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요약

본 연구에서는 쑥 꽃가루 주요 알레르겐인 Art v 1 단백질의 물리화학적 특성, 2차 구조, B 및 T 헬퍼 세포 항원결정기를 예측하기 위한 생물정보학 상관분석을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하여 쑥 꽃가루 알레르기 질환 백신 및 질병 치료제의 후속 개발을 위한 이론적 기초를 제공합니다.

초록

쑥 꽃가루 알레르겐인 Art v 1 단백질의 염기서열 특성을 분석하고 이의 B 세포 및 Th (helper T cell) 세포 항원결정인자를 예측하기 위해 Genebank를 참조하여 Art v 1 단백질의 유전자 염기서열 및 아미노산 염기서열을 구하였다. ExPASy의 Prot Param, TMHMM, DNAstar Protean, Swiss-Model, UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 및 IEDB를 사용하여 단백질의 물리화학적 특성, 막관통 영역, 2차 구조, 3차 구조, B 세포 및 Th 세포 항원결정기를 분석하고 예측했습니다.

Art v 1 단백질은 132 개의 아미노산 잔기로 구성되며, 상대 분자량은 13404.26, 분자식 공식은 C584H903N157O181S12, pI 값은 7.49, 지질 용해도 지수는 41.59, 친수성 지수는 -0.454로 친수성 단백질로 간주됩니다. 불안정성 지수 (ii)는 78.11로 불안정한 단백질로 분류됩니다. 단백질의 N-말단은 5-27 아미노산 잔기 서열에 위치한 α-나선 막관통 영역을 가지고 있으며, 1-24 위치는 신호 펩타이드 서열입니다. 랜덤 코일, β턴, α나선 및 β시트가 있으며 친수성 영역, 유연한 영역 및 표면 접근성 영역 구조도 포함합니다.

3차 구조의 예측 결과는 2차 구조의 분석 결과와 일치합니다. 5개의 우성 B 세포 에피토프가 예측되었는데, Art v 1 71-87, Art v 1 33-49, Art v 1 104-120, Art v 1 95-111 및 Art v 1 86-102였다. 5개의 Th 세포 우성 항원결정기가 있었는데, Art v 1 2-16, Art v 1 3-17, Art v 1 4-18, Art v 1 5-19 및 Art v 1 6-20이었습니다. Art v 1 단백질은 B 세포 및 Th 세포 항원결정기의 존재로 인해 우수한 항원성을 가질 것으로 예측됩니다.

서문

쑥(Mugwort)은 쑥(Artemisia)의 속(屬)으로, 내몽골(Inner Mongolia), 간쑤(Gansu) 및 중국의 다른 지역에 널리 분포한다1. 쑥 꽃가루에 의해 유발되는 다양한 알레르기 질환은 일반적으로 아토피 환자가 꽃가루 알레르기 항원에 반복적으로 노출되고 생리 활성 매개체가 생성되어 발생하는 I형 알레르기로, 코 점막, 결막, 기관지의 카타르 염증 및 천식 발작을 유발합니다2. WHO/IUIS 알레르겐 명명법제3 위원회는 현재 쑥 알레르기 항원 7가지, 즉 Art v 1-Art v 6 및 Art AN 7을 공식적으로 인정했습니다. Art v 1 단백질은 쑥 꽃가루 알레르기의 주요 원인 중 하나입니다. 분자량은 24-28kDa이며 쑥 꽃가루에 알레르기가 있는 개인의 95%가 인식할 수 있습니다4. 이는 C-말단 프롤린이 풍부한 꼬리에 연결된 N-말단 베타 방어신과 같은 도메인으로 구성됩니다. 디펜신(Defensin)은 여러 진핵생물에서 발현되는 내인성 항균 폴리펩티드(endogenous antimicrobial polypeptide)를 나타낸다5.

현재 알레르기항원 면역요법(AIT)은 알레르기항원에 대한 노출을 피하는 것 외에도 알레르기 질환의 자연적 경과를 바꿀 수 있는 유일한 병인 치료법이다6. 최근 수십 년 동안 알레르기 질환의 유병률이 증가함에 따라 알레르기 항원 분자에 대한 기초 및 임상 연구의 중요성과 알레르기 진단 및 치료에 대한 잠재적 응용이 강조되고 있습니다. AIT에 사용되는 많은 알레르겐은 재조합 단백질에 속하며, 물리적, 화학적, 면역학적 특성은 알레르기 유발 물질이 감소된 알레르겐 백신 생산에 적합합니다. 따라서 AIT는 알레르기 백신이 저렴한 비용으로 비교적 쉽게 생산할 수 있기 때문에 알레르기 질환을 효과적으로 예방하고 치료하는 주요 수단으로 간주됩니다7. 그러나 과거의 백신 개발은 전적으로 분자 생물학과 면역학 실험에 의존했습니다. 또한 에피토프 식별은 백신 개발에 필수적이며 에피토프 식별을 위한 가장 신뢰할 수 있는 방법은 현재 X선 결정학 및 NMR 기술입니다. 그러나 시간과 비용이 많이 듭니다8. 따라서 저비용 및 고속의 장점을 가진 계산 방법과 도구가 에피토프를 예측하는 데 사용되었습니다.

본 논문은 쑥꽃가루 주요알레르겐인 Art v 1 단백질의 물리화학적 특성, 2차 구조, 3차 구조 및 B/Th 세포 항원결정인자를 예측하기 위한 생물정보학 상관관계 분석 방법을 설명한다. 이는 쑥, 꽃가루, 알레르기 질환 백신 및 질병 치료제의 후속 개발을 위한 이론적 기초를 제공할 것입니다.

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프로토콜

1. Art v 1 단백질의 물리화학적 성질

  1. GeneBank(Table of Materials)에 AF493943.1을 입력하여 Art v 1 단백질의 아미노산 서열을 얻습니다(보충 파일 1-보충 그림 S1).
    참고: Art v 1 단백질은 132개의 아미노산을 함유하고 있으며, 이는 624bp의 유전자 염기서열에 의해 암호화됩니다. 그것의 아미노산 서열(AAO24900.1)은 MAKCSYVFCAVLLIFIVAIGEMEAAGSKLCEKTSKTYSG입니다.
    KCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYF
    DCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSP패드그스프
    PPADGGSPPVDGGSPPPPSTH.
  2. Expasy ProtParam 도구(재료 표)를 시작하고 1.1단계에서 언급한 Art v 1 단백질 아미노산 염기서열을 입력합니다. Compute parameters(파라미터 계산) 버튼을 클릭하면 아미노산 조성, 원자 번호, 분자식, 상대 분자량, 양전하 및 음전하, 등전점 및 불안정성 지수가 표시됩니다(보충 파일 1-보충 그림 S2).
    참고: 불안정성 지수는 <40으로 단백질이 안정적임을 나타냅니다. > 값이 40이면 단백질이 불안정하다는 것을 의미합니다9.

2. Art v 1 단백질의 막관통 영역과 신호 펩타이드의 예측

  1. 위에서 언급한 Art v 1 단백질 아미노산 서열을 온라인 소프트웨어 TMHMM Server v.2.0(Table of Materials)에 입력합니다. Extensive(확장)를 선택하고 그래픽을 Output format(출력 형식)으로 사용하여 Submit(제출)을 클릭하여 멤브레인 구조를 표시하고, 막관통 단백질의 물리적 및 화학적 특성을 얻습니다(보충 파일 1-보충 그림 S3).
  2. 위에서 언급한 Art v 1 단백질 아미노산 염기서열을 SignaIP5.0 서버 온라인 도구(재료 표)에 입력합니다. Organism group으로 Eukarya를 선택하고 Output format으로 Long output을 선택한 다음 Submit을 클릭하고 이메일 주소를 입력하여 예측된 단백질 신호 펩타이드의 결과를 받습니다(보충 파일 1-보충 그림 S4).

3. Art v 1 단백질의 2차 구조 예측

  1. Art v 1 단백질의 친수성, 표면 접근성, 유연성 및 항원 지수를 분석하려면 GeneBank(Table of Materials)에 AF493943.1을 입력하고 protein id AAO24900.1 | 파스타. FASTA 시퀀스를 새 텍스트 파일에 복사하고 파일 유형을 FASTA로 수정합니다(보충 파일 1-보충 그림 5). 그런 다음 소프트웨어 DNAstar protean 모듈을 실행하고 FASTA 파일을 열어 Art v 1 단백질의 2 차 구조를 표시합니다 (보충 파일 1 - 보충 그림 S6).

4. Art v 1 단백질의 3차 구조 예측 및 형태 평가

  1. Art v 1 단백질의 3차 구조 모델을 예측하려면 위에서 언급한 Art v 1 단백질 아미노산 서열을 Swiss-Model 온라인 소프트웨어(Table of Materials)에 입력하고, 템플릿 검색을 클릭하고, 가장 유사한 단백질 2kpy.1.A 를 템플릿으로 선택하고, Build Models | 모델 01을 다운로드하고 PDB 형식 파일(보충 파일 1-보충 그림 S7)을 다운로드합니다.
  2. 4.1단계에서 표시된 상동 모델링 구조를 평가하려면 UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 온라인 소프트웨어(Table of Materials)를 열고 파일 선택을 클릭하여 4.1단계에서 PDB 형식 파일을 업로드합니다 . 프로그램 실행 | 프로첵 | 결과 | Ramachandran 플롯 (보충 파일 1-보충 그림 S8).

5. Art v 1 단백질의 B 세포 에피토프 예측

  1. Art v 1 단백질의 B 세포 에피토프를 예측하려면 IEDB 분석 리소스 온라인 도구(Table of Materials)의 웹사이트를 열고, 항원 서열 특성을 클릭하고, 위에서 언급한 Art v 1 단백질 아미노산 서열을 입력하고, Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 방법을 선택한 다음 마지막으로 Submit (Supplemental File 1-Supplemental Figure S9)을 클릭합니다.
  2. ABCpred 온라인 도구(Table of Materials)의 웹사이트를 열고, 위에서 언급한 Art v 1 단백질 아미노산 서열, 임계값으로 0.51, 예측에 사용할 창 길이로 16을 입력하고, 중첩 필터로 ON을 선택한 후 서열 제출(Supplemental File 1-Supplemental Figure S10)을 클릭합니다.

6. Art v 1 단백질의 Th 세포 항원결정기 예측

  1. Art v 1 단백질의 Th 세포 에피토프를 예측하려면 IEDB 분석 리소스 온라인 도구(Table of Materials)의 웹사이트를 열고 MHC II Binding을 클릭한 다음 위에서 언급한 Art v 1 단백질 아미노산 서열을 입력합니다. 예측 방법으로 NetMHCllpan 4.1 EL(권장 항원결정기 예측기-2023.09)을 선택하고, 종/자리로 Human을, HLA-DR로 DRB1*01:01을, 대립유전자를, 길이로 15를 선택하고, 백분위수 순위별로 펩타이드를 정렬하고, Submit(Supplemental File 1-Supplemental Figure S11)을 클릭합니다.

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결과

단백질10의 물리화학적 및 기능적 특성화를 위해 ExPASy의 Prot Param Tool 온라인 소프트웨어가 사용되었습니다. 열린 텍스트 판독 프레임의 길이는 624bp였으며, 132개의 아미노산을 암호화하고, 총 1,837개의 원자와 13,404.26의 상대 분자량을 가진 단백질을 암호화했습니다. 분자식은 C584H903N157O181S12이며, 그 중 상위 3 개 ?...

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토론

쑥은 중국에서 가장 중요한 실외 알레르겐 중 하나이며 꽃가루 입자는 직경이 19-25μm로 작아 바람에 쉽게 분산되고 많은 양의 분말을 생성합니다. 또한, 환자의 알레르기 증상의 중증도는 공기 중의 꽃가루 함량과 상관관계가 있다5. Art v 1은 쑥 꽃가루 알레르기의 대표적인 알레르기 항원으로 간주되며, 쑥 알레르기 환자의 95% 이상이 Art v 1에 민감합니다...

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공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 닝샤 자연과학재단(2022AAC03601 및 2023AAC02087)과 닝샤 의과대학 연구재단(XM2019052)의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ABCpredIndraprastha Institute of Information Technology, Indiahttps://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html
DNAstar Protean softwareDNASTAR, Inc.Version 7.1
Expasy ProtParam ToolSIB Swiss Institute of Bioinformaticshttps://web.expasy.org/protparam/
GeneBankNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
IEDB Analysis ResourceNational Institute of Allergy and Infectious Diseaseshttp://www.iedb.org/
SignaIP-5.0 ServerDTU Health Techhttps://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
Swiss-Model online softwareBIOZENTRUMhttps://swissmodel.expasy.org/interactive
TMHMM ServerDTU Health TechVersion 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
UCLA - DOE LAB SAVESUS Department of Energy Office of ScienceVersion 6.0https://saves.mbi.ucla.edu/

참고문헌

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