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摘要

在这里，我们提出了一种进行生物信息学相关性分析的方案，以预测艾蒿花粉主要过敏原 Art v 1 蛋白的物理化学性质、二级结构以及 B 和 T 辅助细胞表位，为后续开发青蒿花粉过敏性疾病疫苗和疾病治疗提供理论依据。

摘要

为分析艾蒿花粉过敏原 Art v 1 蛋白的序列特征并预测其 B 细胞和 Th（辅助性 T 细胞）细胞表位，参考 Genebank 获得 Art v 1 蛋白的基因序列和氨基酸序列。使用 ExPASy 的 Prot Param、TMHMM、DNAstar Protean、Swiss-Model、UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 和 IEDB 分析和预测蛋白质的理化性质、跨膜区域、二级结构、三级结构以及 B 细胞和 Th 细胞表位。

第v.1条蛋白由132个氨基酸残基组成，相对分子质量为13404.26，分子式为C584H903N157O181S12，pI值为7.49，脂溶指数为41.59，亲水指数为-0.454，认为为亲水性蛋白。不稳定性指数 （ii） 为 78.11，被归类为不稳定蛋白。蛋白质的 N 端有一个 α 螺旋跨膜区，位于 5-27 个氨基酸残基序列中，1-24 位是信号肽序列。有无规卷曲、β匝、α螺旋和β片，还包含亲水区、柔性区和表面可及性区结构。

三级结构的预测结果与二级结构的分析结果一致。预测了五个显性 B 细胞表位，分别是第 v 1 71-87 条、第 v 1 条 33-49、第 1 条 104-120、第 1 条 95-111 和第 1 条 86-102。有五个 Th 细胞显性表位，分别是第 1 条第 1 2-16 项、第 1 条第 3-17 项、第 1 条第 4-18 项、第 1 条第 1 5-19 项和第 1 条第 1 6-20 项。由于 B 细胞和 Th 细胞表位的存在，预计 Art v 1 蛋白具有良好的抗原性。

引言

艾蒿是菊科艾蒿属，广泛分布于内蒙古、甘肃和中国其他地区1。艾蒿花粉诱发的各种过敏性疾病通常是特应性个体反复接触花粉过敏原和产生生物活性介质引起的 I 型过敏，导致鼻粘膜、结膜和支气管的卡他性炎症，甚至哮喘发作2。WHO/IUIS 过敏原命名小组委员会3 目前已正式承认七种艾蒿过敏原，即第 1 条第 1 款至第 6 款和第 AN 7 款。Art v 1 蛋白是艾蒿花粉过敏的主要因素之一。它的分子量为 24-28 kDa，95% 的艾蒿花粉过敏个体可以识别4。它由一个 N 端 β 防御素样结构域组成，该结构域连接到一个富含 C 端的脯氨酸尾部。防御素代表在几种真核生物中表达的内源性抗菌多肽5。

目前，过敏原免疫疗法 （AIT） 是唯一一种除了避免接触过敏原之外还可以改变过敏性疾病自然病程的病因治疗6。近几十年来，过敏性疾病的患病率不断增加，这凸显了对过敏原分子及其在过敏诊断和治疗中的潜在应用的基础和临床研究的重要性。许多用于 AIT 的过敏原属于重组蛋白，其物理、化学和免疫特性适用于生产过敏原疫苗，过敏原降低。因此，AIT 被认为是有效预防和治疗过敏性疾病的主要手段，因为过敏疫苗相对容易以低成本生产7。然而，过去的疫苗开发完全依赖于分子生物学和免疫学实验。此外，表位鉴定对于疫苗开发至关重要，目前最可靠的表位鉴定方法是 X 射线晶体学和 NMR 技术;但是，它们既费时又昂贵8.因此，采用具有低成本、高速度优势的计算方法和工具来预测表位。

本文介绍了一种预测艾蒿花粉主要过敏原 Art v 1 蛋白理化性质、二级结构、三级结构和 B/Th 细胞表位的生物信息学相关分析方法。这将为后续青蒿花粉过敏性疾病疫苗和疾病治疗的发展提供理论依据。

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研究方案

1. 第 v 1 条蛋白的物理和化学性质

  1. 在基因库（材料表）中输入 AF493943.1 以获得第 v 1 项蛋白质的氨基酸序列（补充文件 1-补充图 S1）。
    注：Art v 1 蛋白包含 132 个氨基酸，由 624 bp 的基因序列编码。其氨基酸序列 （AAO24900.1） 为 MAKCSYVFCAVLLIFIVAIGEMEAAGSKLCEKTSKTYSG
    KCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYF
    DCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPSPPADGGSPP
    PPADGGSPPVDGGSPPPPSTH.
  2. 启动 Expasy ProtParam 工具（材料表），输入步骤 1.1 中提到的第 v 1 项蛋白质氨基酸序列。单击 “计算参数”按钮 以显示氨基酸组成、原子序数、分子式、相对分子量、正电荷和负电荷、等电点和不稳定指数（补充文件 1-补充图 S2）。
    注：不稳定性指数为 <40，表明蛋白质稳定;值> 40 表示蛋白质不稳定9。

2. 预测 Art v 1 蛋白的跨膜区域和信号肽

  1. 在在线软件 TMHMM Server v.2.0（材料表）中输入上述第 1 项蛋白质氨基酸序列。选择 Extensive， with graphics as Output format，点击 Submit 显示膜结构，获得跨膜蛋白的物理和化学特性（补充文件 1-补充图 S3）。
  2. 在 SignaIP1 服务器在线工具（材料表）中输入上述第 5.0 项蛋白质氨基酸序列。选择 Eukarya 作为 Organism 组 ，选择 Long output 作为 Output 格式，然后单击 Submit 并填写电子邮件地址以接收预测的蛋白质信号肽的结果（补充文件 1-补充图 S4）。

3. Art v 1 蛋白的二级结构预测

  1. 要分析第 v 1 章蛋白质的亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原指数，请在 GeneBank（材料表）中输入 AF493943.1，然后单击蛋白质 id AAO24900.1 |法斯特。将 FASTA 序列复制到新的文本文件中，并将文件类型修改为 FASTA（补充文件 1-补充图 5）。然后，启动软件 DNAstar protean 模块并打开 FASTA 文件以显示第 v 1 条蛋白质的二级结构（补充文件 1-补充图 S6）。

4. Art v 1 蛋白的三级结构预测和构象评价

  1. 要预测第 v 1 项蛋白质的三级结构模型，请在 Swiss-Model 在线软件（材料表）中输入上述第 v 1 项蛋白质氨基酸序列，点击 搜索模板，选择最高相似蛋白 2kpy.1.A 作为 模板，点击 构建模型 |模型 01，并下载 PDB 格式文件（补充文件 1-补充图 S7）。
  2. 要评估步骤 4.1 中显示的同源建模构象，请打开 UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 在线软件（材料表），然后单击 “选择文件 ”以上传步骤 4.1 中的 PDB 格式文件 |运行程序 |Procheck |结果 |拉氏图 （补充文件 1-补充图 S8）。

5. 第 v 1 蛋白 B 细胞表位的预测

  1. 要预测第 v 1 条蛋白的 B 细胞表位，打开 IEDB 分析资源在线工具（材料表）的网站，点击 抗原序列属性，输入上述第 v 1 条蛋白质氨基酸序列，选择方法 Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0，最后点击 提交 （补充文件 1-补充图 S9）。
  2. 打开 ABCpred 在线工具（材料表）的网站，输入上述第 1 项蛋白质氨基酸序列，0.51 作为阈值，16 作为用于预测的窗口长度，为重叠过滤器选择 ON，然后单击提交序列（补充文件 1-补充图 S10）。

6. Art v 1 蛋白的 Th 细胞表位的预测

  1. 要预测第 v 1 条蛋白的 Th 细胞表位，请打开 IEDB 分析资源在线工具（材料表）的网站，点击 MHC II 结合，并输入上述第 v 1 条蛋白质氨基酸序列。选择 NetMHCllpan 4.1 EL （推荐的表位预测因子-2023.09） 作为 预测方法，选择人类 作为 物种/基因座，DRB1*01：01 作为 HLA-DR，等位基因，15 作为 长度，按 百分位排名对肽进行排序，然后单击 提交 （补充文件 1-补充图 S11）。

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结果

ExPASy 的 Prot Param Tool 在线软件用于蛋白质10 的理化和功能表征。开放文本阅读框长度为 624 bp，编码 132 个氨基酸，编码蛋白质共 1,837 个原子，相对分子质量为 13,404.26。分子式为C584H903N157O181S12，其中排名前三位的氨基酸分别是脯氨酸（Pro，15.9%）、丙氨酸（Ala，12.1%）、甘氨酸（Gly，11.4%），其余氨基酸占比不到10...

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讨论

青蒿是我国最重要的户外过敏原之一，其花粉颗粒小，直径为19-25μm，易受风吹散，产生大量粉末。此外，患者过敏症状的严重程度与空气中的花粉含量相关5。第 v 1 条被认为是艾蒿花粉过敏的标志性过敏原，超过 95% 的艾蒿过敏患者对第 v 1 条敏感。在中国，~81% 的艾蒿过敏患者显示 Art v 1 可溶性免疫球蛋白 E （sIgE） 阳性14。

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披露声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

这项工作得到了宁夏自然科学基金 （2022AAC03601 和 2023AAC02087） 和宁夏医科大学研究基金 （XM2019052） 的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
ABCpredIndraprastha Institute of Information Technology, Indiahttps://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html
DNAstar Protean softwareDNASTAR, Inc.Version 7.1
Expasy ProtParam ToolSIB Swiss Institute of Bioinformaticshttps://web.expasy.org/protparam/
GeneBankNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
IEDB Analysis ResourceNational Institute of Allergy and Infectious Diseaseshttp://www.iedb.org/
SignaIP-5.0 ServerDTU Health Techhttps://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
Swiss-Model online softwareBIOZENTRUMhttps://swissmodel.expasy.org/interactive
TMHMM ServerDTU Health TechVersion 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
UCLA - DOE LAB SAVESUS Department of Energy Office of ScienceVersion 6.0https://saves.mbi.ucla.edu/

参考文献

  1. Liu, D., et al. Recombinant expression of allergen Art la 3.0101 and Art la 3.0102 of Artemisia lavandulaefolia pollen and characteristics of serum specific IgE reactivity. J Clin Dermatol. 49 (07), 398-402 (2020).
  2. Sun, X. Expression, purification and crystallization of Mugwort pollen allergy-associated MHC proteins [D]. , Wuhan Polytechnic University. (2016).
  3. Goodman, R. E., Breiteneder, H. The WHO/IUIS Allergen Nomenclature. Allergy. 74 (3), 429-431 (2019).
  4. Razzera, G., et al. Mapping the interactions between a major pollen allergen and human IgE antibodies. Structure. 18, 1011-1021 (2010).
  5. Zabel, M., et al. Art v 1 IgE epitopes of patients and humanized mice are conformational. J Allergy Clin Immunol. 150 (4), 920-930 (2022).
  6. Peng, G., Han, X. Research progress of specific immunotherapy in atopic dermatitis. J Clin Dermatol. 46 (08), 602-604 (2017).
  7. Gao, Z., et al. Artemisia pollen allergy in China: Component-resolved diagnosis reveals allergic asthma patients have significant multiple allergen sensitization. Allergy. 74, 284-293 (2019).
  8. Sun, P., et al. Bioinformatics resources and tools for conformational B-cell epitope prediction. Comput Math Methods Med. , 943636(2013).
  9. Aqel, A. An integrated multi-pronged reverse vaccinology and biophysical approaches for identification of potential vaccine candidates against Nipah virus. Saudi Pharm J. 31 (12), 101826(2023).
  10. Verma, N. K., Singh, B. Insight from the structural molecular model of cytidylate kinase from Mycobacterium tuberculosis. Bioinformation. 9 (13), 680-684 (2013).
  11. Peters, B., Nielsen, M., Sette, A. T Cell epitope predictions. Annu Rev Immunol. 38, 123-145 (2020).
  12. Andreatta, M., Nielsen, M. Bioinformatics tools for the prediction of T-cell epitopes. Methods Mol Biol. 1785, 269-281 (2018).
  13. Jahn-Schmid, B., et al. Antigen presentation of the immunodominant T-cell epitope of the major mugwort pollen allergen, Art v 1, is associated with the expression of HLA-DRB1 *01. J Allergy Clin Immunol. 115 (2), 399-404 (2005).
  14. Liu, D. Species identification and allergen analysis of Artemisia SPP in northern China [D]. , China Medical University. (2019).
  15. Li, T., Bu, G., Xi, G. Effects of heat treatment on the antigenicity, antigen epitopes, and structural properties of β-conglycinin. Food Chem. 346, 128962(2021).
  16. Li, Y., et al. Bioinformatic prediction of epitopes in the Emy162 antigen of Echinococcus multilocularis. Exp Ther Med. 6, 335-340 (2013).
  17. Qiao, R., et al. Main characteristics and prediction of T-cell epitopes of mite Derp1 protein. Chin J Biologicals. 34 (08), 969-973 (2021).
  18. Ramana, J., Mehla, K. Immunoinformatics and epitope prediction. Methods Mol Biol. 2131, 155-171 (2020).
  19. Ma, F., et al. Advance on prediction methods of B cell antigen epitope. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine. 43 (01), 63-67 (2016).
  20. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  21. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

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