Bioinformatik-basierte Analysen und Vorhersage des B/th-Zell-Epitops des Beifußpollen-Allergens Art V 1 Protein

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung einer bioinformatischen Korrelationsanalyse vor, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Sekundärstruktur und die B- und T-Helferzell-Epitope des Beifußpollen-Hauptallergens Art v 1-Proteins vorherzusagen und eine theoretische Grundlage für die anschließende Entwicklung eines Artemisia-Pollen-Antikörper-Impfstoffs und einer Krankheitsbehandlung zu schaffen.

Zusammenfassung

Um die Sequenzeigenschaften des Beifußpollenallergens Art v 1 Protein zu analysieren und seine B-Zell- und Th-Zell-Epitope (T-Helferzelle) vorherzusagen, wurden die Gensequenz und die Aminosäuresequenz des Art v 1 Proteins unter Bezugnahme auf Genebank erhalten. Prot Param, TMHMM, DNAstar Protean, Swiss-Model, UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 und IEDB von ExPASy wurden verwendet, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Transmembranregion, die Sekundärstruktur, die Tertiärstruktur sowie die B-Zell- und Th-Zell-Epitope des Proteins zu analysieren und vorherzusagen.

Das Protein Art v 1 besteht aus 132 Aminosäureresten, das relative Molekulargewicht beträgt 13404,26, die Summenformel lautet C₅₈₄H₉₀₃N₁₅₇O₁₈₁S₁₂, der pI-Wert beträgt 7,49, der Lipidlöslichkeitsindex beträgt 41,59 und der hydrophile Index beträgt -0,454, was als hydrophiles Protein gilt. Der Instabilitätsindex (ii) beträgt 78,11, was als instabiles Protein eingestuft wird. Der N-Terminus des Proteins weist eine α-helikale Transmembranregion auf, die sich in der 5-27-Aminosäurerestsequenz befindet, und die Position 1-24 ist die Signalpeptidsequenz. Es gibt Zufallsspulen-, β-Wind-, α-Helix- und β-Bleche, und es enthält auch Strukturen im hydrophilen Bereich, im flexiblen Bereich und im Bereich der Oberflächenzugänglichkeit.

Die Vorhersageergebnisse der Tertiärstruktur stimmen mit den Analyseergebnissen der Sekundärstruktur überein. Es wurden fünf dominante B-Zell-Epitope vorhergesagt: Art v 1 71-87, Art v 1 33-49, Art v 1 104-120, Art v 1 95-111 und Art v 1 86-102. Es gab fünf Th-Zell-dominante Epitope, nämlich Art v 1 2-16, Art v 1 3-17, Art v 1 4-18, Art v 1 5-19 und Art v 1 6-20. Es wird vorhergesagt, dass das Art-v-1-Protein aufgrund des Vorhandenseins von B-Zell- und Th-Zell-Epitopen eine gute Antigenität aufweist.

Einleitung

Beifuß, eine Gattung von Artemisia in Compositae, ist in der Inneren Mongolei, in Gansu und anderen Regionen Chinas weit verbreitet¹. Verschiedene allergische Erkrankungen, die durch Beifußpollen hervorgerufen werden, sind in der Regel Typ-I-Allergien, die durch die wiederholte Exposition atopischer Personen gegenüber Pollenallergenen und die Bildung bioaktiver Mediatoren verursacht werden, was zu katarrhalischen Entzündungen der Nasenschleimhaut, der Bindehaut und des Bronchus und sogar zu Asthmaanfällen führt². Der WHO/IUIS-Unterausschuss^für das Nomenklatorium für Allergene 3 hat derzeit sieben Beifußallergene offiziell anerkannt, nämlich Art V 1 - Art V 6 und Art AN 7. Art v 1 Protein ist einer der Hauptverursacher von Beifußpollenallergien. Es hat ein Molekulargewicht von 24-28 kDa und kann von 95% der Personen, die gegen Beifußpollen allergisch sind, erkannt^{werden 4}. Es besteht aus einer N-terminalen Beta-Defensin-ähnlichen Domäne, die mit einem C-terminalen Prolin-reichen Schwanz verbunden ist. Defensine stellen endogene antimikrobielle Polypeptide dar, die in mehreren Eukaryoten exprimiert werden⁵.

Derzeit ist die Allergen-Immuntherapie (AIT) die einzige ätiologische Behandlung, die den natürlichen Verlauf allergischer Erkrankungen verändern und zusätzlich die Exposition gegenüber Allergenen vermeiden kann⁶. Die zunehmende Prävalenz allergischer Erkrankungen in den letzten Jahrzehnten unterstreicht die Bedeutung der Grundlagen- und klinischen Forschung zu Allergenmolekülen und ihren Anwendungsmöglichkeiten in der Allergiediagnose und -behandlung. Viele der Allergene, die für die AIT verwendet werden, gehören zu rekombinanten Proteinen, deren physikalische, chemische und immunologische Eigenschaften für die Herstellung von Allergenimpfstoffen mit reduzierter Allergenität geeignet sind. Daher gilt die AIT als das wichtigste Mittel zur wirksamen Vorbeugung und Behandlung allergischer Erkrankungen, da Allergieimpfstoffe relativ einfach und kostengünstig herzustellen sind⁷. Die Entwicklung von Impfstoffen hing in der Vergangenheit jedoch ausschließlich von molekularbiologischen und immunologischen Experimenten ab. Darüber hinaus ist die Identifizierung von Epitomen für die Impfstoffentwicklung von entscheidender Bedeutung, und die zuverlässigsten Methoden zur Identifizierung eines Epitops sind derzeit die Röntgenkristallographie und NMR-Techniken. Sie sind jedoch zeitaufwändig und teuer⁸. Daher wurden computergestützte Methoden und Werkzeuge mit den Vorteilen niedriger Kosten und hoher Geschwindigkeit eingesetzt, um Epitope vorherzusagen.

In dieser Arbeit wird eine bioinformatische Korrelationsanalysemethode zur Vorhersage der physikalisch-chemischen Eigenschaften, der Sekundärstruktur, der Tertiärstruktur und der B/Th-Zell-Epitope des Beifußpollen-Hauptallergens Art v 1 Protein beschrieben. Dies wird eine theoretische Grundlage für die anschließende Entwicklung eines Impfstoffs gegen Artemisia, Pollen, allergische Erkrankungen und die Behandlung von Krankheiten liefern.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Physikalische und chemische Eigenschaften des Proteins Art v 1

1. Geben Sie AF493943.1 in die Genbank (Table of Materials) ein, um die Aminosäuresequenz des Proteins Art v 1 zu erhalten (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S1).
   HINWEIS: Das Art v 1-Protein enthält 132 Aminosäuren, die von 624 bp Gensequenzen kodiert werden. Seine Aminosäuresequenz (AAO24900.1) ist MAKCSYVFCAVLLIFIVAIGEMEAAGSKLCEKTSKTYSG
   KCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYF
   DCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPPADGGSPP
   PPADGGSPPVDGGSPPPPSTH.
2. Starten Sie das Expasy ProtParam-Tool (Materialtabelle) und geben Sie die in Schritt 1.1 erwähnte Art v 1-Proteinaminosäuresequenz ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter berechnen , um die Aminosäurezusammensetzung, die Ordnungszahl, die Summenformel, das relative Molekulargewicht, die positive und negative Ladung, den isoelektrischen Punkt und den Instabilitätsindex anzuzeigen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S2).
   HINWEIS: Der Instabilitätsindex beträgt <40, was darauf hinweist, dass das Protein stabil ist. Ein Wert > 40 bedeutet, dass das Protein instabil^{ist 9}.

2. Vorhersage der Transmembranregion und des Signalpeptids des Art v 1 Proteins

1. Geben Sie die oben erwähnte Art v 1 Protein-Aminosäuresequenz in die Online-Software TMHMM Server v.2.0 (Table of Materials) ein. Wählen Sie Extensiv mit Grafiken als Ausgabeformat, klicken Sie auf Senden , um die Membranstruktur anzuzeigen und die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Transmembranproteins abzurufen (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S3).
2. Geben Sie die oben erwähnte Art v 1 Protein-Aminosäuresequenz in das Online-Tool des SignaIP5.0 Servers ein (Table of Materials). Wählen Sie Eukarya als Organismusgruppe und Long output als Ausgabeformat, klicken Sie dann auf Senden und geben Sie die E-Mail-Adresse ein, um das Ergebnis des vorhergesagten Proteinsignalpeptids zu erhalten (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S4).

3. Vorhersage der Sekundärstruktur des Art-v-1-Proteins

1. Um die Hydrophilie, die Oberflächenzugänglichkeit, die Flexibilität und den Antigenindex des Art v 1-Proteins zu analysieren, geben Sie AF493943.1 in GeneBank (Table of Materials) ein und klicken Sie auf die Protein-ID AAO24900.1 | FASTA. Kopieren Sie die FASTA-Sequenz in die neue Textdatei, und ändern Sie den Dateityp als FASTA (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung 5). Starten Sie dann die Software DNAstar Protean Module und öffnen Sie die FASTA-Datei, um die Sekundärstruktur des Art v 1-Proteins anzuzeigen (Supplemental File 1-Supplemental Figure S6).

4. Vorhersage der Tertiärstruktur und Konformationsbewertung des Art v 1-Proteins

1. Um das Tertiärstrukturmodell des Art-v-1-Proteins vorherzusagen, geben Sie die oben erwähnte Aminosäuresequenz des Art-v-1-Proteins in die Online-Software Swiss-Model (Table of Materials) ein, klicken Sie auf Nach Vorlagen suchen, wählen Sie das höchste ähnliche Protein 2kpy.1.A als Vorlage aus, klicken Sie auf Modelle erstellen | Modell 01 und laden Sie die Datei im PDB-Format herunter (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S7).
2. Um die in Schritt 4.1 angezeigte homologe Modellierungskonformation auszuwerten, öffnen Sie die Online-Software UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 (Table of Materials), und klicken Sie auf Datei auswählen , um die Datei im PDB-Format in Schritt 4.1 | Ausführen von Programmen | Procheck | Ergebnis | Ramachandran-Diagramm (Ergänzende Akte 1 - Ergänzende Abbildung S8).

5. Vorhersage von B-Zell-Epitopen des Art-v-1-Proteins

1. Um das B-Zell-Epitop des Art v 1-Proteins vorherzusagen, öffnen Sie die Website des Online-Tools IEDB Analysis Resource (Table of Materials), klicken Sie auf Antigensequenzeigenschaften, geben Sie die oben erwähnte Art v 1-Proteinaminosäuresequenz ein, wählen Sie die Methode Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 und klicken Sie schließlich auf Submit (Supplemental File 1-Supplemental Figure S9).
2. Öffnen Sie die Website des Online-Tools ABCpred (Table of Materials), geben Sie die oben erwähnte Proteinaminosäuresequenz Art v 1, 0,51 als Schwellenwert und 16 als Fensterlänge für die Vorhersage ein, wählen Sie ON für den überlappenden Filter und klicken Sie auf Sequenz einreichen (Ergänzende Datei 1-Ergänzende Abbildung S10).

6. Vorhersage der Th-Zell-Epitope des Art v 1 Proteins

1. Um das Th-Zell-Epitop des Art v 1-Proteins vorherzusagen, öffnen Sie die Website des Online-Tools IEDB Analysis Resource (Table of Materials), klicken Sie auf MHC II Binding und geben Sie die oben erwähnte Art v 1 Protein-Aminosäuresequenz ein. Wählen Sie NetMHCllpan 4.1 EL (recommended epitope predictor-2023.09) als Vorhersagemethode, Human als Spezies/Locus, DRB1*01:01 als HLA-DR, Allel, 15 als Länge, sortieren Sie die Peptide nach Perzentilrang und klicken Sie auf Submit (Supplemental File 1-Supplemental Figure S11).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Für die physiochemische und funktionelle Charakterisierung des Proteins¹⁰ wurde die Online-Software Prot Param Tool von ExPASy verwendet. Die Länge des Open-Text-Leserahmens betrug 624 bp und kodierte für 132 Aminosäuren, kodierte Proteine mit insgesamt 1.837 Atomen und einem relativen Molekulargewicht von 13.404,26. Die Summenformel lautet C₅₈₄H₉₀₃N₁₅₇O₁₈₁S₁₂, von denen die drei wichtigsten Aminosäuren P...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Artemisia ist eines der wichtigsten Freilandallergene in China, und seine Pollenpartikel sind mit einem Durchmesser von 19-25 μm klein, lassen sich leicht durch Wind verteilen und produzieren große Mengen an Pulver. Darüber hinaus korreliert die Schwere der allergischen Symptome der Patienten mit dem Pollengehalt in der Luft⁵. Art v 1 gilt als das wegweisende Allergen der Beifußpollenallergie, und mehr als 95 % der Patienten mit Beifußallergie reagieren empfi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABCpred	Indraprastha Institute of Information Technology, India		https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html
DNAstar Protean software	DNASTAR, Inc.	Version 7.1
Expasy ProtParam Tool	SIB Swiss Institute of Bioinformatics		https://web.expasy.org/protparam/
GeneBank	National Center for Biotechnology Information		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
IEDB Analysis Resource	National Institute of Allergy and Infectious Diseases		http://www.iedb.org/
SignaIP-5.0 Server	DTU Health Tech		https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
Swiss-Model online software	BIOZENTRUM		https://swissmodel.expasy.org/interactive
TMHMM Server	DTU Health Tech	Version 2.0	https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
UCLA - DOE LAB SAVES	US Department of Energy Office of Science	Version 6.0	https://saves.mbi.ucla.edu/