JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע ניתוח מתאם ביואינפורמטי כדי לחזות את התכונות הפיזיקוכימיות, המבנה המשני ואפיטופים של תאי עזר B ו-T של חלבון האלרגן העיקרי של אבקת לענה Art v 1 כדי לספק בסיס תיאורטי לפיתוח הבא של חיסון למחלות אלרגיות של אבקת ארטמיסיה וטיפול במחלות.

Abstract

כדי לנתח את מאפייני הרצף של חלבון אלרגן אבקת לענה Art v 1 ולחזות את האפיטופים של תאי B ותאי Th (תאי T עוזרים), רצף הגנים ורצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 התקבלו על ידי התייחסות לבנק הגנים. Prot Param, TMHMM, DNAstar Protean, Swiss-Model, UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 ו-IEDB שימשו לניתוח וחיזוי תכונות פיזיקוכימיות, אזור טרנסממברני, מבנה משני, מבנה שלישוני ואפיטופים של תאי B ותאי Th של החלבון.

חלבון Art v 1 מורכב מ-132 שאריות חומצות אמינו, המשקל המולקולרי היחסי הוא 13404.26, הנוסחה המולקולרית היא C584H903N157O181S12, ערך pI הוא 7.49, מדד מסיסות השומנים הוא 41.59, והאינדקס ההידרופילי הוא -0.454, הנחשב לחלבון הידרופילי. מדד חוסר היציבות (ii) הוא 78.11, המסווג כחלבון לא יציב. לקצה ה-N של החלבון יש אזור טרנסממברני α-סלילי, הממוקם ברצף שאריות חומצות אמינו 5-27, והמיקום 1-24 הוא רצף פפטיד האות. ישנם סליל אקראי, β סיבובים, סליל α ויריעות β, והוא מכיל גם אזור הידרופילי, אזור גמיש ומבני אזור נגישות פני השטח.

תוצאות החיזוי של המבנה השלישוני עולות בקנה אחד עם תוצאות הניתוח של המבנה המשני. נחזו חמישה אפיטופים דומיננטיים של תאי B, שהיו Art v 1 71-87, Art v 1 33-49, Art v 1 104-120, Art v 1 95-111 ו-Art v 1 86-102. היו חמישה אפיטופים דומיננטיים של תא ה-Th, שהיו Art v 1 2-16, Art v 1 3-17, Art v 1 4-18, Art v 1 5-19 ו-Art v 1 6-20. חלבון Art v 1 צפוי להיות בעל אנטיגניות טובה בשל נוכחותם של אפיטופים של תאי B ותאי Th.

Introduction

לענה, סוג של ארטמיסיה ב-Compositae, נפוץ באופן נרחב במונגוליה הפנימית, גאנסו ואזורים אחרים בסין1. מחלות אלרגיות שונות הנגרמות על ידי אבקת לענה הן בדרך כלל אלרגיות מסוג I הנגרמות על ידי חשיפה חוזרת ונשנית של אנשים אטופיים לאלרגנים של אבקה ויצירת מתווכים ביו-אקטיביים, וכתוצאה מכך דלקת קטרלית ברירית האף, הלחמית והסימפונות ואפילו התקפי אסטמה2. ועדת המשנה של ארגון הבריאות העולמי/IUIS אלרגנים3 הכירה רשמית בשבעה אלרגנים של לענה נכון לעכשיו, כלומר, Art v 1-Art v 6 ו-Art AN 7. חלבון Art v 1 הוא אחד התורמים העיקריים לאלרגיות לאבקת לענה. יש לו משקל מולקולרי של 24-28 kDa וניתן לזהות אותו על ידי 95% מהאנשים האלרגיים לאבקת לענה4. הוא מורכב מתחום דמוי בטא-דפנסין N-terminal המחובר לזנב עשיר בפרולין C-terminal. דפנסינים מייצגים פוליפפטידים אנטי-מיקרוביאליים אנדוגניים המתבטאים במספר איקריוטים5.

נכון לעכשיו, אימונותרפיה לאלרגנים (AIT) היא הטיפול האטיולוגי היחיד שיכול לשנות את המהלך הטבעי של מחלות אלרגיות בנוסף להימנעות מחשיפה לאלרגנים6. השכיחות הגוברת של מחלות אלרגיות בעשורים האחרונים מדגישה את חשיבות המחקר הבסיסי והקליני על מולקולות אלרגן ויישומיהן הפוטנציאליים באבחון וטיפול באלרגיה. רבים מהאלרגנים המשמשים ל-AIT שייכים לחלבונים רקומביננטיים, שתכונותיהם הפיזיקליות, הכימיות והאימונולוגיות מתאימות לייצור חיסונים נגד אלרגנים עם אלרגניות מופחתת. לכן, AIT נחשב לאמצעי העיקרי למניעה וטיפול יעיל במחלות אלרגיות, שכן חיסוני אלרגיה קלים יחסית לייצור בעלות נמוכה7. עם זאת, פיתוח חיסונים בעבר היה תלוי אך ורק בביולוגיה מולקולרית ובניסויים אימונולוגיים. בנוסף, זיהוי אפיטומה חיוני לפיתוח חיסון, והשיטות האמינות ביותר לזיהוי אפיטופ הן קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן וטכניקות NMR כיום; עם זאת, הם גוזלים זמן ויקרים8. לפיכך, נעשה שימוש בשיטות וכלים חישוביים, עם היתרונות של עלות נמוכה ומהירות גבוהה, כדי לחזות אפיטופים.

מאמר זה מתאר שיטת ניתוח מתאם ביואינפורמטי לחיזוי התכונות הפיזיקוכימיות, המבנה המשני, המבנה השלישוני ואפיטופים של תאי B/Th של חלבון האלרגן העיקרי של אבקת לענה Art v 1. זה יספק בסיס תיאורטי לפיתוח הבא של חיסון למחלות אלרגיות של אבקת ארטמיסיה וטיפול במחלות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תכונות פיזיקליות וכימיות של חלבון Art v 1

  1. קלט AF493943.1 בבנק הגנים (טבלת החומרים) כדי להשיג את רצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 (קובץ משלים 1 - איור משלים S1).
    הערה: חלבון Art v 1 מכיל 132 חומצות אמינו, המקודדות על ידי 624 bp של רצפי גנים. רצף חומצות האמינו שלו (AAO24900.1) הוא MAKCSYVFCAVLLIFIVAIGEMEAAGSKLCEKTSKTYSG
    KCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYF
    DCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPSPPADGGSPSPP
    PPADGGSPPVDGGSPPPPSTH.
  2. הפעל את הכלי Expasy ProtParam (טבלת חומרים), והזין את רצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 המוזכר בשלב 1.1. לחץ על כפתור חישוב פרמטרים כדי להציג את הרכב חומצות האמינו, המספר האטומי, הנוסחה המולקולרית, המשקל המולקולרי היחסי, מטען חיובי ושלילי, נקודה איזואלקטרית ואינדקס אי-יציבות (קובץ משלים 1-איור משלים S2).
    הערה: מדד חוסר היציבות הוא <40 המציין שהחלבון יציב; ערך > 40 פירושו שהחלבון אינו יציב9.

2. חיזוי אזור טרנסממברני ופפטיד אות של חלבון Art v 1

  1. הזן את רצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 שהוזכר לעיל בתוכנה המקוונת TMHMM Server v.2.0 (טבלת חומרים). בחר נרחב, עם גרפיקה כפורמט פלט, לחץ על שלח כדי להציג את מבנה הממברנה, וקבל את המאפיינים הפיזיקליים והכימיים של חלבון טרנסממברני (קובץ משלים 1-איור משלים S3).
  2. הזן את רצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 שהוזכר לעיל בכלי המקוון SignaIP5.0 Server (טבלת חומרים). בחר Eukarya כקבוצת האורגניזם ופלט ארוך כפורמט הפלט, לאחר מכן, לחץ על שלח ומלא את כתובת הדואר האלקטרוני כדי לקבל את התוצאה של פפטיד אות החלבון החזוי (קובץ משלים 1 - איור משלים S4).

3. חיזוי מבנה משני של חלבון Art v 1

  1. כדי לנתח את ההידרופיליות, נגישות פני השטח, הגמישות ואינדקס האנטיגן של חלבון Art v 1, הזן AF493943.1 בבנק הגנים (טבלת חומרים), ולחץ על מזהה החלבון AAO24900.1 | פאסטה. העתק את רצף ה-FASTA לקובץ הטקסט החדש ושנה את סוג הקובץ כ-FASTA (קובץ משלים 1-איור משלים 5). לאחר מכן, הפעל את מודול התוכנה DNAstar protean ופתח את קובץ ה-FASTA כדי להציג את המבנה המשני של חלבון Art v 1 (קובץ משלים 1-איור משלים S6).

4. חיזוי מבנה שלישוני והערכת קונפורמציה של חלבון Art v 1

  1. כדי לחזות את מודל המבנה השלישוני של חלבון Art v 1, הזן את רצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 שהוזכר לעיל בתוכנה המקוונת של המודל השוויצרי (טבלת חומרים), לחץ על חפש תבניות, בחר את החלבון הדומה הגבוה ביותר 2kpy.1.A כתבנית, לחץ על בניית מודלים | דגם 01, והורד את קובץ פורמט PDB (קובץ משלים 1-איור משלים S7).
  2. כדי להעריך את קונפורמציית המידול ההומולוגית המוצגת בשלב 4.1, פתח את התוכנה המקוונת UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 (טבלת חומרים), ולחץ על בחר קובץ כדי להעלות את קובץ פורמט PDB בשלב 4.1 | הפעלת תוכניות | פרוצ'ק | תוצאה | חלקת רמאצ'נדראן (קובץ משלים 1 - איור משלים S8).

5. חיזוי אפיטופים של תאי B של חלבון Art v 1

  1. כדי לחזות את האפיטופ של תאי B של חלבון Art v 1, פתח את האתר של הכלי המקוון של משאבי ניתוח IEDB (טבלת חומרים), לחץ על מאפייני רצף אנטיגן, הזן את רצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 שהוזכר לעיל, ובחר בשיטה Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0, ולבסוף לחץ על שלח (קובץ משלים 1 - איור משלים S9).
  2. פתח את אתר האינטרנט של הכלי המקוון ABCpred (טבלת חומרים), הזן את רצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 שהוזכר לעיל, 0.51 כסף ו-16 כאורך החלון לשימוש לחיזוי, בחר ON עבור המסנן החופף ולחץ על שלח רצף (קובץ משלים 1 - איור משלים S10).

6. חיזוי אפיטופים של תאי Th של חלבון Art v 1

  1. כדי לחזות את האפיטופ של תא Th של חלבון Art v 1, פתח את האתר של הכלי המקוון של משאבי ניתוח IEDB (טבלת חומרים), לחץ על MHC II Binding והזן את רצף חומצות האמינו של חלבון Art v 1 שהוזכר לעיל. בחר NetMHCllpan 4.1 EL (מנבא אפיטופ מומלץ-2023.09) כשיטת החיזוי, האדם כמין/לוקוס, DRB1*01:01 כ-HLA-DR, אלל, 15 כאורך, מיין את הפפטידים לפי דירוג אחוזון, ולחץ על שלח (קובץ משלים 1-איור משלים S11).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התוכנה המקוונת Prot Param Tool של ExPASy שימשה לאפיון פיזיוכימי ותפקודי של החלבון10. אורך מסגרת קריאת הטקסט הפתוח היה 624 bp, המקודד 132 חומצות אמינו, מקודד חלבונים עם סך של 1,837 אטומים ומשקל מולקולרי יחסי של 13,404.26. הנוסחה המולקולרית היא C584H903N157O181S12<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ארטמיסיה היא אחד האלרגנים החיצוניים החשובים ביותר בסין, וחלקיקי האבקה שלה קטנים, בקוטר של 19-25 מיקרומטר, אשר מתפזרים בקלות על ידי הרוח ומייצרים כמויות גדולות של אבקה. בנוסף, חומרת התסמינים האלרגיים של החולים נמצאת בקורלציה עם תכולת האבקה באוויר5. Art v 1 נחשב לאל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של נינגשיה (2022AAC03601 ו-2023AAC02087) וקרן המחקר של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה (XM2019052).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABCpredIndraprastha Institute of Information Technology, Indiahttps://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html
DNAstar Protean softwareDNASTAR, Inc.Version 7.1
Expasy ProtParam ToolSIB Swiss Institute of Bioinformaticshttps://web.expasy.org/protparam/
GeneBankNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
IEDB Analysis ResourceNational Institute of Allergy and Infectious Diseaseshttp://www.iedb.org/
SignaIP-5.0 ServerDTU Health Techhttps://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
Swiss-Model online softwareBIOZENTRUMhttps://swissmodel.expasy.org/interactive
TMHMM ServerDTU Health TechVersion 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
UCLA - DOE LAB SAVESUS Department of Energy Office of ScienceVersion 6.0https://saves.mbi.ucla.edu/

References

  1. Liu, D., et al. Recombinant expression of allergen Art la 3.0101 and Art la 3.0102 of Artemisia lavandulaefolia pollen and characteristics of serum specific IgE reactivity. J Clin Dermatol. 49 (07), 398-402 (2020).
  2. Sun, X. Expression, purification and crystallization of Mugwort pollen allergy-associated MHC proteins [D]. , Wuhan Polytechnic University. (2016).
  3. Goodman, R. E., Breiteneder, H. The WHO/IUIS Allergen Nomenclature. Allergy. 74 (3), 429-431 (2019).
  4. Razzera, G., et al. Mapping the interactions between a major pollen allergen and human IgE antibodies. Structure. 18, 1011-1021 (2010).
  5. Zabel, M., et al. Art v 1 IgE epitopes of patients and humanized mice are conformational. J Allergy Clin Immunol. 150 (4), 920-930 (2022).
  6. Peng, G., Han, X. Research progress of specific immunotherapy in atopic dermatitis. J Clin Dermatol. 46 (08), 602-604 (2017).
  7. Gao, Z., et al. Artemisia pollen allergy in China: Component-resolved diagnosis reveals allergic asthma patients have significant multiple allergen sensitization. Allergy. 74, 284-293 (2019).
  8. Sun, P., et al. Bioinformatics resources and tools for conformational B-cell epitope prediction. Comput Math Methods Med. , 943636(2013).
  9. Aqel, A. An integrated multi-pronged reverse vaccinology and biophysical approaches for identification of potential vaccine candidates against Nipah virus. Saudi Pharm J. 31 (12), 101826(2023).
  10. Verma, N. K., Singh, B. Insight from the structural molecular model of cytidylate kinase from Mycobacterium tuberculosis. Bioinformation. 9 (13), 680-684 (2013).
  11. Peters, B., Nielsen, M., Sette, A. T Cell epitope predictions. Annu Rev Immunol. 38, 123-145 (2020).
  12. Andreatta, M., Nielsen, M. Bioinformatics tools for the prediction of T-cell epitopes. Methods Mol Biol. 1785, 269-281 (2018).
  13. Jahn-Schmid, B., et al. Antigen presentation of the immunodominant T-cell epitope of the major mugwort pollen allergen, Art v 1, is associated with the expression of HLA-DRB1 *01. J Allergy Clin Immunol. 115 (2), 399-404 (2005).
  14. Liu, D. Species identification and allergen analysis of Artemisia SPP in northern China [D]. , China Medical University. (2019).
  15. Li, T., Bu, G., Xi, G. Effects of heat treatment on the antigenicity, antigen epitopes, and structural properties of β-conglycinin. Food Chem. 346, 128962(2021).
  16. Li, Y., et al. Bioinformatic prediction of epitopes in the Emy162 antigen of Echinococcus multilocularis. Exp Ther Med. 6, 335-340 (2013).
  17. Qiao, R., et al. Main characteristics and prediction of T-cell epitopes of mite Derp1 protein. Chin J Biologicals. 34 (08), 969-973 (2021).
  18. Ramana, J., Mehla, K. Immunoinformatics and epitope prediction. Methods Mol Biol. 2131, 155-171 (2020).
  19. Ma, F., et al. Advance on prediction methods of B cell antigen epitope. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine. 43 (01), 63-67 (2016).
  20. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  21. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Art V 1B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved