전히 상당하다는 것을 보여준다²⁸. 종합하면, 화상 진단과 화상 치료 모두에서 혁신적인 발전에 대한 수요는 상당합니다.

전반적으로 많은 접근 방식이 복잡한 화상 사례의 진단, 관리 및 치료를 개선하는 것을 목표로 하고 있으며, 연구자는 이러한 새로운 접근 방식을 테스트하기 위해 재현 가능하고 관련성 있는 모델이 필요합니다. 여러 장기 및 전신 반응을 포함하는 생물학적 복잡성으로 인해 화상 상처 과정을 연구하는 데 관련성이 입증된 시험관 내 모델은 없었다²⁹. 설치류 모델은 생물학, 피부 구조, 탄력성 및 기본 구조에 대한 부착 부족의 주요 차이로 인해 인간과 큰 불일치를 보였다²⁹. 대조적으로, 돼지 모델은 돼지 피부와 인간 피부의 구조적 유사성으로 인해 관련성이 있음이 입증되었습니다 30,31,32. 그것은 유사한 혈관화, 탄성 섬유 구성 및 재생 타이밍을 나타냅니다. 더욱이, 모낭 및 아포크린 부속물은 임상적 표재성 화상에서 관찰될 수 있는 바와 같이 섬형 재상피화를 허용한다^33,34. 좀 더 구체적으로 말하자면, 유카탄 미니피그 모델은 색소 피부⁽³⁵)를 연구하고 최소한의 신체적 변화로 장기적인 결과를 얻는 데 중요한 특징을 제공한다(³⁶).

이 기사의 목적은 유카탄 돼지의 신뢰할 수 있는 다각도 화상 모델을 설명하여 동일한 주제에 대한 여러 2도 및 3도 화상을 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 화상 관리를 위한 진단 및 치료 혁신을 연구하기 위한 적절하고 재현 가능한 모델을 제공합니다. 또한, 이 모델은 다양한 화상 유형 및 중증도, 화상 구축 및 병리학적 치유를 연구할 수 있는 장기 추적 관찰, 특정 특성을 가진 것으로 알려진 색소 피부 감별 행동을 특징으로 합니다.

프로토콜

모든 동물 작업은 ARRIVE(Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) 체크리스트³⁷ 에 따라 수행되었으며 프로토콜 #2021N000271에 따라 Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)를 준수했습니다. 실험동물의 관리 및 사용에 대한 가이드³⁸에 따라 동물에 대한 인도적인 보살핌이 제공되었습니다. 이 실험에는 30kg의 암컷 유카탄 미니피그 5마리가 사용되었다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 재료 표 참조).

1. 수술 전 관리 및 마취

1. 전신 마취 전에 12시간 동안 동물을 단식시킵니다.
2. 2-4 mg/kg의 틸레타민 염산염 및 졸라제팜 염산염과 1-2 mg/kg의 자일라진을 근육 주사로 마취를 시작한 후 시술 중 마취를 유지하기 위해 이소플루란(산소 내 2-3%)을 흡입합니다( 재료 표 참조).

2. 화상 상처 설계 및 무작위 배정

1. 동일한 동물에 대한 음성 대조군에 의한 부분 및 전체 두께의 화상을 모두 연구하기 위해(개체 간 변동 없음) 각 돼지의 척추 주위 부위에 8개의 상처를 만듭니다. 전층 상처 3개, 부분 두께 상처 3개, 대조군 상처 2개를 집다.
2. 상처에 1에서 8까지 번호를 매기고 무작위 추출을 수행하여 등의 다른 해부학적 위치에 다른 화상 각도(부분 두께, 전체 두께, 대조군)를 할당합니다.
   참고: 각 상처(깊이 및 위치)의 무작위화는 유의성을 향상시키기 위해 수행됩니다: 돼지 진피는 두께와 콜라겐 구성 측면에서 다양한 것으로 알려져 있습니다³⁹. 따라서 잠재적 편향을 줄이기 위해 각 동물에 대한 무작위 배정이 사용됩니다.

3. 문신 상처 구분

참고: 첫 번째 절차는 무작위 상처의 위치를 파악하고 번호를 매기기 위해 돼지의 등쪽에 원형 문신을 만드는 것으로 구성됩니다(그림 1). 이것은 더 나은 적응을 위해 초기 화상 절차 이틀 전에 수행되지만 화상 절차 당일에 수행할 수 있습니다.

1. 앙와위 자세(⁴⁰)에서 마취(1단계 참조) 및 구강 삽관 후, 돼지를 엎드린 자세에 놓고, 동물의 편안함과 안정화를 위해 부드러운 쐐기(침대 시트)를 동물 아래에 놓습니다(앞다리 아래, 배꼽 부위 및 뒷다리 아래)⁴¹. 적절한 체온을 유지하기 위해 동물의 머리와 목에 강제 공기 보온 담요를 놓습니다.
2. 그림의 대칭을 허용하기 위해 돼지의 등 중앙에 직선을 배치합니다.
3. 피부학 펜( 재료 표 참조)을 사용하여 중심선의 양쪽에 두 개의 수직선을 그리고 중앙선에서 측면으로 6.5cm 떨어진 곳에 그립니다. 두 개의 측면 선은 원의 중심을 배치하는 데 사용됩니다.
4. 직경이 4.5cm인 원의 각 쌍을 대칭으로 그리고 두 개의 서로 다른 원 사이에 최소 4cm의 거리를 유지합니다(그림 1A).
5. 그림이 완성되면 피부 세균총을 줄이기 위해 1단계 피부 준비(포비돈-요오드 7.5%)를 수행합니다.
6. 바늘 문신 기계, 멸균 검정 잉크 및 멸균된 5점 바늘을 사용하여 8개의 4.5cm 원 중⁴² 개의 문신 절차를 수행합니다( 재료 표 참조). 최종 결과는 그림 1B에 나와 있습니다.
7. 화상 생성이 지연된 경우 문신에 3중 항생제 연고를 바르고 투명 접착 드레싱으로 덮습니다.

4. 화상 상처 생성 및 고급 상처 드레싱

참고: 화상은 황동 블록을 전용 스폿(무작위)의 피부에 접촉하도록 30초(불변) 동안 놓으면 생성됩니다. 온도는 연소 깊이를 결정합니다.

1. 화상 절차 당일, 동물을 마취하고 1단계에서 논의한 대로 엎드린 자세를 취하면 알루미늄 구슬로 채워진 스테인리스 스틸 용기에 원통형 황동 블록을 넣습니다( 재료 표 참조). 온도가 조절되는 핫 플레이트에 용기를 놓습니다. 하나의 핫 플레이트를 65°C(부분 두께 화상의 경우)로 설정하고 두 번째 열판을 93°C(전체 두께 화상의 경우, 그림 2)로 설정합니다.
   알림: 용기는 화상을 입지 않도록 건조한 상태로 유지하거나(온도 평형에 도달하는 데 2-3시간 필요) 물을 반쯤 채운 상태(온도 평형에 도달하는 데 30분)할 수 있습니다. 물을 사용하는 경우 화상으로 인한 후속 화상을 방지하기 위해 4.5단계 전에 황동 블록을 완전히 건조시켜야 합니다.
2. 중앙 개구부를 통해 황동 실린더에 온도계를 삽입하여 중심 온도를 모니터링하고 온도 총으로 표면 온도를 확인합니다. 필요한 경우 약간의 열 방출에도 불구하고 실린더에서 핫 플레이트의 온도를 65°C 또는 93°C로 높입니다.
   알림: 알루미늄 호일을 사용하여 용기를 덮고 열 방출을 더욱 최소화하여 원하는 온도에 더 빨리 도달할 수 있습니다.
3. 동시에 문신 절차(3.1단계)와 유사하게 연소 절차를 위해 동물을 엎드린 위치에 놓습니다.
4. 동물이 엎드린 자세가 되면 3단계(포비돈-요오드 7.5%, 식염수 0.9%, 건조)로 피부를 준비합니다.
5. 내열 장갑으로 황동 블록을 잡고 무작위 배정에 따라 전용 문신 부위에 놓습니다. 황동 블록이 피부에 닿자마자 타이머를 시작하십시오. 황동 블록의 자체 무게보다 피부에 더 많은 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.
6. 30초 후 피부에서 황동 블록을 제거하고 전용 가열 용기에 다시 넣습니다. 목표에 도달할 때까지 온도를 모니터링하고 모든 상처에 대해 절차를 반복합니다.
7. 동물이 회복된 후 드레싱 안정성을 보장하기 위해 고급 다층 드레싱을 수행합니다.
   1. 제어 장치를 포함하여 각 화상 부위에 석유 함침 거즈를 놓고 마른 부직포 거즈와 큰 투명 접착 드레싱으로 덮습니다.
   2. 투명 드레싱이 피부에 더 잘 밀착되도록 주변 피부에 벤조인 용액 팅크를 뿌립니다.
   3. 동물을 자체 접착 접착 랩 드레싱으로 감싸고 과도하게 조이지 않도록 주의하십시오(폐 용적 제한).
   4. 튜브형 스톡키네트(동물에 적합한 크기)의 마지막 층을 추가하여 드레싱을 완성합니다( 재료 표 참조). 또는 동물이 연구 기간 동안 드레싱을 깨끗하게 유지할 수 없는 경우 맞춤형 돼지 재킷을 사용할 수 있습니다
   5. 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg, IM) 1회와 카프로펜(2-4mg/kg, IM) 1회를 주사한 후 동물의 목에 경피 오피오이드(펜타닐) 패치를 부착하여 올바른 진통을 보장합니다.
   6. 각 마취 후에는 회복 후 최대 2시간까지 동물을 면밀히 모니터링하십시오. 필요한 경우 따뜻한 패드를 사용하고 완전히 서 있는 위치에 도달한 후 음식을 자유롭게 제공하십시오.

5. 전층 화상 절개술

참고: 수술 후 1일에서 3일 사이에 동물은 3도 화상 후 에스카의 전체 두께 외과적 절제를 받게 됩니다.

1. 마취, 삽관 및 동물을 앙와위 위치에 놓는 것을 포함하여 동물의 유사한 준비 후, 3 단계 피부 준비를 통해 피부를 준비하고 동물의 등을 멸균 드레이핑합니다.
2. 부상 유형을 확인하기 위해 상처에 4mm 펀치 생검( 재료 표 참조)을 수행합니다.
3. 깊은 진피에 도달할 때까지 멸균 메스 칼날(n°15)로 에스카를 원형 절개하여 escharotomy^43,44를 수행합니다.
4. 한 쌍의 멸균 Adson 조직 겸자(2/1 치아 포함)( 재료 표 참조)로 에스카의 한쪽을 단단히 잡고 위쪽으로 연결하여 에스카의 깊은 한계를 드러냅니다.
5. 메스 블레이드를 사용하여 escharotomy를 계속하면서 깊은 진피/기저 근막 내에서 동일한 평면을 유지합니다. 출혈이 있는 진피는 조직 생존 가능성의 징후로 간주됩니다.
   1. 이 과정에서 세동맥이 절단된 경우 양극성 응고 겸자를 사용하여 최소한의 소작을 수행합니다( 재료 표 참조). 주의: 생성된 상처 부위를 광범위하게 소작하면 치유가 지연될 수 있으므로 엄격히 피해야 합니다.
6. 최종 드레싱을 놓기 전에 국소 지혈을 강화하기 위해 상처 부위에 첫 번째 건조 구아즈 세트를 5분 동안 올려 놓습니다.
7. 이전과 유사하게 상처 부위를 드레싱하고(4.7단계) 여러 개의 마른 거즈를 추가하여 구멍을 채웁니다. 앞서 언급 한 것과 동일한 레이어를 적용하십시오 : 팅크 벤조인 스프레이, 접착 투명 드레싱, 자체 접착 랩, 튜브형 스톡키넷.
8. opioïd 경피 패치를 변경하고 Caprofen(2-4 mg/kg, IM)을 주사하여 진통을 제공합니다.

6. 후속 상처 드레싱

참고: 후속 드레싱은 실험적 처리 설계와 동물의 내성에 따라 2-7일마다 수행됩니다. 상처 드레싱은 건조한 환경에서 재상피화를 허용하고 동물의 내성을 향상시키기 위해 21일 후에 중단할 수 있습니다. 또는 치료군이 습하거나 습한 환경을 필요로 하는 경우 연구가 끝날 때까지 드레싱을 연장할 수 있습니다. 급성 치유 과정과 장기간의 치유 과정을 모두 연구하기 위해 추적 관찰 기간을 최대 10주까지 연장했습니다.

1. 짧은 기간 동안 동물을 마취하고 노즈 콘(이소플루란 2-5L/min)으로 앙와위 위치에 놓습니다.
2. 이전 드레싱을 제거하고 멸균 0.9% 식염수와 멸균 거즈를 사용하여 상처를 청소합니다.
3. 해당되는 경우 실험적 치료를 적용하십시오.
4. 마찬가지로, 연구에서 필요한 경우 이 절차 중에 후속 생검을 수행합니다. 그런 다음 동물은 카프로펜(2-4mg/kg, IM, 24시간 효과)과 같은 진통제를 투여받아야 합니다.
5. 대조군 상처를 포함한 모든 상처 부위를 석유 함침 또는 이에 상응하는 거즈, 건식 부직포 거즈 및 접착성 투명 드레싱으로 덮습니다.

결과

그림 2A,B는 Yucatàn 미니피그의 등쪽에 여러 번 화상을 입힌 결과를 보여줍니다. 상처 (I)와 (VII)는 대조 상처(37 °C)입니다. 2도 상처(II; III 및 VIII)가 강렬한 발적과 물집이 나타납니다. 반면, 3도 상처(IV; V; VI)는 창백하고 촉진에 영향을 받습니다. 상처 VIII는 2도에서 3도의 중간으로 보인다는 점에 유의해야 합니다: 진행 중인 연구를 위해 65...

토론

화상에 따른 상처 치유는 최대 수개월이 걸릴 수 있는 긴 과정이며, 다양한 치료 옵션과 환자 치료를 위한 고려 사항이 있다 ^2,13. 이를 연구하기 위해서는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 모델이 필요합니다. 주로 설치류(29,45,46) 및 돼지(^29,47

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson tissue forceps	Jarit	130-234
Aluminum beads	Lab Armor	42370-002	Lab Armor Beads
Buprenorphine hydrochloride	Ranbaxy Pharmaceuticals	NDC:12469-0757-01	Buprenex Injectable
Carprofen	Pfizer	NADA 141-199	Rymadyl 50mg/ml injectable
Cylindric brass block	Hand-made	N/A	Engineering drawing included in the manuscript
Dermographic pen	McKesson	Surgical Skin Marker Sterile
Disposable #15 surgical scalpels	Medline	MDS15315	Scalpel blades
Fentanyl patch	Mylan	NDC:60505-7082	Fentanyl Transdermal System
Isoflurane	Piramal	NDC:66794-013-25	Isoflurane, USP
McPherson Bipolar coagulation forceps	Bovie	A842	Reusable, autoclavable
Miltex assorted biopsy punches (3,4 and 5 mm)	Integra	33-38	Biopsy punches- size to adapt to the study
Non woven gauze	Starryshine	GZNW22	2 x 2" non woven 4 ply medical gauze pads
Povidone-Iodine	Betadine	NDC:0034-9200-88	Surgical scrub 7.5%
Sterile isotonic sodium chloride solution 0.9%	Aqualite System	RL-2095	Sterile saline solution
Tattoo ink	Spaulding & Rogers	Black - 2 oz - #9053
Tattoo marker	Spaulding & Rogers	Special Electric Tattoo Marker
Tattoo needle	Spaulding & Rogers	1310251	Tattoo 5 point needle
Tegaderm Transparent Film Dressing	3M	1.628	Large transparent adhesive dressing
Temperature-controlled hot plate	Cole-Parmer	03407-11	StableTemp hot plate stirrer
Thermometer	American Scientific	U14295	Tube mercury thermometerr
Tiletamine and zolazepam hydrochloride	Zoetis	NDC:54771-9050	Telazol
Tincture of Benzoin Spray	Smith&Nephew	407000	Adhesive layer spray
Triple Antibiotic ointment	Fougera	NDC 0168-0012-31	Triple antibiotic ointment
Tubular stockinette	Medline	NONNET02	Curad Medline Latex Free Elastic Nets
Warming blanket	3M	Bair Hugger 750 warming unit
Xeroform Occlusive Gauze Strip	Covidien	8884433301	Xeroform petrolatum wound dressings
Xylazine	Vetone	NDC:13985-704-10	AnaSed LA
Yucatàn minipigs (female, 30 kg)	Sinclair Bio Resources	N/A	Full pigmentation