JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, artemisia polen alerjik hastalık aşısı ve hastalık tedavisinin müteakip gelişimi için teorik bir temel sağlamak amacıyla, pelin poleni ana alerjeni Art v 1 proteininin fizikokimyasal özelliklerini, ikincil yapısını ve B ve T yardımcı hücre epitoplarını tahmin etmek için biyoinformatik korelasyon analizi yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Pelin polen alerjeni Art v 1 proteininin dizi özelliklerini analiz etmek ve B hücresi ve Th (yardımcı T hücresi) hücre epitoplarını tahmin etmek için, Art v 1 proteininin gen dizisi ve amino asit dizisi Genebank'a başvurularak elde edilmiştir. Proteinin fizikokimyasal özelliklerini, transmembran bölgesini, ikincil yapısını, üçüncül yapısını ve B hücresi ve Th hücre epitoplarını analiz etmek ve tahmin etmek için ExPASy'nin Prot Param, TMHMM, DNAstar Protean, Swiss-Model, UCLA-DOE LAB SAVE v6.0 ve IEDB kullanıldı.

Art v 1 proteini 132 amino asit kalıntısından oluşur, bağıl moleküler ağırlık 13404.26, moleküler formül C584H903N157O181S12, pI değeri 7.49, lipit çözünürlük indeksi 41.59 ve hidrofilik indeks -0.454'tür, bu da hidrofilik protein olarak kabul edilir. Kararsızlık indeksi (ii), kararsız bir protein olarak sınıflandırılan 78.11'dir. Proteinin N-terminali, 5-27 amino asit kalıntı dizisinde bulunan α-sarmal bir transmembran bölgesine sahiptir ve 1-24 konumu, sinyal peptit dizisidir. Rastgele bobin, β dönüşlü, α sarmal ve β levha vardır ve ayrıca hidrofilik bölge, esnek bölge ve yüzey erişilebilirlik bölgesi yapıları içerir.

Üçüncül yapının tahmin sonuçları, ikincil yapının analiz sonuçları ile tutarlıdır. Beş baskın B hücresi epitopu tahmin edildi, bunlar Art v 1 71-87, Art v 1 33-49, Art v 1 104-120, Art v 1 95-111 ve Art V 1 86-102 idi. Art v 1 2-16, Art v 1 3-17, Art v 1 4-18, Art v 1 5-19 ve Art v 1 6-20 olmak üzere beş Th hücre baskın epitopu vardı. Art v 1 proteininin, B hücresi ve Th hücresi epitoplarının varlığından dolayı iyi bir antijeniteye sahip olduğu tahmin edilmektedir.

Giriş

Compositae'de bir Artemisia cinsi olan Mugwort, İç Moğolistan, Gansu ve Çin'in diğer bölgelerinde yaygın olarak dağıtılmaktadır1. Pelin poleninin neden olduğu çeşitli alerjik hastalıklar genellikle atopik bireylerin polen alerjenlerine tekrar tekrar maruz kalması ve biyoaktif mediatörlerin oluşması sonucu oluşan tip I alerjilerdir, bu da burun mukozası, konjonktiva ve bronşun nezle iltihabı ve hatta astım atakları ile sonuçlanır2. DSÖ / IUIS Alerjen Nomenklator Alt Komitesi3 , şu anda yedi pelin alerjenini resmi olarak tanımıştır, yani, Art v 1-Art v 6 ve Art AN 7. Art v 1 proteini, pelin poleni alerjilerine ana katkıda bulunanlardan biridir. 24-28 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahiptir ve pelin poleninealerjisi olan bireylerin% 95'i tarafından tanınabilir 4. C-terminali prolin açısından zengin bir kuyruğa bağlı N-terminal beta-defensin benzeri bir alandan oluşur. Defensinler, birkaç ökaryotta ifade edilen endojen antimikrobiyal polipeptitleri temsil eder5.

Günümüzde alerjen immünoterapisi (AIT), alerjenlere maruziyetten kaçınmanın yanı sıra alerjik hastalıkların doğal seyrini değiştirebilen tek etiyolojik tedavidir6. Son yıllarda allerjik hastalıkların artan prevalansı, alerjen molekülleri ve bunların alerji tanı ve tedavisinde potansiyel uygulamaları ile ilgili temel ve klinik araştırmaların önemini vurgulamaktadır. AIT için kullanılan alerjenlerin çoğu, fiziksel, kimyasal ve immünolojik özellikleri, alerjenitesi azaltılmış alerjen aşılarının üretimi için uygun olan rekombinant proteinlere aittir. Bu nedenle, alerji aşılarının düşük maliyetle üretilmesi nispeten kolay olduğundan, AIT, alerjik hastalıkları etkili bir şekilde önlemenin ve tedavi etmenin birincil yolu olarak kabul edilir7. Bununla birlikte, geçmişte aşı geliştirme yalnızca moleküler biyoloji ve immünolojik deneylere dayanıyordu. Ek olarak, epitom tanımlaması aşı geliştirme için esastır ve bir epitopun tanımlanması için en güvenilir yöntemler şu anda X-ışını kristalografisi ve NMR teknikleridir; Ancak, zaman alıcı ve pahalıdırlar8. Bu nedenle, epitopları tahmin etmek için düşük maliyet ve yüksek hız avantajları ile hesaplama yöntemleri ve araçları kullanılmıştır.

Bu makale, pelin poleni ana alerjeni Art v 1 proteininin fizikokimyasal özelliklerinin, ikincil yapısının, üçüncül yapısının ve B/Th hücre epitoplarının tahmini için bir biyoinformatik korelasyon analiz yöntemini açıklamaktadır. Bu, artemisia poleni, alerjik hastalık aşısı ve hastalık tedavisinin daha sonraki gelişimi için teorik bir temel sağlayacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Art v 1 proteininin fiziksel ve kimyasal özellikleri

  1. Art v 1 proteininin amino asit dizisini elde etmek için Gen Bankasına (Malzeme Tablosu) AF493943.1 girin (Ek Dosya 1-Ek Şekil S1).
    NOT: Art v 1 proteini, 624 bp gen dizisi tarafından kodlanan 132 amino asit içerir. Amino asit dizisi (AAO24900.1) MAKCSYVFCAVLLIFIVAIGEMEAAGSKLCEKTSKTYSG'dir.
    KCDNKKCDKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYF
    DCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPSPPADGGSPP
    PPADGGSPPVDGGSPPPPSTH.
  2. Adım 1.1'de bahsedilen Art v 1 protein amino asit dizisini girerek Expasy ProtParam Aracını (Malzeme Tablosu) başlatın. Amino asit bileşimini, atom numarasını, moleküler formülü, bağıl moleküler ağırlığı, pozitif ve negatif yükü, izoelektrik noktayı ve kararsızlık indeksini görüntülemek için Parametreleri hesapla düğmesine tıklayın (Ek Dosya 1-Ek Şekil S2).
    NOT: İnstabilite indeksi <40'tır, bu da proteinin stabil olduğunu gösterir; 40> bir değer, proteininkararsız olduğu anlamına gelir 9.

2. Art v 1 proteininin transmembran bölgesinin ve sinyal peptidinin tahmini

  1. Yukarıda belirtilen Art v 1 protein amino asit dizisini çevrimiçi yazılım TMHMM Server v.2.0'a (Malzeme Tablosu) girin. Çıktı formatı olarak grafiklerle Kapsamlı'yı seçin, membran yapısını görüntülemek için Gönder'e tıklayın ve transmembran proteinin fiziksel ve kimyasal özelliklerini elde edin (Ek Dosya 1-Ek Şekil S3).
  2. Yukarıda belirtilen Art v 1 protein amino asit dizisini SignaIP5.0 Server çevrimiçi aracına (Malzeme Tablosu) girin. Organizma grubu olarak Eukarya'yı ve Çıktı formatı olarak Uzun çıktı'yı seçin, ardından Gönder'e tıklayın ve tahmin edilen protein sinyal peptidinin sonucunu almak için e-posta adresini doldurun (Ek Dosya 1-Ek Şekil S4).

3. Art v 1 proteininin ikincil yapı tahmini

  1. Art v 1 proteininin hidrofilikliğini, yüzey erişilebilirliğini, esnekliğini ve antijen indeksini analiz etmek için GeneBank'a (Malzeme Tablosu) AF493943.1 girin ve protein kimliği AAO24900.1 | HIZLI. FASTA dizisini yeni metin dosyasına kopyalayın ve dosya türünü FASTA olarak değiştirin (Ek Dosya 1-Ek Şekil 5). Ardından, DNAstar protean modülünü başlatın ve Art v 1 proteininin ikincil yapısını görüntülemek için FASTA dosyasını açın (Ek Dosya 1-Ek Şekil S6).

4. Art v 1 proteininin üçüncül yapı tahmini ve konformasyon değerlendirmesi

  1. Art v 1 proteininin üçüncül yapı modelini tahmin etmek için, yukarıda belirtilen Art v 1 protein amino asit dizisini Swiss-Model çevrimiçi yazılımına (Malzeme Tablosu) girin, Şablon Ara'ya tıklayın, şablon olarak en yüksek benzer protein 2kpy.1.A'yı seçin, Modelleri Oluştur'a tıklayın | Model 01'e gidin ve PDB biçimindeki dosyayı indirin (Ek Dosya 1-Ek Şekil S7).
  2. Adım 4.1'de görüntülenen homolog modelleme konformasyonunu değerlendirmek için, UCLA-DOE LAB SAVE v6.0 çevrimiçi yazılımını (Malzeme Tablosu) açın ve adım 4.1'deki PDB formatındaki dosyayı yüklemek için Dosya seç'e tıklayın | Programları çalıştırın | Procheck | Sonuç | Ramachandran arsası (Ek Dosya 1-Ek Şekil S8).

5. Art v 1 proteininin B hücresi epitoplarının tahmini

  1. Art v 1 proteininin B hücresi epitopunu tahmin etmek için, IEDB Analiz Kaynağı çevrimiçi aracının web sitesini açın (Malzeme Tablosu), Antijen Dizi Özellikleri'ne tıklayın, yukarıda belirtilen Art v 1 protein amino asit dizisini girin ve Bepipred Linear Epitop Prediction 2.0 yöntemini seçin ve son olarak Gönder'e tıklayın (Ek Dosya 1-Ek Şekil S9).
  2. ABCpred çevrimiçi aracının web sitesini açın (Malzeme Tablosu), yukarıda belirtilen Art v 1 protein amino asit dizisini, eşik olarak 0.51'i ve tahmin için kullanılacak pencere uzunluğu olarak 16'yı girin, çakışan filtre için AÇIK'ı seçin ve Gönder dizisine tıklayın (Ek Dosya 1-Ek Şekil S10).

6. Art v 1 proteininin Th hücre epitoplarının tahmini

  1. Art v 1 proteininin Th hücre epitopunu tahmin etmek için, IEDB Analiz Kaynağı çevrimiçi aracının (Malzeme Tablosu) web sitesini açın, MHC II Bağlama'ya tıklayın ve yukarıda belirtilen Art v 1 protein amino asit dizisini girin. Tahmin yöntemi olarak NetMHCllpan 4.1 EL'yi (önerilen epitop tahmincisi-2023.09), tür/lokus olarak İnsan'ı, HLA-DR olarak DRB1*01:01'i, uzunluk olarak alel, 15'i seçin, peptitleri Yüzdelik Sıraya göre sıralayın ve Gönder'e tıklayın (Ek Dosya 1-Ek Şekil S11).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protein10'un fizyokimyasal ve fonksiyonel karakterizasyonu için ExPASy'nin Prot Param Tool çevrimiçi yazılımı kullanıldı. Açık metin okuma çerçevesinin uzunluğu 624 bp idi, 132 amino asidi kodluyordu, toplam 1.837 atomlu proteinleri kodluyordu ve bağıl moleküler ağırlığı 13.404.26'ydı. Moleküler formül C584H903N157O181S12'dir, bunların ilk üç amino asidi prolin (Pro,% 15.9), alanin (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Artemisia, Çin'deki en önemli dış mekan alerjenlerinden biridir ve polen parçacıkları küçüktür, 19-25 μm çapındadır, rüzgarla kolayca dağılır ve büyük miktarlarda toz üretir. Ek olarak, hastaların alerjik semptomlarının şiddeti havadaki polen içeriği ile ilişkilidir5. Art v 1, pelin poleni alerjisinin dönüm noktası alerjeni olarak kabul edilir ve pelin alerjisi olan hastaların %95'inden fazlası Art v 1'e duyarlıdır. Çin'de, pel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ningxia Doğa Bilimleri Vakfı (2022AAC03601 ve 2023AAC02087) ve Ningxia Tıp Üniversitesi Araştırma Vakfı (XM2019052) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ABCpredIndraprastha Institute of Information Technology, Indiahttps://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html
DNAstar Protean softwareDNASTAR, Inc.Version 7.1
Expasy ProtParam ToolSIB Swiss Institute of Bioinformaticshttps://web.expasy.org/protparam/
GeneBankNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
IEDB Analysis ResourceNational Institute of Allergy and Infectious Diseaseshttp://www.iedb.org/
SignaIP-5.0 ServerDTU Health Techhttps://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
Swiss-Model online softwareBIOZENTRUMhttps://swissmodel.expasy.org/interactive
TMHMM ServerDTU Health TechVersion 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
UCLA - DOE LAB SAVESUS Department of Energy Office of ScienceVersion 6.0https://saves.mbi.ucla.edu/

Referanslar

  1. Liu, D., et al. Recombinant expression of allergen Art la 3.0101 and Art la 3.0102 of Artemisia lavandulaefolia pollen and characteristics of serum specific IgE reactivity. J Clin Dermatol. 49 (07), 398-402 (2020).
  2. Sun, X. Expression, purification and crystallization of Mugwort pollen allergy-associated MHC proteins [D]. , Wuhan Polytechnic University. (2016).
  3. Goodman, R. E., Breiteneder, H. The WHO/IUIS Allergen Nomenclature. Allergy. 74 (3), 429-431 (2019).
  4. Razzera, G., et al. Mapping the interactions between a major pollen allergen and human IgE antibodies. Structure. 18, 1011-1021 (2010).
  5. Zabel, M., et al. Art v 1 IgE epitopes of patients and humanized mice are conformational. J Allergy Clin Immunol. 150 (4), 920-930 (2022).
  6. Peng, G., Han, X. Research progress of specific immunotherapy in atopic dermatitis. J Clin Dermatol. 46 (08), 602-604 (2017).
  7. Gao, Z., et al. Artemisia pollen allergy in China: Component-resolved diagnosis reveals allergic asthma patients have significant multiple allergen sensitization. Allergy. 74, 284-293 (2019).
  8. Sun, P., et al. Bioinformatics resources and tools for conformational B-cell epitope prediction. Comput Math Methods Med. , 943636(2013).
  9. Aqel, A. An integrated multi-pronged reverse vaccinology and biophysical approaches for identification of potential vaccine candidates against Nipah virus. Saudi Pharm J. 31 (12), 101826(2023).
  10. Verma, N. K., Singh, B. Insight from the structural molecular model of cytidylate kinase from Mycobacterium tuberculosis. Bioinformation. 9 (13), 680-684 (2013).
  11. Peters, B., Nielsen, M., Sette, A. T Cell epitope predictions. Annu Rev Immunol. 38, 123-145 (2020).
  12. Andreatta, M., Nielsen, M. Bioinformatics tools for the prediction of T-cell epitopes. Methods Mol Biol. 1785, 269-281 (2018).
  13. Jahn-Schmid, B., et al. Antigen presentation of the immunodominant T-cell epitope of the major mugwort pollen allergen, Art v 1, is associated with the expression of HLA-DRB1 *01. J Allergy Clin Immunol. 115 (2), 399-404 (2005).
  14. Liu, D. Species identification and allergen analysis of Artemisia SPP in northern China [D]. , China Medical University. (2019).
  15. Li, T., Bu, G., Xi, G. Effects of heat treatment on the antigenicity, antigen epitopes, and structural properties of β-conglycinin. Food Chem. 346, 128962(2021).
  16. Li, Y., et al. Bioinformatic prediction of epitopes in the Emy162 antigen of Echinococcus multilocularis. Exp Ther Med. 6, 335-340 (2013).
  17. Qiao, R., et al. Main characteristics and prediction of T-cell epitopes of mite Derp1 protein. Chin J Biologicals. 34 (08), 969-973 (2021).
  18. Ramana, J., Mehla, K. Immunoinformatics and epitope prediction. Methods Mol Biol. 2131, 155-171 (2020).
  19. Ma, F., et al. Advance on prediction methods of B cell antigen epitope. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine. 43 (01), 63-67 (2016).
  20. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  21. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyoinformatikPelin Poleni AlerjeniArt V 1 ProteiniB H cre EpitoplarTh H cre EpitoplarAmino Asit DizisiFizikokimyasal zelliklerTransmembran B lgesikincil YapTersiyer YapTransmembran SarmalSinyal Peptit DizisiAntijenitenstabilite ndeksiY zey Eri ilebilirli i

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır