怀孕大鼠的游泳锻炼方案和护理方法

摘要

在这里，我们提出了一个方案来描述大鼠的繁殖方法、游泳训练程序和训练后怀孕大鼠的繁殖后护理方案。该方案提供了一个动物模型，用于研究怀孕期间母亲运动对后代的影响及其潜在机制。

摘要

健康和疾病的发展起源概念强调了早期环境对糖尿病、心血管疾病和癌症等慢性非传染性疾病的影响。使用动物模型的研究调查了营养不良、营养过剩、肥胖以及接触化学物质或缺氧等母体因素如何影响胎儿发育和后代健康，从而导致低出生体重、高血压、血脂异常和胰岛素抵抗等问题。鉴于育龄妇女超重和肥胖的患病率不断上升，有效的干预措施至关重要。孕期母亲运动已成为一项关键干预措施，对母亲和后代都有益处，并降低了患病风险。本研究比较了三种运动模式在怀孕大鼠身上的差异:自主轮式跑步、电动跑步机和游泳。游泳是最有益的选择，因为它的强度水平是安全和可控的。该协议详细介绍了大鼠繁殖方法、怀孕期间的游泳训练和繁殖后护理方案。该模型适用于各种大鼠和小鼠物种，可用于研究母体运动对后代健康和代际健康的益处。

引言

健康与疾病的发育起源 （DOHaD） 概念出现在过去二十年中，它表明早期发育过程中的环境影响会影响与慢性非传染性疾病 （NCD） 相关的后期病理生理过程的风险，尤其是糖尿病、心血管疾病和某些类型的癌症¹.在胎儿发育最具可塑性的阶段，后代暴露于宫内环境，基因和环境相互作用以及子宫胎盘灌注是胎儿重编程的关键因素²。以前的研究主要利用动物模型来调查对胎儿发育和后代长期表型影响的不利影响，例如孕产妇营养不良、营养过剩或肥胖，以及产前接触化学物质或缺氧³。这导致低出生体重和较晚的生长，并对后代产生不利影响，包括血压升高、血脂异常和胰岛素抵抗⁴。由于育龄妇女的超重和肥胖率正在迅速增加，因此迫切需要建立有效的干预措施来防止这些有害的孕产妇疾病的代际传播，这对人口健康有重要影响 ^5,6。

长期以来，运动一直被认为是 2 型糖尿病、高血压和其他几种疾病的重要预防疗法⁷。怀孕期间的运动对母亲有益，对后代有益，从而减少母体将疾病传播给后代⁸。几年的研究表明，运动的安全性和深远的好处，包括大幅减少常见的妊娠状况，如妊娠糖尿病 ^9,10。关于母体和胎儿的安全，进行运动训练和护理后方案具有挑战性。

David¹¹等人。描述了适用于心血管健康研究的动物运动模型。自愿轮式跑步、电动跑步机和游泳这三种常用的运动模式，各有优缺点。自主轮子紧密模仿大鼠的运动行为，使它们能够根据昼夜节律移动。然而，这种运动需要更精确地调节强度和持续时间。电动跑步机可以控制运动强度、运动量和持续时间，但有时需要电刺激，这可能会引发动物的身心压力。由于大鼠与生俱来的游泳能力，游泳在啮齿动物研究中被广泛使用，还可以避免对它们的脚和尾巴进行电刺激或机械损伤¹²。在对产前运动模型的研究中^13,14，^游泳是一种常用的运动方式。随着怀孕的进展和大鼠腹部的肿胀，跑步机和轮式跑步运动可能会导致腹部反复接触坚硬的表面。相比之下，游泳中的水环境提供浮力，降低了怀孕动物因运动而受伤的风险。

该方案介绍了大鼠的繁殖方法，如何在怀孕期间进行游泳训练，以及训练后怀孕大鼠的繁殖后护理方案。这种怀孕游泳训练模型可以应用于广泛的大鼠和小鼠物种，因此可能为未来使用基于动物的模型进行研究提供有用的啮齿动物模型，以研究调节母体运动对后代健康的有益影响的机制以及运动对几代人的好处。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得北京体育大学动物伦理委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院 （NIH） 指南和中国动物保护法律和机构指南进行实施。

1. 交配和喂养大鼠

1. 购买无特定病原体 （SPF） 等级的 10 周龄 Wistar 雌性大鼠和 11 周龄 Wistar 雄性大鼠。
2. 实施适应性喂养: 随意 喂养标准啮齿动物饮食 Wistar 大鼠，并在指定的饲养设施中提供一周的自来水。确保所有大鼠在 22 °C 的恒定温度和 45-55% 的湿度下进行 12 小时的光暗循环。
3. 检查雌性大鼠的发情期。
   1. 准备设备和材料，包括干净的玻璃显微镜载玻片、直径为 2 毫米的棉签、盐水溶液（0.9% NaCl）和显微镜。
   2. 用日期和大鼠标识标记每个显微镜载玻片。
   3. 下午 6 点到 7 点之间，为了尽量减少压力，轻轻地抑制雌性大鼠。用拇指和食指抓住尾巴的根部，同时用其他手指对大鼠的腰椎施加压力。
   4. 抬起尾巴的尖端，露出阴道。用生理盐水润湿棉签，然后将尖端放入阴道并轻轻滚动尖端以收集阴道分泌物。
   5. 将拭子尖端滚动在玻片上，避免再次涂抹到同一区域。
   6. 在显微镜下检查涂片，并使用低倍率物镜 （10x） 定位和观察细胞。
      注意:在发情期间，阴道分泌物有较大的上皮核消失，取而代之的是鳞状脱落的角质化上皮细胞，这些细胞堆积成一个丘。
   7. 记录每只大鼠的发情周期阶段。
4. 晚上 7 点到 8 点之间，将一只雄性和一只雌性大鼠放入交配笼中。
   注意:雌性大鼠需要处于发情前期或发情期才能交配。
5. 第二天，早上 7 点到 8 点之间，检查交配笼是否有交配塞。如果在交配笼的底部发现交配栓，请按照步骤 1.3.4-1.3.6 中描述的相同方法继续为雌性大鼠制作阴道分泌物涂片。
   注意:交配栓是由雄性大鼠精囊和前列腺分泌物与阴道分泌物结合而成的乳白色或淡黄色凝胶状物质。
6. 确认雌性大鼠怀孕:在交配笼中找到交配栓后，观察阴道分泌物涂片上的精子。将这一天指定为妊娠第 1 天 （GD1）。
7. 将怀孕的大鼠隔离在单独的笼子里。
   注意:在怀孕的初始阶段，必须防止怀孕的老鼠在其环境中遇到不熟悉的雄性化学线索或与不熟悉的雄性老鼠同居。
8. 大鼠妊娠期通常持续 21-23 天。测量并记录大鼠从 GD1 到 GD20 的体重。
9. 在 GD20 上，用干净的笼子替换怀孕的大鼠笼子，并在笼子中放置医用脱脂棉（大小与大鼠相似）。提供足够的水和食物供 7 天生存，并将笼子放置在安静的地方。
   注意:大鼠分娩后至少 1 周内不要更换笼子。换成干净的笼子时，将用过的脱脂棉从脏笼子转移到新的笼子里，以确保老鼠能够识别后代的气味。
10. 产后^第 21 天，按性别将后代分开，并将它们放入两个笼子中。
    注意:由于 21 日龄后代的体积较小，请将硬饲料颗粒放入笼内的玻璃培养皿中。

2. 产前游泳训练计划

1. 对所有实验雌性大鼠进行 5 天的适应训练。
   1. 准备一个至少 20 厘米高的透明塑料容器，并在 34 ± 1°C 的温度下装满 10 厘米的水。
   2. 抓住老鼠的尾巴尖并抬起它，然后将老鼠放入水中。
   3. 在 15 分钟的适应性训练期间，每 5 分钟密切监测一次水温，并加入温水以保持温度。
   4. 训练后，将大鼠转移到 34 ± 1°C 的清水中清洗其皮毛。然后，用毛巾将老鼠转移到笼子里，用吹风机吹干它的皮毛。
      注意:噪音和炎热的环境会给老鼠带来压力。因此，建议使用温度可调且安静的吹风机。
   5. 请将老鼠放回各自的笼子里。
2. 大鼠交配（按照步骤 1.3-1.6）。
3. 在步骤 1.7 之后，将怀孕的大鼠随机分配到久坐组 （SED） 和运动组 （EX）。
4. 每天在每次训练前给大鼠称重。
   注意:在适应性训练期间，大鼠的体重减轻不应超过 3 克/天。在产前训练期间，大鼠的体重应逐渐增加。如果大鼠每天丢失超过 3 克，则将每日训练时间减少 50% 以允许恢复。
5. 每周 6 天，早上 8:00 至 9:00 从 GD1 到 GD20 进行 EX 的产前游泳训练。
   1. 准备一个直径为 50 厘米、最小高度为 50 厘米的圆形水桶，并在 40 ± 34°C 的温度下装满 1 厘米的水。
   2. 从 GD1 到 GD5，最初每天进行 20 分钟的游泳训练，然后逐渐增加到每天 60 分钟。
   3. 从 GD6 到 GD20，每周 6 天，每天 60 分钟继续运动训练。
   4. 有关善后护理，请参阅步骤 2.1.4-2.1.5。
   5. 运动后，给 EX 大鼠 5 克啮齿动物葵花籽以提供营养支持。
6. 在每天的 EX 训练期间，将 SED 大鼠置于与适应性训练相同的水中（步骤 2.1.1）。让 SED 大鼠在 EX 大鼠在水中度过相同的时间。运动后，给 SED 大鼠 5 克啮齿动物葵花籽，为它们提供营养支持和舒缓情绪。
7. 每次游泳训练后，用紫外线清洁和消毒所有设备，包括水桶和毛巾。

3. 胎儿的身体特性

1. 在 GD20.5 的早晨，用 3% 异氟醚麻醉雌性大鼠，并在 CO₂ 室中对其进行安乐死。
2. 用手术刀在大鼠的下腹部做一个切口。确保切口向腹部两侧倾斜，确保子宫完全暴露。
3. 用镊子和剪刀小心地打开子宫，露出胎儿和胎盘。使用镊子轻轻分离胎儿周围的薄羊膜，以避免剪刀对胎儿和胎盘造成损伤。
4. 使用无菌纱布清洁胎儿的身体，以去除血液和粘液。按解剖位置依次分离胎儿和胎盘，然后称重。
5. 观察肛门和生殖器之间的距离，以确定胎儿的性别。雄性胎儿的距离比雌性胎儿长。记录胎儿的性别和数量以备将来参考。
6. 平躺时使用卡尺测量胎儿的长度。因为胎儿还活着，解剖后可能会蜷缩起来，所以要展开身体进行测量。
   注:为确保实验结果和测量方法的一致性，同一实验人员始终保持相同的标准。根据机构推荐的指南对胎儿实施安乐死，并根据需要收集组织样本进行进一步分析。

结果

在大鼠繁殖方法部分（图 1），我们通过制作阴道分泌物载玻片来确定雌性大鼠的发情周期，以提高繁殖的成功率。大鼠的发情周期持续 4-5 天，包括发情前期、发情期、发情期和发情期。metestrus 或 diestrus 中的雌性大鼠表现出与雄性保持距离等行为。同时，发情期的大鼠愿意交配，雌性大鼠的排卵多发生在发情末期。在发情前期，阴道涂片样本主要...

讨论

本研究旨在建立怀孕大鼠可行的锻炼计划，包括详细的大鼠交配方法、游泳训练方案和评估胎儿生理指标的研究方法。我们通过实践开发了一个产前游泳运动训练模型，并为方案中可能出现的潜在问题提供了相应的解决方案（表 1）。该协议将使其更加实用，并帮助研究人员建立产前运动模型。

我们的研究结果表明，使用我们设计的大鼠...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caliper	Mitutoyo Measuring Instruments (Shanghai) Co., Ltd	530-101 N15	Fetus dissect
Circular water bucket	Naliya	N/A	Rat swimming
Experimental Surgical Instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	SP0001-G	Fetus dissect
Glass Microscope Slides	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	80312-3161	Vaginal smear
Glass petri dish	Merck Life Technologies	BR455751-10EA	Offspring rearing
Hairdryer	Panasonic	EH-WNE5H	Post-swimming care
Information Card	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R510-22-10	Fetus dissect
Light microscope	Olympus	IX71-F22PH	Vaginal smear
Mating cage	Zhongke Life Science	SS3	Rat mating
Medical Absorbent Cotton	Hongxiang Sanitary Materials Co., LTD	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Rodent Anesthesia Machine, Gas Anesthesia	Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD	R500IE	Fetus dissect
Rodent breeding feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1032	Pregnant rat feeding
Rodent maintenance feed	Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD	1022	Offspring rearing
Rodent sunflower seeds	Jolly	JP241	Nutritional supplement
Soundproof cotton	Kufu Medical Instrument	N/A	The pregnant rats are anticipating giving birth
Sterile Cotton Swab (2 mm diameter)	Kufu Medical Instrument	N/A	Vaginal smear
Sterile gauze	Kufu Medical Instrument	N/A	Fetus dissect
Stroke-physiological Saline Solution (0.9% NaCl)	Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTD	N/A	Vaginal smear
Thermometer	Beekman organism	N/A	The monitoring of rat swimming
Towels	Grace	N/A	Post-swimming care
Transparent plastic container	Naliya	N/A	Swimming adaptive training
Ultraviolet light	Merck Life Technologies	Z169633-1EA	Post-swimming care
Water heater	Haier	EC6001-Q6S	Rat swimming
Weight Scale	Electronlc Acale	JM.A10001	Body weight measurement
Wistar Rats	Vital river Laboratory Animal Technology Co., LTD	N/A	Experiment